본 연구에서는 S. hindustanus ATCC 31218로부터 선별된 변이주를 사용하여 배양조건이 nebramycin 주요 생산물인 factor 2, factor 4, factor 5', kanamycin A 등의 구성비율과 역가에 미치는 영향을 조사하였다. 실험결과, nebramycin의 factor들이 구성비율은 온도 및 배지보다는 배양액량, 교반속도 등에 의해 크게 영향을 받는 것으로 나타났다. 따라서 플라스크와 발효조의 산소전달속도를 각각 측정하여 factor 5' 생산의 최적 산소전달조건을 검토한 결과, $0.50 mMO_2$/min으로 배양시 factor 5'의 역가가 가장 높았으며 구성비율도 70% 이상을 나타내었다. 한편 $0.9 mMO_2$/min 이상으로 배양시는 factor 2의 역가와 구성비율이 현저히 감소한 반면 factor 2의 역가와 구성비율이 급격히 증가하였다. 한편 본 연구에 사용된 변이주 S. hindustanus YHT-0001는 factor 5'의 역가는 16.4배, factor 5'구성비율은 약 11% 향상된 균주로 확인되었다. S. hindustanus 발효시 공급되는 산소량은 단지 hydroxyl기와 아미노기의 존재유무에 따라 구조가 결정되는 factor 5', factor 4, kanamycin A의 hydroxyl기 생성을 위한 산소공여자로 역할뿐 만 아니라 배당체 구조에 차이를 보이는 apramycin 생합성과정에 영향을 크게 준다고 사료되었다.
산소를 많이 소비하는 발효공정일수록 배양액중의 용존산소의 농도가 목적생산물의 생산성에 많은 영향을 주는 경우가 많다. 때문에 고농도 발효에 앞서, 발효조의 sparging hole로부터 임펠러 높이에 따른 산소전달 능력을 알아본 결과 공기공급이 1 vvm, 교반속도가 600 rpm에서 산소전달계수($K_La$)는 2.67($min^{-1}$)으로 가장 높았다. 배양 시 용존산소 농도를 20% 이상 유지시켰을 때 온도에 따른 k6ub/IFN-${\alpha}1$ 생성은 $30^{\circ}C$에서 세포증식을 하고 $25^{\circ}C$에서 IPTG로 Induction 하였을 때 발현율이 6.43mg/ml로 total protein의 37%로 가장 많은 양이 발현되는 것을 알 수 있었다. 용존산소 농도에 따른 k6ub/IFN-${\alpha}1$의 발현양은 용존산소 농도가 35%일 때 가장 높은 수율을 나타냈다. 용존산소량은 산소소비 속도를 측정함으로써 정확한 임계점을 찾을 수 있었는데 용존산소량이 35% 유지될 때 산소 전달 속도와 비교하여 가장 적당한 산소공급량임을 확인할 수 있었다.
공기분리 PSA 공정설계에 적용할 물질전달계수를 구하기 위하여 흡착탑을 통과하는 질소와 산소의 농도에 대한 동적파과곡선을 실험적으로 측정하였다. 그 결과를 전산모사에 의한 파과곡선과 비교하여 벌크흐름 중의 물질전달속도를 예측하였다. 전산모사에서 흡착은 coupled Langmuir isotherm을 따른다고 보았으며, 물질전달은 LDF 모델에 의해 표현된다고 가정하였다. 실험과 이론의 비교를 통해 얻은 물질전달계수는 유속에는 거의 영향을 받지 않았으나 압력 조건에 따라 민감한 변화를 보였다. 이를 통해 물질전달저항이 거대기공 확산영역에 있음을 예측할 수 있었으며, 물질전달계수를 압력변화에 대해 지수함수의 형태로 표현하였다. 질소나 산소 단일 성분에 대해서 얻은 물질전달계수는 질소와 산소 혼합 벌크기체의 파과곡선에 적용했을 경우에도 5% 이하의 오차로 잘 일치함을 보여주었다.
신규 병원성세균 Bacillus thuringiensis CAB565, 566균주를 이용한 산업배지에서의 배양조건에 따른 독소단백질의 차이를 확인하였다. 포도당, 효모추출물 등으로 구성된 산업배지의 산소 전달 속도를 확인하고자 소형배양기에서 임펠러와 배지 농도에 따른 산소전달계수(KLa)의 차이를 확인하였다. 교반기의 통기량이 많을수록 그리고 배지 농도가 높아질수록 산소전달계수(KLa) 값이 상승하였다. 하지만 교반속도는 200 rpm에서 가장 효율적이었고, 교반속도가 상승할수록 효과가 떨어졌다. Microsparger를 이용하여 배양 중 단계적으로 통기속도를 높여 배지내 용존산소농도를 50% 이상으로 유지시켜 배양한 결과 생균수는 배양 후 16시간, 포자수는 54시간에 최대의 농도값을 보였다. 그 결과, B.t. CAB565의 생균수는 $2.3{\times}10^{10}cell/ml$, 포자수는 $1.9{\times}10^{10}spore/ml$ 그리고 B.t. CAB566의 생균수는 $1.8{\times}10^{10}cell/ml$, 포자수는 $1.4{\times}10^{10}spore/ml$를 보였다. 탄소원의 농도는 포도당의 농도가 5%일 때, 세포성장에 가장 유리한 것으로 조사되었다.
본 연구에서는 원뿔형으로 개발된 미세기포형 산기관의 성능향상을 위하여 운용적 측면에서 실험과 전산모사적 방법을 이용하였다. 산기관 잠김깊이의 변화에 대해 성능실험이 용이한 실증 규모의 타워형 생물반응기에 산기관을 장착하여, 잠김깊이가 표준산소전달계수($K_{L}a_{20}$) 및 표준산소전달효율(SOTE) 등 산소전달 성능에 미치는 영향을 실험적으로 연구하였다. 또한, 2상 유동에 관한 유체역학적 전산모사를 이용하여 산기관 수와 잠김깊이에 대한 유동현상을 파악함으로써 산소전달 성능변화에 대한 원인을 규명하였다. 산소전달 성능실험결과, 산기관의 잠김깊이를 6 m에서 12 m로 증가시킴에 따라 표준산소 전달계수는 7% 증가하였으나 표준산소전달효율은 39~72% (5.6 %/m)로 대폭 상승하였다. 유동 해석결과, 산기관의 수가 증가함에 따라 공기 체적분율 및 공기와 시험수의 유속 모두 증가하였으며, 공기와 시험수의 유속 경향은 유사하게 나타났다. 잠김깊이가 증가함에 따라서 공기 체적분율, 공기 및 시험수의 유속은 조금씩 감소하는 경향을 나타냈다. 선회 병류유동은 기포류의 확산과 상승속도를 결정하는 주요 인자로서 선회강도가 과도하게 큰 경우에는 기포 체류시간과 체류량이 감소되므로 산소전달 성능을 저하를 예측할 수 있었다.
본 연구는 매체순환연소공정용 산소전달입자로서 $CaSnO_3$ 입자의 타당성을 조사하기 위해 수행하였다. $CaSnO_3$은 페롭스카이트 구조를 가지고, 반복되는 환원-산화 반응 후에도 구조적안정성을 보였다. 산소전달량은 환원 반응 시 결정구조 변화를 통해 계산된 이론 수치와 거의 동일한 15.4 wt%를 가졌다. 10번의 환원과 산화 반응 후에, 산소전달량과 산소전달속도는 작동 온도에서 일정하게 유지되었다. 결론적으로, $CaSnO_3$ 입자는 CLC의 산소 운반체로서 좋은 대체 물질이 될 수 있다고 판단하였다.
본 연구에서는 새롭게 설계한 인공폐 모듈을 사용하여 인공폐의 효율을 평가하기 위한 압력손실과 산소전달에 대한 실험을 수행하였다. 또한 증류수, 아황산나트륨용액을 혈액대용물질로 사용하여 다른 인공폐의 성능을 평가하였다. 혈액대용물질은 압력손실과 산소운반력을 연구하는데 전혈(whole blood)에 비해 장점이 많다 즉. 이들은 상대적으로 값이 저렴하고 조절하여야 할 변수가 적다. 또한 이 용액을 사용하게 되면 탈산화장치가 필요 없으며 실험결과의 분석이 상대적으로 쉽다. 전혈과 같은 산소분압을 갖는 아황산나트륨용액을 사용하는 경우 아황산나트륨 용액의 산소전달속도는 전혈을 사용하는 경우의 산소전달속도와 거의 일치하였다. 이 실험에서 중공사모듈의 산소전달속도를 측정하는데 아황산나트륨용액이 혈액대용물질로 이용될 수 있음을 보였다. 이 인공폐 모듈에서는 용액이 중공사의 바깥쪽으로 흐르도록 설계하였는데 이 실험용 인공폐는 압력손실이 안쪽으로 흐르도록 하는 흐름에 비해 $1/3\~1/6$였다.
Corynebacterium glutamicum CH 1516(L-leucine 생산주)를 사용하여 7l 발효조에서 배양온도 및 pH, 산소전달속도 등을 최적화한 결과 각각 $30^{\circ}C$, 7.0, 0.21 kmole $O_2$/$m^3{\cdot}hr$이었다. 산소전달속도가 0.19 kmole $O_2$/$m^3{\cdot}hr$ 보다 낮은 조건에서는 상당량의 lactic acid가 축적되었고 0.23 kmole $O_2$/$m^3{\cdot}hr$보다 높은조건에서는 glutamic acid가 생성되고 PCV가 크게 증가하였다. 한편 1200l 실험공장에서의 L-leucine 생산을 위해 7l 발효조에서 최적화된 배양조건을 적용하여 산소전달속도를 지표로 공정확대를 실시한 결과 7l 발효조와 거의 대등한 결과를 얻을 수 있었으며,산화한 원전위 -15-170 mV에서 L-leucine이 왕성하게 생산되었다.
Candida parapsilosis ATCC 22019 돌연변이주를 이용하여 xylitol 생산에 영향을 주는 배양 조건인 pH와 온도 그리고 교반속도 및 산소전달속도등의 환경인자가 Xylitol의 생성에 미치는 영향을 살펴보았다. 발효조에서 pH가 증가 할수록 균체농도와 기질소비속도가 증가하여 발효시간이 단축되었다. 그러나, Xylitol생산은 pH 4.5와 5.5에서 큰 차이 없이 50g/l의 xylose로 부터 약 34g/l로 최대농도를 보여주었다. 온도가 증가 할수록 최대 비증식속도가 증가하였지만 최종 균체농도는 감소하였고, xylitol 생산성은 $30^{\circ}C$에서 최대값을 보여주었다. 산소전달속도의 영향을 조사하기 위하여 발효조의 교반속도를 변화시키면서 배양한 결과 균체농도는 산소 전달속도가 높을수록 증가하였지만, xylitol 생산은 크게 감소하였다. 교반속도를 150rpm(산소전달속도 $30\;hr^{-1}$에 해당)으로 배양할때 발효시간 62시간에서 50g/l의 xylose로 부터 xylitol 농도가 35.8g/l로 최대값을 나타내었다. Xylitol 생산성을 증가시키기 위하여 1차 발효가 끝난 발효조에서 균체를 회수하여 20g/l로 농축하여 최적조건인 pH 4.5, $30^{\circ}C$, 산소전달속도 $30\;hr^{-1}$에서 재배양을 하였을 때 50g/l의 xylose가 배양시간 약 18시간만에 모두 이용되었고 전환수율 80%에 해당하는 40g/l의 Xylitol이 생성되었다. 이때 Xylitol의 생산성은 2.22g/l-hr으로 일반 발효때 얻은 $0.5{\sim}g/l-hr$ 보다 약 $3{\sim}4$배 증가되었다.
4l 교반식 생물반응기에서, celite담체에 고정화된 Tolypocladium inflatum 균주 배양시의 산소전달 계수($k_La$)가 같은 세포농도 하에서 액상배양시의 값과 비교할 때, 고정상균주의 높은 비산소흡수율에도 불구하고, 2배 이상 증가되었다. 그 결과 고정상배 양의 경우, 용존산소량이 포화상태의 75%를 초과하는 충분한 산소량이 배양기간 내내 유지될 수 있었으나, 액상배양의 경우에는 용존산소량이 포화상태의 50% 이하까지 감소되었다. 임펠러의 교반속도에 따른 $k_La$의 단순 선형 의존 현상이, 250rpm에서 550rpm 범위에서 고정상배양 및 액상배양 모두에서 관찰되었으며, 그 의존정도는 액상배양의 경우 세포 농도와 함수관계인 반면, 고정상배양의 경우에는 세포농도와 무관하였다. 반면에 두 배양시스템 모두에서, 통기율 변화에 따른 산소전달율은 2.5vvm까지는 함수관계를 보였으나 그 의존도는 임펠러 교반속도의 변화에 따른 영향과 비교할 때 훨씬 미미하였으며, 2.5vvm 이상의 통기율에서는 산소전달현상에 별로 영향을 주지 못했다. CyA 생산 면에서 볼 때, 고정상세포는 형태학 또는 생리학적으로 훌륭한 배양상태를 유지할 수 있어서, 동일조건의 액상배양과 비교해서 약 2배 이상 생산성이 증가되였다. 그러므로 교반식 생물반응기를 이용한 celite-고정상배양법 은 고농도배양이 가능하다는 측면에서 볼 때, CyA 대량생산 산업화를 위한 대체 공정으로서 훌륭한 전망을 제시해 준다.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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