• 미생물학회지
• /
• 제32권2호
• /
• pp.102-108
• /
• 1994

ABF1(Autonomously replicating sequence Binding Factor 1)은 효모 genome에서 $RTCRYN_5ACG$의 염기 서열을 가지고 있는 promoter, mating-type silencer, ARS에 결합하는 DNA binding 단백질이다. E. coli 에서 ABF1 유전자를 발현하기 위하여, ABF1 유전자를 pMAL-c2 벡터에 cloning하였다.(pMAHW). pMAHW를 E. coli에 형질전환하여, ABF1 융합단백질을 발현시키고, amylose resin affinity chromatography에 의하여 분리하였다. Factor Xa protease를 이용하여 분리된 융합단백질로부터 maltose binding protein을 잘라낸 후에 gel retardation analysis 방법으로 분리된 ABF1이 ARS1에 결합하는 능력을 지니고 있음을 확인하였다. DNA 결합에 관련된 부위를 찾기 위하여, 비전형적인 zinc finger motif가 위치하는 자리에서 pMAHW의 ABF1 유전자에 His-61을 다른 아미노산으로 치환하였다. DNA binding 부위로 추정되는 ABF1 단백질의 중간지역에 Leu-353, Leu-360를 다른 아미노산으로 치환하였다. Site-specific mutagenesis 를 통해 만들어진 mutant를 gel retardation analysis와 complementation test를 통해서 비전형적인 zinc finger motif이외에 다른 DNA binding motif가 있는 것을 알 수 있었다.

• 생명과학회지
• /
• 제23권2호
• /
• pp.290-298
• /
• 2013

Mycobacterium 속은 Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium leprae, Mycobacterium bovis와 같은 동물과 인체에 병원성을 나타내는 세균 종을 다수 포함하고 있다. 이들의 숙주에서의 생존과 병원성에 관한 유전학적 정보를 확보하는 것은 매우 중요하지만, 효과적인 유전학적 도구가 부족하였기 때문에 이들에 관한 연구가 미비하였다. 따라서 mycobacteria의 연구를 위한 분자생물학적 실험 도구로서 다양한 기능성 vector들이 고안되었고, 이러한 기능성 vector의 개발은 실질적으로 mycobacteria에서의 연구 효과를 증진시켰다. 본 연구에서는 Mycobacterium smegmatis에 적용 가능하고 기존에 제시되었던 mycobacteria 연구에 있어서의 한계점을 극복하기 위한 노력의 일환으로, 기능성 vector인 temperature-sensitive replication origin (TSRO)과 counterselectable marker로 levansucrase를 암호화하는 sacB 유전자를 포함하는 suicide vector pKOTs, chromosomal DNA로 site-specific recombination을 통해 삽입되는 lacZ transcriptional fusion vector pMV306lacZ, 그리고 TSRO를 가지는 minitransposon vector pTnMod-OKmTs를 개발하였다. 이 vector들은 실질적으로 M. smegmatis에서 효과적으로 작동하는 것이 확인되었으며 목적으로 하는 실험 결과 도출 가능성 또한 보여주었다. 따라서 이들 vector는 앞으로의 mycobacteria에 대한 효과적인 연구 기반이 될 것으로 기대된다.

• Journal of Dairy Science and Biotechnology
• /
• 제36권4호
• /
• pp.208-219
• /
• 2018

낙농업 및 유가공 제품의 생산과 유통에서 살모넬라 감염에 의한 살모넬라증의 발생은 빈번하며, 이 세균의 항미생물 제제에 대한 내성 증가 현상 또한 지속되고 있어 새로운 항미생물 제제의 수요는 감소하지 않는다. 세균막의 훼손은 세균 생존을 쉽게 위협할 수 있기 때문에 개발되는 항미생물 제제들은 주로 세균의 막을 표적으로 삼지만, 개발되는 제제들이 실제로 세균막의 훼손을 초래하는지 구별하는 것은 많은 노력과 비용을 수반한다. 본 연구에서는 E. coli 세포막 스트레스에 의해 발현이 유도되고, 세균막 외부공간에서만 위치하며, 그 구조상 많은 단백질의 구조 안정화에 기여할 것으로 예상되는 chaperone 단백질 Spy(spheroplast protein Y)의 유전자에 상응하는 살모넬라 spy 유전자에 gfp(green fluorescence protein) 오페론 융합체를 제조하여, 이 융합체가 Salmonella enterica의 두 혈청형 Enteritidis와 Gallinarum의 세포막 스트레스를 인지하여 GFP 발현량이 크게 증가하는 것을 확인하였다. 또한 세균막 스트레스 신호를 특이적으로 인지하는 이인자 신호전달 체계(two component signal transduction system)인 Bae와 Cpx들이 두 살모넬라 혈청형의 spy 유전자 전사 유도에 필수적임을 확인하였다. 따라서 본 연구에서 사용한 spy-gfp 오페론 융합체는 S. Enteritidis와 S. Gallinarum의 세포막 훼손을 특이적이고 신속하게 인식하는 biosensor로서 활용될 수 있을 것으로 판단된다.

• Journal of Microbiology and Biotechnology
• /
• 제31권11호
• /
• pp.1583-1590
• /
• 2021

Studies have demonstrated that PE_PGRS45 is constitutively expressed under various environmental conditions (such as nutrient depletion, hypoxia, and low pH) of the in vitro growth conditions examined, indicating that PE_PGRS45 protein is critical to the basic functions of Mycobacterium tuberculosis. However, there are few reports about the biochemical function and pathogenic mechanism of PE_PGRS45 protein. The fact that this M. tuberculosis gene is not easily expressed in E. coli may be mainly due to the high content of G+C and the use of unique codons. Fusion tags are indispensable tools used to improve the soluble expression of recombinant proteins and accelerate the characterization of protein structure and function. In the present study, His6, Trx, and His6-MBP were used as fusion tags, but only MBP-PE_PGRS45 was expressed solubly. The purification using His6-MBP tag-specific binding to the Ni column was easy to separate after the tag cleavage. We used the purified PE_PGRS45 to immunize New Zealand rabbits and obtained anti-PE_PGRS45 serum. We found that the titer of polyclonal antibodies against PE_PGR45 was higher than 1:256000. The result shows that purified PE_PGRS45 can induce New Zealand rabbits to produce high-titer antibodies. In conclusion, the recombinant protein PE_PGRS45 was successfully expressed in E. coli and specific antiserum was prepared, which will be followed by further evaluation of these specific antigens to develop highly sensitive and specific diagnostic tests for tuberculosis.

• 한국수정란이식학회지
• /
• 제31권3호
• /
• pp.281-285
• /
• 2016

Cluster-of-differentiation antigen 9 (CD9) gene expressed in the male germ line stem cells is crucial for sperm-egg fusion, and was therefore selected as a candidate gene to investigate Duroc boar semen motility and kinematic characteristics. This study was performed to investigatetheir association with semen motility and kinematic characteristics. DNA samples from 96 Duroc pigs with records of sperm motility and kinematic characteristics [Total motile spermatozoa (MOT, $82.27{\pm}5.58$), Curvilinear velocity(VCL, $68.37{\pm}14.58$), Straight-line velocity(VSL, $29.06{\pm}6.58$), the ratio between VSL and VCL(LIN, $47.36{\pm}8.42$), Amplitude of Lateral Head displacement(ALH, $2.88{\pm}0.70$)] were used in present study. A single nucleotide polymorphism (g.358A>T) in intron 6 was associated with MOT, VCL, VAP and ALH in Duroc population (p<0.05). Therefore, we suggest that the porcine CD9 may be used as a molecular marker for Duroc boar semen quality, although its functional effect was not clear yet. These results will improve the understanding of the functions of the CD9 in spermatogenesis within the reproductive tracts, and will shed light on CD9 as a candidate gene in the selection of good sperm quality boars.

• 한국미생물·생명공학회지
• /
• 제39권2호
• /
• pp.111-118
• /
• 2011

교배와 원형질체 융합을 통한 배수체인 야생형 산업균주의 개발을 위하여, hybrid의 선별표지로서 우성의 선별표지인 aureobasidin A 내성이 사용될 수 있는 지를 알아보고자 하였다. 선별배지에서 aureobasidin A의 최적농도는 야생형 균주인 경우 SD와 YPD 배지에서는 0.5 ${\mu}g$/mL 이상이었고, SG와 YPG에서는 0.2-0.3 ${\mu}g$/mL 이었다. 한편 호흡결여돌연변이주는 야생형 균주보다 훨씬 높은 농도의 aureobasidin A에도 내성이 있음을 나타내었다. 우리는 K114/YIP균주의 전분분해 능력이 배수체 야생형 산업 균주에 전달 될 수 있는지를 이 방법을 통하여 관찰하였다. 반수체 영양요구성 균주 K114/YIP에 aureobasidin에 대한 내성을 부여하는 pAUR112가 도입된 균주와 야생형 균주 KL 혹은 C6와의 rare-mating 후 aureobasidin A 함유 배지에서 성장한 hybrid를 분리할 수 있었다. Hybrid는 전분분해 능력을 함유하고 있었을 뿐 아니라 두 양친의 특성을 동시에 지녔으며, 전자현미경 관찰 결과에서도 hybrid는 양친주의 특성을 모두 갖는 것으로 나타났다.

• 미생물학회지
• /
• 제45권3호
• /
• pp.233-238
• /
• 2009

Corynebacterium ammoniagenes의 purF 유전자의 발현을 purF의 프로모터 추정 부위에 cat 유전자를 융합시킨 transcriptional fusion 플라스미드를 제작하여 분석하였다. 유전자 purF는 adenine과 guanine에 의해 20~30%의 전사 저해효과를 나타내지만, hypoxanthine에는 저해를 받지 않는 것으로 나타났다. 또한 purF의 발현은 대수기중반에 최대에 달한 후 정체기 후반부까지 일정한 것으로 나타났다. 동시에, C. glutamicum에서 사용되는 강력한 프로모터인 $P_{180}$이 Escherichia coli의 $P_{tac}$보다 C. ammoniagenes에서 모든 성장 단계에서 40~50%의 향상된 프로모터 활성을 나타내었고 대수기 후반부에 최고 활성에 달해, C. ammoniagenes의 연구에도 활용 가능함을 확인하였다. DNA-affinity purification에 의해 C. ammoniagenes의 purF 프로모터에 결합하는 단백질로서 C. glutamicum의 Crp-family transcriptional regulator (NCgl0120)와 상동성이 높은 단백질을 검출하였다. 이 단백질은 크기가 40.1 kDa으로서 PAGE에서 관찰된 단백질 크기와 일치하였다. 이에 상응하는 C. ammoniagenes의 단백질은 400개의 아미노산으로 구성되어 있고, 42 kDa의 단백질을 만들며, pI는 4.9일 것으로 추정되었다. 이는 기존에 알려져 있는 E. coli 및 Bacillus subtilis의 PurR과 각각 14.1%, 15.8%의 아미노산 상동성을 보여, PurR과는 다른 종류의 단백질일 것으로 여겨진다.

• 생명과학회지
• /
• 제25권5호
• /
• pp.507-514
• /
• 2015

D-Xylulose는 nonoxidative pentose phosphate 경로를 통해 glycolysis 과정으로 들어가기 전에 D-xylulose kinase에 의해서 D-xylulose-5-phosphate로 인산화 된다. K. gwangalliensis strain SJ2로부터 D-xylulose kinase (XK)를 암호화하는 유전자는 E. coli를 이용하여 서열분석 및 발현 하였으며, XK 유전자의 염기서열 1,419 bp로 구성되어 있으며 463개의 아미노산 잔기를 암호화하고 있다. 분석결과를 통해 XK 유전자가 진화과정 동안 잘 보존되었음을 보여 주었다. XK 유전자의 발현을 위해 pCold-II 발현 벡터에 클로닝 하였으며 클로닝 된 플라스미드는 E. coli strain BL21 (DE3)에 형질전환 하여 IPTG를 이용해 발현을 유도하였다. 재조합 된 XK 단백질의 크기는 약 48 kDa이었다. 이 발현된 단백질은 affinity chromatography를 이용하여 정제하였으며 D-xylulose kinase에 따른 enzymatic activity를 분석하였다. D-xylulose와 ATP로 실행한 XK enzyme kinetic 연구는 각각 250±20 μM과 1,300±50 μM의 Km value를 보였다. 본 연구를 통해 얻어진 결과는 분자적 수준에서 D-xylulose kinase의 특성연구의 보다 넓은 지식적 기초를 제공할 것으로 사료된다.

• KSBB Journal
• /
• 제17권4호
• /
• pp.370-375
• /
• 2002

새로운 유전자를 클로닝하고 그 발현양상을 결정하는 것은 유전자의 기능을 이해하는데 필수적이다. 인간유전자 12q13의 고해상 물리지도를 작성하면서 이 지역의 D12S359와 D12S1618 사이에 내재하는 것으로 mapping된 stSG 3435 EST의 유전자를 클로닝하고 그 발현양상을 조사하였다. NIBI library를 조사하여 stSG 3435를 포함하는 클론 325E4를 분리하여 순차적 결실 방법으로 클로닝하여 자동염기서열분석으로 염기서열을 결정하였다. 1,331 bp의 염기서열을 가진 이 유전자는 Blast search에 의하면 376 개의 아미노산으로 이루어진 단백질로써 인간의 MYGI과 동일하며 마우스의Gamml, melanocyte proliferation gene 1과 86%의 동질성을 보였다. MYGI은 인간염색체의 12에 내재하며 마우스의 Gamml은 syntenic 부위인 마우스 염색체 15에 내재하므로 마우스의 Gamml의 homolog으로 간주된다. Northern blot analysis 결과 MYG1은 인간의 모든 조직에서 발현되며 정소에서 가장 강한 발현을 보였다. 이 유전자의 세포내 발현을 green fluorescence protein과 융합시켜 발현 귀착지를 confocal 현미경으로 동정한 결과 MYG1 단백질은 핵과 리소좀을 제외한 소기관에서 발현되는 것을 관찰하였다.

• Molecules and Cells
• /
• 제27권4호
• /
• pp.467-473
• /
• 2009

Our previous study suggested that OsBWMK1, a gene which encodes a member of the rice MAP kinase family, generates transcript variants which show distinct expression patterns in response to environmental stresses. The transcript variants are generated by alternative splicing and by use of alternative promoters. To test whether the two alternative promoters, pOsBWMK1L (promoter for the OsBWMK1L splice variant) and pOsBWMK1S (promoter for the OsBWMK1S splice variant), are biologically functional, we analyzed transgenic plants expressing GUS fusion constructs for each promoter. Both pOsBWMK1L and pOsBWMK1S are biologically active, although the activity of pOsBWMK1S is lower than that of pOsBWMK1L. Histochemical analysis revealed that pOsBWMK1L is constitutively active in most tissues at various developmental stages in rice and Arabidopsis, whereas pOsBWMK1S activity is spatially and temporally restricted. Furthermore, the expression of pOsBWMK1S::GUS was upregulated in response to hydrogen peroxide, a plant defense signaling molecule, in both plant species. These results suggest that the differential expression of OsBWMK1 splice variants is the result of alternative promoter usage and, moreover, that the mechanisms controlling OsBWMK1 gene expression are conserved in both monocot and dicot plants.