• 생명과학회지
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• 제22권12호
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• pp.1608-1613
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• 2012

KIF5/Kinesin-I는 경쇄(light chain)를 통하여 결합함으로써 다양한 운반체들을 미세소관을 따라 운반한다. Kinesin light chains (KLCs)은 tetratricopeptide repeat (TPR) 영역을 매개로 운반체와 결합한다. 현재까지 KLCs와 결합하는 많은 운반체들이 확인되었으나 KLCs가 어떻게 특정운반체를 인식하여 결합하는지는 아직 확실히 밝혀지지 않았다. 본 연구에서 KLC1의 TPR 영역과 결합하는 단백질을 분리하기 위하여 효모 two-hybrid system을 이용하여 탐색한 결과 amyloid precursor protein (APP)과 결합하는 것으로 보고된 protein interacting with APP tail 1 (PAT1)을 분리하였다. KLC1은 PAT1의 C-말단 부위와 결합하며, PAT1은 KLC1의 TPR 영역을 포함한 부위와 결합함을 효모 two-hybrid assay로 확인하였다. 또한 PAT1는 KLC2와도 결합하였지만 kinesin heavy chains (KHCs)인 KIF5A, KIF5B, KIF5C와는 결합하지 않았다. 단백질간 결합은 glutathione S-transferase (GST) pull-down assay와 공동면역침강으로도 확인하였다. 생쥐의 뇌 파쇄액을 PAT1 항체와 APP 항체로 면역침강을 행한 결과 KLC와 KHCs가 같이 침강하였다. 이러한 결과들은 PAT1이 Kinesin-I와 APP 포함 소포간의 상호작용을 매개한다는 것을 시사한다.

• 한국자원식물학회지
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• 제17권1호
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• pp.28-33
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• 2004

본 연구는 개량 포플러 현사시 3호를 재료로 제초제 저항성 유전자 PAT으로 형질전환시 킨 다음 제초제 Basta처리에 의한 효율적인 형질전환체 선발을 목적으로 시험되었다. Basta 처리에 따른 캘러스유도, 부정아유도 및 액아유도 시험을 통해 조직치사 농도는 1.0mg/L로 결정할 수 있었으며, 이 농도처리에 의해 형질전환체의 조기선발에 사용하였다. 이 농도처리로 비형질전환체는 모두 고사되었지만, 형질전환체는 정상적으로 반응을 보이며, 생육이 가능하였다 .한편, 형질전환체에 제초제를 직접 살포한 결과, 정상적 생육이 가능했고, PAT activity측정 결과에서도 양성 반응을 나타내어 현사시 3호 세포내에 PAT유전자가 정상 발현됨이 확인되었다. 이로써 현사시에 PAT유전자 도입 및 발현을 위하여 제초제 Basta 처 리와 PAT assay가 매우 효과적인 것으로 나타났다.

• Journal of Microbiology and Biotechnology
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• 제17권4호
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• pp.681-684
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• 2007

An immunoassay method was developed to quantitatively detect phosphinothricin-N-acetyltransferase (PAT) encoded by the Bialaphos resistance (bar) gene in genetically modified (GM) pepper. The histidine-tagged PAT was overexpressed in Escherichia coli M15 (pQE3l-bar) and efficiently purified by $Ni^{2+}$ affinity chromatography. A developed sandwich enzyme-linked immunosorbent assay (S-ELISA) method (detection limit: $0.01{\mu}g/ml$) was 100-fold more sensitive than a competitive indirect ELISA (CI-ELISA) method or Western blot analysis in detecting the recombinant PAT. In real sample tests, PAT in genetically modified herbicide-tolerant (GMHT) peppers was successfully quantified [$4.9{\pm}0.4{\mu}g/g$ of sample (n=6)] by the S-ELISA method. The S-ELISA method developed here could be applied to other GMHT crops and vegetables producing PAT.

• 한국식품위생안전성학회지
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• 제33권3호
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• pp.193-199
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• 2018

본 연구에서는 유전자 변형 옥수수(GM 옥수수)에 특이한 단크론성 항체를 개발하고 이에 대한 특성을 확인하는 연구를 수행하고자 하였다. 먼저 형질전환 대장균으로부터 PAT 단백질을 발현시킬 수 있는 시스템을 확립하였고, 재조합 PAT 단백질을 대량 생산하여 항원으로 사용하였다. 준비된 항원을 면역한 결과 재조합 PAT 단백질의 항원성은 매우 높은 것으로 확인되었으며, 세포융합과 클로닝을 통해 12 종의 hybridoma를 확립하였고 western blot 결과 10 종의 hybridoma가 재조합 PAT 단백질과 강한 반응성을 나타내었다. 10종의 hybridoma가 생산하는 항체가 실제 GM 옥수수에 반응하는지를 추가의 western blot으로 분석한 결과 2종의 단크론성 항체(PATmAb-7 and PATmAb-12)가 재조합 PAT 단백질뿐만 아니라 실제 GM 옥수수 중 PAT와 반응하는 것으로 확인되었다. 항체를 대량 생산하고 정제한 후 2종의 항체는 SDS-PAGE 상에서 대표적인 항체의 분리패턴(heavy와 light chain)을 나타내었고, 전형적인 $IgG_1$과 ${\kappa}$ type으로 확인되었다. 정제된 단크론성 항체는 특성을 조사한 결과 다른 GMO에서 발현될 수 있는 재조합 단백질과 non-GM 옥수수 추출물에는 반응성이 없고 PAT 단백질에만 특이적으로 반응하는 것을 확인할 수 있었다. PATmAb-7 를 이용한 간접효소면역분석법의 검출한계는 0.3 ng/mL 수준으로 기준의 유전자변형 콩 면역분석법과 비교했을 때 높은 민감도를 나타내었다. 이상의 결과로 볼 때 개발된 2종의 항체(PATmAb-7 and PATmAb-12)는 GM 옥수수에서 발현되는 PAT 단백질에 특이적으로 반응하는 항체로 확인되었고, 2종의 항체를 이용한 면역분석법과 바이오센서의 개발 가능성을 제시할 수 있었다.

• 한국자원식물학회지
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• 제12권4호
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• pp.253-259
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• 1999

제초제 bialaphos에 저항성인 phosphinothricin ace-tytransferase gene이 도입된 형질전환 감자 식물체에서 유전자의 간편한 확인방법을 확립하였다. 먼저 형질전환체와 대조식물체의 잎 disc를 취해 bialaphos 5mg/l를 처리한 액체배지에 치상하였을 때 배양 25일이면 대조식물체의 잎 disc는 완전히 고사되어 형질전환체와 구별이 가능하였다. 감자의 뿌리 생육 비교실험에서는 bialaphos 0.5mg/l의 농도에 agar를 0.6% 첨가한 선발배지에서 식물체의 정단부위를 치상하여 비교하였을 때 7-10일이면 뿌리의 생육차이를 이용하여 간편하게 형질전환여부를 판정할 수 있었다. 또한 감자의 잎 disc를 제초제 bialaphos 0.5mg/l를 처리한 액체배지에 치상하여 15일이 경과한 후 chlorophyll A의 함량을 측정하였을때 형질전환체는 대조식물체보다 2.5배 정도 많은 chlorophyll A를 가지고 있어 형질전환체의 조기 판별시 chlorophyll A함량에 의해 검증이 가능하였다. 한편, 이렇게 형질전환 여부가 확인된 감자 식물체를 이용하여 PAT효소의 활성을 측정한 결과 대조 식물체에서는 PAT효소의 활성을 보이지 않았으나 형질전환 식물체에서는 모두 효소의 활성이 높았다.

• 식물조직배양학회지
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• 제26권3호
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• pp.163-169
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• 1999

우리나라의 주요 개량 포플러의 하나인 현사시 3호를 대상으로 Arobacterium tumefaciens MP 90/PAT을 이용하여 비선택성 제초제인 Basta에 내성을 갖는 형질전환체를 획득하고자 본 실험을 수행하였다. 기내 배양된 엽절편을 재료로 균주에 10분간 감염, 2일간 공조 배양 및 3주간 선발배지에서 배양으로 kanamycin에 내성을 갖는 잠정적인 형질전환 캘러스를 유도하였다. 선발된 캘러스로부터 배양 4주 후 줄기를 유도하였으며, 증식된 줄기는 발근시켜 완전한 형질전환체를 얻었다. 형질전환체는 PCR기법 및 Southern blot 분석으로 PAT 유전자 전이를 확인하고. 유전자의 발현은 GUS 유전자의 발색 반응으로 확인하였다. 형질전환체는 폿트로 이식하여 4주간 생장시킨 후 제초제 Basta로 살포한 결과 대조구 식물체는 고사되었으나, 형질전환체는 정상적인 생육이 가능하였다

• 한국약용작물학회지
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• 제15권4호
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• pp.285-290
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• 2007

본 연구는 Agrobacterium을 매개로 도라지에 PAT 유전자를 도입하여 ‘바스타’에 저항성을 가지는 형질전환 도라지를 개발하는 기술을 확립하기 위하여 수행되었다. 종자를 무균적으로 발아시킨 후 10일 된 미성숙 자엽과 성숙엽에 Agrobac-terium을 접종하고 1/10 MS 배지에서 48시간 동안 공동 배양하였다. 공동배양 후 부정아 유도를 위해 MS 선발배지 (0.2 $mg/{\ell}$ NAA, 1.0 $mg/{\ell}$ BA, 3% 설탕, pH 5.8; 3 $g/{\ell}$ gelrite, 100 $mg/{\ell}$ kanamycin, 500 $mg/{\ell}$ carbenicillin)에 치상하여 배양한 결과 미성숙 자엽의 절편에서 형질전환체로 추정되는 부정아가 형성되었고, 선발배지에 2회 계대배양하여 형질전환 추정체를 선발하였다. 이러한 형질전환 추정체는 GUS, PCR 분석 및 RT-PCR 분석에 의하여 형질전환체로 확인되었다. 또한 10 $mg/{\ell}$ 의 phosphinothricin이 함유된 배지에서 배양하여 형질전환 여부를 확인하였고, 순화재배 후 0.3% ‘바스타’를 살포한 결과 형질전환 도라지는 제초제에 저항성을 보였다. ‘바스타’에 저항성을 보인 도라지 식물체는 정상적인 생육을 계속하여 개화하였다.

• Journal of Plant Biotechnology
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• 제37권3호
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• pp.319-326
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• 2010

화석에너지의 고갈과 지구 온난화 현상으로 인해 재생 가능한 식물자원으로부터 바이오에너지를 얻고자 하는 관심이 높아지고 있다. 이에 바이오디젤의 원료로 사용 되기 적합한 형질전환이 된 유채를 개발하기 위한 첫 단계로 한국 고유 유채 품종을 이용한 형질전환 체계를 구축하였다. 내한, 영산, 탐미, 한라 유채의 종자를 분양 받아 지방산 분석을 실시한 결과, 종자의 약 32-40% 식물성 오일이 포함되어 있었고, 그 중 올레인산의 함량은 60mole% 이상 존재하는 것으로 확인되었다. 그 중 오일 함량 및 올레인산 함량이 높고, 형질전환 효율이 비교적 높은 한라 유채품종이 그리고 $\beta$-glucuronidase (GUS)와 phosphinothricin acetyltransferase (PAT) 유전자가 포함된 pCAM-BIA3301 벡터가 도입된 Agrobacterium tumefaciens GV3101균주가 형질전환에 사용되었다. 형질전환이 된 유채 식물체는 제초제에 대한 내성, PCR을 이용한 PAT 유전자의 도입 여부 및 GUS 활성 분석을 통하여 선별하였다. 그 결과 한라 유채의 경우, 10. 4% 형질전환 효율을 보였고, 제초제 저항성이 다음 세대 ($T_1$ 식물체)로 안정되게 유전됨을 확인하였다. 이러한 연구는 바이오디젤 원료로 사용될 다양한 유채 품종에 교배를 통해 제초제 저항성 유전자를 쉽게 도입할 수 있는 가능성을 제시하였다.

• 생명과학회지
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• 제14권2호
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• pp.368-373
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• 2004

광범위 제초제인 Bast $a^{(R)}$에 대해 저항성을 가지는 형질전환체 벼를 개발하였다. Bar유전자를 함유하고 있는 플라스미드 pCaMV35S::Bar를 embryogenic 현탁 배양체로부터 분리한 벼의 원형질체에 도입하였다. Phosphinotricin에 대해 저항성을 가지는 형질전환체 식물체들이 재분화되었고, 이들을 15 mg/l phosphinotricin이 함유한 배지에서 다시 선별하였다. 형질전환체 벼에서 bar유전자의 삽입과 발현을 Southern과 Northern blot분석으로 확인하였고, 또한 $R_1$ 형질전환 식물체들을 PAT 활성 assay로 재차 유전자 발현을 확인하였다. Bar 유전자는 다음 세대인 $R_1$ 식물체에서 3:1 멘델 유전 양상을 나타내었고, 형질전환체 $R_1$과 $R_2$ 식물체들은 fieild에서 살포되는 제초제 양만큼 Bast $a^{(R)}$ 를 살포했을 때 제초제 저항성을 나타내었다..

• 한국동물위생학회지
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• 제34권2호
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• pp.159-166
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• 2011

This study was carried out to develope enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for detection of canine brucellosis in dogs experimentally inoculated with Brucella abortus 1119-3 and B. canis RM666. Groups A, B and C of dogs (each group consisting of three dogs) were orally inoculated with approximately $5{\times}10^9$ colony-forming units of B. abortus and B. canis, and with sterile pyrogen-free PBS, respectively. The animals were monitored at regular intervals upto the 12th week post inoculation (PI) by standard tube agglutination test (STAT), plate agglutination test (PAT), Rose Bengal test (RBT), 2-mercaptoethanol rapid slide agglutination test (2ME-RSAT) and ELISA. The induced antibody titers in group A dogs were detected from the first week PI to the eighth week PI in STAT, PAT and RBT using the inactivated whole cells of B. abortus 1119-3 as antigens, while no sera in groups B and C dogs reacted with the antigens. In 2ME-RSAT using whole cells of B. canis M-strain as antigens, the induced antibody titers in group B dogs were observed at the second week PI and persisted for the 12th week PI, while sera of groups A and C dogs did not react with the whole cells. In ELISA using cytoplasmic fractions antigen of B. abortus 1119-3, the mean optical density of antibodies in groups A and B was detected from the first and second weeks PI, respectively, and persisted for 12th week PI, while sera of group C did not cross-react with the fractions antigen. However, in ELISA using the hot saline extracts of B. canis M- as an antigen, the induced antibody titers in only group B dogs were detected from second week PI and persisted for until the end of this study. These results indicate that the ELISA using B. abortus 1119-3 cytoplasmic fractions as antigens can be a good candidate for detection of brucellosis by B. abortus as well as B. canis in dogs.