Study on Stability of Ceramides in Liquid Crystalline Emulsions at High Temperature

세라마이드의 액정에멀젼 내 고온 제형 안정성 연구

Abstract

We introduce to prepare liquid crystalline emulsion composed of cetearyl alcohol, cetyl palmitate, sorbitan palmitate, sorbitan olivate, ceramide and so on which can enforce interface between oil-based particle and water phase. In terms of structural analysis, the stability of the liquid crystalline emulsion including ceramide, which is immisible ingredient, at high temperature was proved by polarized microscope, cryo-SEM, small-angle x-ray scattering, in addition to viscometer and static light scattering by physical analysis.

본 연구는 세테아릴 알코올, 세틸 팔미테이트, 소르비탄 팔미테이트, 소르비탄 올리베이트, 세라마이드 등을 이용하여 제조한 액정에멀젼의 다층구조에 따른 강화된 계면막에 의해 제형의 안정성이 확보됨을 확인하였다. 편광 현미경을 통해 제형 내 몰타 크로스(maltese cross) 무늬를 확인하고, cryo-SEM을 이용하여 다층구조가 형성되었음을 확인하였다. 소각 X선 산란법(SAXS)을 이용하여 라멜라 구조 생성여부를 확인하였으며, 점도계를 이용하여 점도변화를 확인하고 정적 광 산란법(SLS)을 이용하여 입도 분포를 확인하여 액정에멀젼의 제형 안정성을 입증하였다.

1. 서론

세라마이드는 피부 각질층 지질 중 대부분을 차지하는 피부 필수 물질로, 외부 유해물질로부터 피부를 보호, 체내 중요 물질의 외부 유출을 방지하여 염증을 억제하고, 수분증발을 방지하는 피부 장벽기능의 강화 역할을 한다[1-3]. 이러한 이유로 현재 유효성분을 내상에 환입하여 투입이 필요한 곳에 전달하는 약물전달시스템(drug delivery system, DDS)을 이용해 아토피 등 피부 질환 예방, 피부장벽 회복에 연구되고 있다[4]. 하지만 세라마이드는 지방산과 스핑고이드 염기의 아실화반응으로 제조되어 복잡한 구조를 갖는 난용성 물질로, 화장품제형에 사용 시 제형 안정도가 떨어져 겔화가 발생하는 문제가 있다. 이에 세라마이드의 제형 내 안정화를 위한 다양한 제형 연구가 진행되고 있다. 그 예로 나노에멀젼의 형태로 제조하는 방법, 나노형태로 세라마이드를 제조, 캡슐화하는 방법, 에멀젼에 환입하는 방법 등이 있으나, 세라마이드 허용함량이 낮고, 제조 공정이 복잡하며, 안정성이 떨어지는 등 단점이 있다[5-8].

본 연구에서는 다층구조에 의해 세라마이드의 환입이 용이하고, 피부에 효과적으로 전달 가능한 액정에멀젼(liquid crystal emulsion)을 제조하고, X선 산란법 및 레이저 산란법을 이용하여 제형 내 세라마이드의 안정성 연구를 제시하고자 한다. 레이저 산란법은 묽게 희석한 시료에 레이저 빔을 조사하여 입자가 빛을 산란시키게 되고, 이로 인해 발생되는 파장신호의 변화로 입자 크기를 분석한다. 크게 동적 광 산란법(dynamic light scattering, DLS) 정적 광 산란법(static light scattering, SLS)로 나눌 수 있는데, 동적 광산란법은 움직이는 입자에 조사된 빛이 초기의 빛의 주파수와 달라지게 되고 시간에 따른 산란광의 분포를 측정하여 병진확산계수, 유체역학적 입자의 크기와 입자분포를 얻는 방법으로 불규칙한 브라운 운동(brownian motion)에 따라 결정되어 비교적 작은 사이즈의 입도를 측정하는데 이용하는 반면, 정적 광 산란법은 산란되는 빛의 강도를 입자의 농도, 온도 등의 함수로 측정하여 입자분포를 얻는 방법으로 입사광 파장에 따라 Rayleigh scattering, Lorenz-Mie theory, Fraunhofer diffraction 등 이론이 이용된다[9-11]. 본 연구에서는 레이저 산란법 중 정적 광 산란법을 이용한 제형 안정성 결과를 소개하고자 한다.

2. 재료 및 실험방법

2.1. 기기 및 시약

세라마이드를 함유한 액정에멀젼의 제조에 사용한 시약을 Table 1에 정리하였다. 원료는 각 생산업체로부터 받아 그대로 사용하였다. 세라마이드를 함유한 액정 에멀젼 제조에는 T.K homomixer (Mark II model 2.5, Primix, Japan)을 사용하였고, 편광현미경 측정에는 Polarizing Microscope (BX53T-32F01, Olympus, Japan)을 사용하였다.

Table 1. Materials for Experiments

세라마이드를 함유한 액정 에멀젼 제조에는 T.K homomixer (Mark Ⅱ model 2.5, Primix, Japan)을 사용하였고, 편광현미경 측정에는 Polarizing Microscope (BX53T-32F01, Olympus, Japan)을 사용하였다. 동결건조 주사현미경은 Cryo-SEM (Quanta 3D FIB, FEI, The Netherlands)를 사용하였으며, 액정에 멀젼의 구조 분석에는 포항가속기 연구소에서 4C 소각 및 광 각 X선 산란법을 이용하였다. 점도 분석에는 Viscometer (DV2T-LV, Brookfield, Canada), 입자크기 분석에는 SLS (LA-960, Horiba, Japan)을 사용하였다.

2.2. 세라마이드를 함유한 액정에멀젼의 제조

세라마이드를 함유한 액정에멀젼은 Table 2의 조성을 사용하여 하기와 같은 방법으로 제조하였다.

Table 2. Formulation of Emulsions

2.2.1. 일반에멀젼 제조방법

수용성인 A상을 70∼80 °C로 가열하여 완전 용해한 후 유용성인 B상을 80∼85 °C로 용해하여 A상에 투입하고 5,000 rpm의 속도로 3 min 동안 유화시켰다. 그 후 보존제인 C상을 투입하여 5,000 rpm의 속도로 3 min 동안 교반하고 30 °C로 서서히 냉각 후 제형을 얻었다.

2.2.2. 액정에멀젼 제조방법

수용성인 A상을 70∼80 °C로 가열하여 완전 용해한 후 유용성인 B상을 80∼85 °C로 용해하여 A상에 투입하고 5,000 rpm의 속도로 3 min 동안 유화시켰다. 그 후 보존제인 C상을 투입하여 5,000 rpm의 속도로 3 min 동안 교반하고 30 °C로 급속히 냉각 후 제형을 얻었다. 세라마이드는 난용성 피부성분으로 액정에멀젼 내 1% 이내로 함유시 안정화 가능하여 1%를 기준으로 제조하였다.

2.3. 편광현미경 관찰

액정구조의 생성여부 확인을 위하여 편광현미경 관찰을 진행하였다. 상기 제조한 액정에멀젼의 제조 직후, 4주 45 °C 보관 후 200배율로 관찰하였다. 에멀젼을 소량 취하여 슬라이드 글라스에 로딩한 후 커버 글라스를 덮어 샘플을 제조하고 액정구조의 생성여부를 확인하였다.

2.4. 동결건조 주사전자현미경(Cryo-SEM) 분석

상기 제조한 액정에멀젼의 액정구조 확인을 위하여 cryo-SEM으로 분석하였다. 시료를 소량 취하여 –190 °C에서 동결한 후 동일 온도에서 진공하에 5일 간 건조시켰다. 커터를 이용하여 얇게 잘라낸 다음 10 mA에서 120 s 간격으로 Pt 코팅하여 2 kV에서 관찰하였다.

2.5. 소각 X선 산란(SAXS) 분석

액정에멀젼의 라멜라 구조 등의 거시적 구조 확인을 위하여 소각 X선 산란 분석을 실시하였다. 3 GeV의 에너지를 가진 광원을 이용하여 상온에서 진행되었고, PLS II 저장링의 In-Vacuum Undulator 20(IVU20, 길이: 1.4 m, 주기: 20 mm)으로부터 오는 광은 로듐으로 코팅된 거울에 모이며 Si (111) Double Crystal Monochromator (DCM)에 의해 단색화되어 0.734 Å의 파장을 갖는 빔을 만든다. 샘플과 검출기 사이의 거리는 4 m 조건이며, \(산란벡터(q={{4\pi\cdot\sin\theta}\over\lambda})\)는 0.3 nm^-1 < q < 6.85 nm^-1이다. 2θ는 산란각, λ는 X선 파장 값이고 산란각은 실버베헤네이트로 검정하였으며, 각 시료는 반원 방향으로 평준화하고 polyamide 필름사이에 로딩하여 약 30 s 동안 측정하였다

2.6. 점도(Viscosity) 분석

세라마이드를 함유한 액정에멀젼의 고온 안정성 확인을 위하여 제조 직후 및 45 °C 4주 보관후 점도를 측정하였다. 점도계의 회전심봉(spindle)이 에멀젼을 접촉한 상태로 회전하면서 회전속도에 따른 점성도를 측정하는 원리이며, 200 mL이상의 시료를 64번 회전심봉(spindle)을 이용하여 15 rpm의 속도로 실온에서 2 min 동안 측정하였다.

2.7. 정적 광 산란 입도(SLS) 분석

세라마이드를 함유한 액정에멀젼의 고온 안정성 확인을 위하여 입도분석을 실시하였다. 광원은 405 nm 및 650 nm를 사용하였고, 증류수의 굴절율 값을 적용하였으며, 시료는 증류수에 1:2로 초음파 조건하에 5분간 분산하여 투과도 80∼95% 조건하에 1 min 동안 실온 측정하였다. 각 평균 입자크기는 다음과 같은 식을 이용하여 측정하였다.

\(평균 입자크기 = \sum{q}(J)\times{X(J)} \div{\sum{q(J)}}\)

(J: Particle diameter devision number, q(J): Frequency distribution value (%), X(J): Jth particle diameter range’s sample diameter (μm))

3. 결과 및 고찰

3.1. 세라마이드를 함유한 액정에멀젼의 고온안정성 구조적 분석

3.1.1. 편광현미경 분석

제조한 액정에멀젼의 액정구조 생성여부 및 안정성 확인을 위하여 편광현미경 관찰을 진행하였다. 편광현미경은액정에멀젼의 이방성(anistropic) 특징을 관찰하는 것으로 몰타 십자(maltase cross)라는 무늬를 통해 확인할 수 있다[12,13]. Figure 1에서와 같이 제조 직후 및 45 °C 4주 보관 후에 편광현미경을 관찰하였다. 제조 직후 및 45 °C 보관 후의 시료 모두 편광 현미경하에 몰타 십자 무늬를 보여 표면의 지질의 배향이 이방성을 띠는 것을 확인하여 제형의 안정성이 확보되었음을 알 수 있다.

Figure 1. (a) Polarized microscope image of liquid crystalline emulsion immediately after preparation and (b) Polarized microscope image of liquid crystalline emulsion after 4 weeks under 45 ℃ (X 200).

3.2.2. Cryo-SEM 분석

액정에멀젼의 다층구조 생성여부 확인을 위하여 cryo-SEM을 통해 에멀젼의 단면 관찰을 진행하였다. 제조 직후와 45 °C 4주 보관 후 변화가 거의 없는 것으로 보아 제형이 안정함을 확인할 수 있다.

 

Figure 2. (a) Cryo-SEM image of liquid crystalline emulsion immediately after preparation and (b) Cryo-SEM image of liquid crystalline emulsion after 4 weeks under 45 ℃.

3.2.3. SAXS 분석

액정에멀젼의 제조 직후, 45 °C 4주 보관 후의 다층구조를 보다 상세하게 분석하기 위하여 소각 X선 산란법을 이용한 결과를 Figure 3에 나타내었다. 제조한 액정에멀젼은 x축값인 q 값이 제조 직후 0.0332 Å^-1, 0.0664 Å^-1, 0.0996 Å^-1으로 1 : 2 : 3의 비로 나타났으며, Bragg spacing ratio에 따르면 소각 X선 산란 피크의 비율이 1 : 2 : 3으로 나타날 때, 라멜라 구조\(1:\sqrt{2}:\sqrt{3}\)은 큐빅 구조, ,\(1:\sqrt{3}:2\)는 헥사고날 구조이므로 본 연구에서 제조한 액정에멀젼은 라멜라 구조임을 알 수 있다.[12] 첫 번째 피크값인 q1을 식 d = 2π/q에 대입하면 라멜라의 층간 거리를 구할 수 있는데, 18.92 nm로 피부와 매우 유사한 구조(5-25 nm)임을 알 수 있다. 마찬가지로 45 °C 4주 보관 후 0.0278 Å^-1, 0.0556 Å^-1, 0.0834 Å^-1으로 제조 직후와 같은 1 : 2 : 3의 비를 가지며, 22.60 nm의 층간 거리를 갖는 것으로 나타났다. 이를 통해 세라마이드를 함유한 액정에멀젼이 라멜라 구조를 유지하는 것으로 나타나 안정하게 존재한다는 것을 확인하였다.

Figure 3. (a) SAXS of a liquid crystalline emulsion immediately after preparation and (b) SAXS of liquid crystalline emulsion after 4 weeks under 45 ℃.

3.3. 세라마이드를 함유한 액정에멀젼의 고온안정성 물리적 분석

3.3.1. 점도(Viscosity) 분석

점도는 고온 또는 실온, 일광 등 외부 환경에 따라 변화하는 제형의 안정성을 판단하는데 활용할 수 있다. 점도는 유체의 흐름 저항을 나타내며 유체 내의 내부 마찰과 연관이 있는 특성으로 전단속도에 대한 전단응력의 비로 나타낼 수 있다.

\(\eta = {F\prime\over S}\)

Table 3은 세라마이드를 함유한 액정에멀젼과 일반에멀젼의 제조 직후, 45 °C 1주 후, 45 °C 4주 후 점도 변화를 관찰한 결과이다. 액정에멀젼의 경우, 점도 변화가 3% 이내로 매우 안정하였으며, 일반에멀젼의 경우, 점도 변화가 21% 수준으로 변동이 컸다. 액정에멀젼의 유-수상 경계면이 강화되어 고온에서 안정한 형태로 존재함을 알 수 있다.

Table 3. Viscosity of a Liquid Crystalline and a Conventional O/W Emulsion

3.3.2. 정적 광 산란 입도(SLS) 분석

정적 광 산란법은 단일광을 시료에 조사하면, 산란각도에 따른 산란된 빛의 세기를 함수로 측정하고, 시료의 분자량, 크기 등 열역학적 성질을 측정할 수 있다. 이는 Lorenz-Mie 이론에 근거하여 이용되는데, 입자의 크기와 입사광 파장이 유사할 때 적용한다[9]. 정적 광 산란법에 대한 대략적인 모식도를 Figure 4에 나타내었다.

Figure 4. Principle of static light scattering analysis.

이를 이용하여 세라마이드를 함유한 제형의 고온 안정성 비교를 위해 투과율 80∼95% 범위에서 입도 분포를 측정하고 Figure 5 및 Figure 6에 나타내었다.

\(일반에멀젼\ 입도\ 변화율(\%)={{17.53440-12.93189}\over 12.93189}\times100=35.6\%\)

\(액정에멀젼\ 입도\ 변화율(\%)={{13.03608-12.09813}\over 12.93189}\times100=7.75\%\)

Figure 5. Particle size distribution of a conventional O/W emulsion.

Figure 6. Particle size distribution of a liquid crystalline emulsion.

일반에멀젼의 제조 직후 투과율 87.6%일 때, 평균 입도분포는 12.93189 μm로 나타났고, 45 °C 4주 보관 후 투과율 86.8%일 때, 평균 입도분포가 17.53440 μm로 나타나 고온 4주 입도 변화율이 35.6%로 제형 안정성이 매우 낮은 결과가 나타났다. 반면, 액정에멀젼의 경우 제조 직후 투과율이 87.6%일 때, 평균 입도분포 12.09813 μm로 나타났고, 45 °C 4주 보관 후 투과율이 84.1%일 때, 평균 입도분포가 13.03608 μm로 나타나 고온 4주 입도 변화율이 7.75%로 제형 안정성이 뛰어난 결과가 확인되었다. 이는 액정에멀젼의 유-수상 간 계면막이 강화됨에 따라 고온에서 부피팽창이 억제되어 입자크기 변화가 적으므로 제형 안정성이 향상되는 것으로 해석된다.

4. 결론

본 연구에서는 세라마이드를 함유한 액정에멀젼의 고온 안정성 확인을 위하여 편광현미경, 동결건조 주사전자현미경, 소각 X선 산란분석을 통해 세라마이드의 제형 내 구조적 안정성을 확인하였고, 점도 및 정적 광 산란분석을 통해 세라마이드의 제형 내 물리적 안정성을 확인하였다.

1) 세라마이드를 함유한 액정에멀젼의 제조 직후 및 45 °C 4주 후 편광현미경 관찰 결과 광학적 이방성에 의해 몰타 십자 무늬가 깨지지 않는 것을 확인하였으며, 이를 통해 고온에서 액정에멀젼의 다층 구조가 유지되고 있음을 확인하였고, 동결건조 주사현미경(cryo-SEM)을 이용하여 액정에멀젼의 다층구조를 확인하였다.

2) 소각 X선 산란분석을 통해 고온 보관 후에도 q값의 비가 1:2:3을 나타내어 라멜라 구조를 유지하고 있음을 확인하였다.

3) 점도계측을 통해 세라마이드를 함유한 액정에멀젼과 일반에멀젼의 상온 점도변화율을 계산한 결과, 액정에멀젼은 3%이내, 일반에멀젼은 약 21%의 점도변화율을 나타내어 일반에멀젼 내에서의 세라마이드 안정성이 떨어지고, 액정에멀젼의 고온 안정성을 확인하였고, 정적 광 산란법을 이용하여 입도분포를 분석한 결과, 액정에멀젼의 평균 입도 변화율이 7.75%, 일반에멀젼의 평균 입도 변화율이 35.6%로 액정에멀젼의 평균 입도 변화율이 낮아 안정한 것으로 확인되었다.

세라마이드의 제형 내 구조적, 물리적 안정성 확인을 위하여 소각 X선 산란, 정적 광 산란법을 이용하였다. 향후 이러한 산란법을 통하여 제형의 안정성 평가에 정량적, 정성적 분석이 가능할 것으로 기대된다.