• International Journal of Oral Biology
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• 제35권2호
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• pp.51-60
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• 2010

Few studies have evaluated the apoptosis-inducing efficacy of NaF on cancer cells in vitro but there has been no previous investigation of the apoptotic effects of NaF on human oral squamous cell carcinoma cells. In this study, we have investigated the mechanisms underlying the apoptotic response to NaF treatment in the YD9 human squamous cell carcinoma cell line. The viability of YD9 cells and their growth inhibition were assessed by MTT and clonogenic assays, respectively. Hoechst staining, DNA electrophoresis and TUNEL staining were conducted to detect apoptosis. YD9 cells were treated with NaF, and western blotting, immunocytochemistry, confocal microscopy, FACScan flow cytometry, and MMP and proteasome activity assays were performed sequentially. The NaF treatment resulted in a time- and dose-dependent decrease in YD9 cell viability, a dose-dependent inhibition of cell growth, and the induction of apoptotic cell death. The apoptotic response of these cells was manifested by nuclear condensation, DNA fragmentation, the reduction of MMP and proteasome activity, a decreased DNA content, the release of cytochrome c into the cytosol, the translocation of AIF and DFF40 (CAD) into the nucleus, a significant shift of the Bax/Bcl-2 ratio, and the activation of caspase-9, caspase-3, PARP, Lamin A/C and DFF45 (ICAD). Furthermore, NaF treatment resulted in the downregulation of G1 cell cyclerelated proteins, and upregulation of p53 and the Cdk inhibitor $p27^{KIP1}$. Taken collectively, our present findings demonstrate that NaF strongly inhibits YD9 cell proliferation by modulating the expression of G1 cell cycle-related proteins and inducing apoptosis via mitochondrial and caspase pathways.

• 생명과학회지
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• 제28권7호
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• pp.765-771
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• 2018

$PPAR{\gamma}$는 지방세포의 분화를 조절하는 핵심적인 전사 인자로서 이를 조절하는 후성유전학적 조절 기전이 비만억제 연구에서 중요하게 주목 받고 있다. 선행연구에서 CACUL1이 $PPAR{\gamma}$의 전사 활성 및 지방세포의 분화를 억제하는 corepressor로서 작용함을 밝힌 바 있으며 본 연구에서는 CACUL1의 새로운 결합 단백질로 발굴된 protein arginine methyltransferase 5 (PRMT5)의 $PPAR{\gamma}$ 조절 기능을 분석하였다. PRMT5가 CACUL1과 결합함을 immunoprecipitation assay in vivo와 GST-pull down assay in vitro를 통하여 확인하였다. Luciferase reporter assay 결과로 두 단백질이 상호 협력하여 $PPAR{\gamma}$의 전사 활성을 억제함을 확인하였다. PRMT5가 안정적으로 과발현 또는 knockdown되는 3T3-L1 세포주를 제작하여 지방세포 분화에 미치는 영향을 분석한 결과, PRMT5가 3T3-L1세포의 지방세포 분화를 억제함을 증명하였다. 같은 맥락으로 PRMT5는 $PPAR{\gamma}$의 타겟 유전자인 Lpl과 aP2의 발현을 억제하는 것을 RT-qPCR로 확인하였다. 이상의 연구 결과로 PRMT5이 CACUL1과 결합하여 $PPAR{\gamma}$의 전사 활성을 방해, 나아가 지방세포의 분화를 억제하는 기존에 알려지지 않은 분자적 기전을 처음으로 밝혔다. 따라서, PRMT5 효소 활성의 조절은 비만 억제를 위한 약물 개발에 단서를 제공할 것이다.

• 한국간담췌외과학회지
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• 제26권1호
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• pp.58-68
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• 2022

Backgrounds/Aims: Mechanisms for the development of hepatocellular carcinoma (HCC) in hepatitis B virus (HBV)-infected patients remain unclear. The aim of the present study was to identify genes and pathways involved in the development of HBV-associated HCC. Methods: The GSE121248 gene dataset, which included 70 HCCs and 37 adjacent liver tissues, was downloaded from the Gene Expression Omnibus database. Differentially expressed genes (DEGs) in HCCs and adjacent liver tissues were identified. Gene ontology and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genome pathway enrichment analyses were then performed. Results: Of 134 DEGs identified, 34 were up-regulated and 100 were down-regulated in HCCs. The 34 up-regulated DEGs were mainly involved in nuclear division, organelle fission, spindle and midbody formation, histone kinase activity, and p53 signaling pathway, whereas the 100 down-regulated DEGs were involved in steroid and hormone metabolism, collagen-coated extracellular matrix, oxidoreductase activity, and activity on paired donors, including incorporation or reduction of molecular oxygen, monooxygenase activity, and retinol metabolism. Analyses of protein-protein interaction networks with a high degree of connectivity identified significant modules containing 14 hub genes, including ANLN, ASPM, BUB1B, CCNB1, CDK1, CDKN3, ECT2, HMMR, NEK2, PBK, PRC1, RACGAP1, RRM2, and TOP2A, which were mainly associated with nuclear division, organelle fission, spindle formation, protein serine/threonine kinase activity, p53 signaling pathway, and cell cycle. Conclusions: This study identified key genes and carcinogenic pathways that play essential roles in the development of HBV-associated HCC. This may provide important information for the development of diagnostic and therapeutic targets for HCC.

• Asian Pacific Journal of Cancer Prevention
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• 제15권16호
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• pp.6649-6655
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• 2014

Radiation therapy is an important treatment for head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC). However, how to promote radiation sensitivity in HNSCC remains a challenge. This study aimed to investigate the radiosensitizing effects of fenofibrate on HNSCC and explore the underlying mechanisms. HNSCC cell lines CNE-2 and KB were subjected to ionizing radiation (IR), in the presence or absence of fenofibrate treatment. Cell growth and survival, apoptosis and cell cycle were evaluated. In addition, CNE-2 cells were xenografted into nude mice and subjected to IR and/or fenofibrate treatment. The expression of cyclinB and CDK1 was detected by Western blotting. Our results showed that fenofibrate efficiently radiosensitized HNSCC cells and xenografts in mice, and induced apoptosis and G2/M arrest via reducing the activity of the CDK1/cyclinB1 kinase complex. These data suggest that fenofibrate could be a promising radiosensitizer for HNSCC radiotherapy.

• Journal of Oral Medicine and Pain
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• 제34권3호
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• pp.261-276
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• 2009

Sreptomyces라는 세균에서 추출한 lactacystin은 선택적인 proteasome 억제제로서 많은 연구에서 사용되어져 왔다. Proteasome 억제제는 최근의 많은 연구를 통해서 암세포증식의 억제에 대한 효과가 증명되었으며, 특히 다른 항암제와 병용처리 시, 상호작용에 의한 상승효과가 있다고 알려져 있다. 현재 proteasome 억제제는 새로운 강력한 항암제로서 분류되어 있다. 본 연구는 사람혀편평세포암종세포(SCC25 cells)에서 lactacystin의 세포독성과 성장억제 효과, 그리고 세포자멸사의 유도에 대한 분자생물학적 기전을 밝히기 위해 실험을 시행하였다. SCC25 세포, 사람정상각화세포 (HaCaT cells) 그리고 사람치은섬유모세포(HGF-1 cells)의 생존율 측정은 MTT법을 시행하였고, SCC25 세포의 성장억제를 확인하기 위해서는 clonogenic assay를 사용하였다. lactcystin이 SCC25 세포에서 세포자멸사가 유도되는지를 확인하기 위해서 hoechst 염색법, hemacolor 염색법 그리고 TUNEL법을 시행하였다. 그리고 SCC25 세포에 lactacystin을 적용한 후, Western blot 분석, 세포면역화학염색, 공초점레이저주사현미경 검경, FACScan flow cytometry, 사립체막 전위변화, proteasome 활성도 측정 등을 시행하였다. Lactacystin으로 처리된 SCC25 세포는 시간 및 용량 의존적인 세포생존율의 감소, 용량의존적인 세포성장억제 그리고 세포자멸사에 의한 세포죽음을 보였다. 흥미롭게도 lactacytin은 정상세포인 HaCat 세포와 HGF-1 세포에서는 세포독성을 전혀 보이지 않았다. 그리고 lactacystin이 적용된 SCC25세포에서 핵 응축, DNA의 조각남, 사립체막전위와 proteasome 활성도의 감소, DNA 양의 감소, cytochrome c의 사립체에서의 세포질로의 유리, AIF와 DFF40 (CAD)의 핵으로의 이동, Bax의 증가, caspase-7, caspase-3, PARP, lamin A/C 그리고 DFF45 (ICAD)의 활성화 혹은 파괴와 같은 아주 다양한 세포자멸사 증거를 보였다. Flow cytometry 분석에서는 CDK 억제제인 $p21^{WAF1/CIP1}$와 $p27^{KIP1}$의 발현 증가와 관계있는 것으로 추정되어 지는 G1 세포주기 정지를 보였다. 이러한 결과는 lactacytin이 SCC25 세포에서 G1 세포주기정지와 proteasome, 사립체 및 caspase 경로의 연속반응을 통한 세포자멸사를 유도함을 명확하게 증명하고 있다. 이와 같은 세포주기 정지와 세포자멸사 유도능은 lactacytin이 사람혀편평상피세포암종의 새로운 치료전략으로서의 가능성을 제공한다고 생각한다.

• 미생물학회지
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• 제42권4호
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• pp.319-325
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• 2006

칡을 첨가하여 배양한 아가리쿠스버섯(Agaricus blaxei Murill)으로 부터 열수추출, gel filtration chromatography, DEAE ion exchange chromatography를 통하여 아가리쿠스 $\beta$-glucan (AG)을 추출하였다. 추출한 아가리쿠스 $\beta$-glucan에 Bacillus megaterium 유래의 endo-$\beta$-(1$\rightarrow$6)-glucanase를 처리하여 올리고당류(AO)를 얻었다. 이렇게 얻은 AG와 AO를 이용하여 HT-29 인체 대장암 세포에 대한 항암 활성을 조사한 결과, 암세포의 성장 억제 효과는 시료의 처리 농도에 의존적으로 증가하였으며, apoptosis assay에서 암세포의 apoptosis 유발이 농도에 의존적으로 증가되었다. 또한, 암세포의 세포 주기를 분석한 결과, apoptosis 발생을 뜻하는 G0 (sub-G1)기와 G1기의 비율이 증가한 반면 S기와 G2/M기는 대조군에 비해 감소되었다. 이러한 결과를 바탕으로 암세포의 apoptosis 증가에 대한 AO의 작용이 어떤 유전자와 연관이 있는지를 알아보기 위하여 cDNA microarray를 통해 유전자의 발현율을 검색한 결과, apoptosis의 내부 외부 경로에 영향을 주는 유전자(TNESE9, TNFRSF9, FADD, CASP8, BAD, CRADD, CASP9 등)의 발현이 증가되었고 세포 분열 주기의 진행과 관련된 유전자(CCND2와 CDK2)의 발현이 감소되었으며, 세포 분열 주기를 지체시키는 유전자 (CDKN2A)의 발현은 증가되었다. 또한, 사이토카인을 암호하는 유전자 (IL6, IL18, IL6R 등)와 tumor suppressor와 관련된 유전자 (CEACAM1, TP53BP2, IRF1및 PHB)의 발현이 2배 이상 증가된 것을 확인할 수 있었다. 따라서 HT-29 인체 대장암세포에 대한 AO의 성장 억제 작용은 G0/Gl기를 지체시켜 암세포 증식을 억제하고 apoptosis에 의해 암세포를 사멸시키는 항암 활성을 나타내는 것으로 확인되었으며, 특허 AO가 AG보다 현저한 활성을 보였다. 더 나아가 아가리쿠스 $\beta$-glucan (AG)과 올리고당류 (AO)는 항암 활성을 가진 대체 의약 소재로 개발될 수 있을 것으로 기대된다.

• Clinical and Experimental Reproductive Medicine
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• 제33권2호
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• pp.125-132
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• 2006

연구 목적: 본 연구진은 초기 난포 발달 과정의 각 발달 단계별 난포를 분리하여 cDNA microarray를 이용한 유전자 발현 목록을 보유하고 있다. 본 연구는 이들 유전자 중에서 전사인자들의 목록에 주목하여 이들의 하위표적유전자를 생명정보학적 기법을 이용해 동정함으로써 이 후 초기난포발달의 조절 기전 연구를 위한 중요한 전사인자를 결정하고자 실시하였다. 재료 및 방법: 26개의 전사인자들에 대해서 Gene Ontology, MGI, 그리고 Entrez Gene 등의 유전자 데이터베이스 검색을 통해 전사인자들을 구성하는 도메인을 확인하였고, 전사인자 데이터베이스 ($TRANSFAC^{(R)}$ 6.0)와 진핵세포 프로모터 데이터베이스 검색을 실시하여, 전사인자의 cis-acting 및 trans-acting 하위표적유전자를 분석하였다. 결과: 26개 전사인자들에 대해서 DNA 결합 도메인과 단백질 상호작용 도메인을 확인하였다. 또 전사인자 데이터베이스와 프로모터 데이터베이스 검색으로부터 하위표적유전자에 대한 정보를 얻었다. 위와 같은 생명정보학적 분석 결과로부터 흥미로운 하위표적유전자를 갖는 3개의 전사인자로 목표를 압축할 수 있었다. 그 중에서 HNF4는 MPF 억제 조절자로 알려져 있는 Wee1 단백질 인산화 효소의 유사 유전자 프로모터 부위에 결합하는 전사인자이며, TBX2는 cdk 억제자 유전자의 발현을 억제하는 전사인자로 알려져 있어, 초기 난포발달 과정의 MPF 기능조절에 매우 중요한 역할을 할 것으로 사료된다. 결론: 본 연구는 생명정보학적 분석을 통하여 전사인자의 하위표적인자를 알아내고, 이를 이용하여 26개 전사인자 중에서 다음 연구를 위한 목표를 결정하는 접근방법을 제시했다는데 의미가 있다고 사료된다. 실제로 이렇게 결정된 전사인자들이 초기난포발달을 조절하는 분자생물학적 기전에 어떻게 관여하는지를 연구하기 위해서는 EMSA 등과 같은 실험적 증명을 통한 확인과 보충 연구가 필요할 것으로 사료된다.

• 한방재활의학과학회지
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• 제18권4호
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• pp.39-61
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• 2008

목적 : 좌골신경 압좌손상으로 유발된 쥐의 모델을 이용하여 손상된 말초신경의 재생효과에 관한 침자극 효과를 세포분자학적, 조직학적 관점에서 연구하였다. 아울러 손상 좌골신경을 지배하는 척수신경근과 가까운 부위 경혈자극과 좌골신경이 지배하는 말초부위 경혈자극과의 침자극 효과를 비교 연구하였다. 방법 : 한쪽 좌골신경에 압좌손상을 유발 한 실험쥐들을 1주, 2주로 나눈 뒤 각각에 대해 격일로 1주군은 3회, 2주군은 6회의 침자극을 시행하였다. 손상 좌골신경의 재생효과를 비교실험하기 위해 정상군, 압좌손상만을 유발한 실험군, 침자극 군으로 나누었다. 침자극 군 중 한 군은 손상신경을 지배하는 척수신경근에 가장 가까운 2개의 화타협척혈(EX B2)에 자침(근위부 자극군)하였고, 다른 한 군은 말초부위에 위치한 족삼리혈(ST 36)과 위중혈(BL 40) 2곳에 자침(원위부 자극군)하였다. 실험 후 각각의 조직을 분리하여 Western blotting 혹은 Hoechst staining으로 Gap-43, Cdc2, Cdk2, Erk1/2 단백질을 분석 및 좌골신경의 각 세포수를 측정하였다. Retrograde tracing을 통해 L5의 DRG와 척수에서 말초신경 재생 효과를 관찰하였고, Immunofluorescence staining을 통해 신경돌기 가지의 신장 정도를 파악하였다. 결과 : 좌골신경 손상 7일된 실험쥐의 근위부와 원위부 침자극군에서 GAP-43와 Cdc2 단백질수준이 향상된 것으로 나타났다. Cdk2 단백질수준은 압좌손상 실험군에서 강하게 증가하였지만 침자극군과 비교해서 별다른 차이는 보이지 않았다. Phospho-Erk1/2 단백질수준은 침자극군에서 향상된 것으로 나타났다. 손상 7일과 14일 된 실험쥐의 손상 원위부에서 슈반세포 수가 증가하였으며 특히 근위부 침자극군에서 더욱 증가한 것으로 나타났다. Retrograde tracing을 이용한 검사 결과 침자극군에서 L5의 DRG와 척수의 염색 세포 수가 증가된 것으로 나타나 침자극이 축삭재생에 효과적인 것으로 나타났다. L5의 DRG 감각신경의 신경돌기 가지 신장정도 및 GAP-43 단백질의 발현 정도를 측정한 결과 근위부 침자극군에서 효과적으로 GAP-43 단백질의 발현 및 신경돌기 가지가 신장된 것으로 나타났다. 결론 : 본 실험결과 침치료가 손상 좌골신경의 재생에 효과적인 것으로 보여지며, 특히 손상된 좌골신경을 지배하는 척수신경근 주위 화타협척혈에 대한 침자극이 말초부위의 침자극에 비해 신경재생에 더욱 효과적인 것으로 나타났다.

• Journal of Acupuncture Research
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• 제17권2호
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• pp.169-186
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• 2000

To study anti-cancer effect and molecular biological mechanism of bee venom for aqua-acupuncture, the effects of bee venom on cell viability, apoptosis, and cell cycle were analyzed using MTT assay, tryphan blue assay, [3H]thymidine release assay, flow cytometric analysis, activity of caspase-3 protease activity assay, and immunocytometric analysis of PCNA. To explore whether anti-cancer effects of bee venom are associated with the transcriptional control of gene expression, quantitative RT-PCR analysis of apoptosis- and cell cycle-related genes was performed. The obtained results are summarized as follows: 1. The MTT assay demonstrated that cell viability was decreased by bee venom in a dose-dependant manner. 2. Significant induction of apoptosis was identified using tryphan blue assay, [$^3H$]thymidine release assay, and flow cytometric analysis of sub $G_1$ fraction. 3. In analysis of caspase-3 protease activity, the activity had increased significantly, in a dose-dependant manner. 4. Quantitative RT-PCR analysis of the apoptosis-related genes showed that Bcl-2 and $Bcl-X_L$ were down-regulated whereas Bax was up-regulated by bee venom treatment. 5. In flow cytometric analysis of cell cycle and immunocytometric analysis of PCNA expression, cell numbers of $G_1$ phase was increased by a dose-dependant manner. 6. In quantitative RT-PCR analysis of the cell cycle-related genes, p21, p27, and p57 were increased, while Cyclin D1, CDK4, c-Myc, c-Fos, and Histone H3 were decreased. In contrast, there were no remarkable changes in expression levels of CDC2 and c-Jun.

• Journal of Microbiology and Biotechnology
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• 제28권4호
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• pp.542-550
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• 2018

Heat shock protein 90 (Hsp90) is treated as a molecular therapeutic target for the prevention and treatment of cancer. Geldanamycin (GA) was the first identified natural Hsp90 inhibitor, but hepatotoxicity has limited its clinical application. Nevertheless, a new GA analog (WK-88-1) with the non-benzoquinone skeleton, obtained from genetically engineered Streptomyces hygroscopicus, was found to have anticancer activity against two human breast cancer cell lines. WK-88-1 produced concentration-dependent inhibition of cell proliferation, cell cycle arrest, and apoptosis in estrogen receptor (ER)-positive MCF-7 and ER-negative MDA-MB-231 cell lines. Detailed analysis showed that WK-88-1 downregulated some key cell cycle molecules (CDK1 and cyclin B1) and lead to $G_2/M$ cell cycle arrest. Further studies also showed that WK-88-1 could induce human breast cancer cell apoptosis by downregulating Hsp90 client proteins (Akt, p-Akt, IKK, c-Raf, and Bcl-2), decreasing the ATP level, increasing reactive oxygen species production, and lowering the mitochondrial membrane potential. Meanwhile, we discovered that WK-88-1 significantly decreased the levels of Her-2 and $ER-{\alpha}$ in MCF-7 cells but not in MDA-MB-231 cells. In addition, WK-88-1 significantly increased caspase-3, -8, and -9 activities and the cleavage of PARP in a concentration-dependent manner (with the exception of caspase-3 and PARP in MCF-7 cells). Taken together, our preliminary results suggest that WK-88-1 has the potential to play a role in breast cancer therapy.