남조류 독소인 마이크로시틴은 호수에서 매우 미량 존재하기 때문에 이를 정확히 정량 분석하기가 쉽지 않다. 본 연구에서는 소양호에서 채취한 물시료 중에 포함된 남조류 독소, 마이크로시틴을 정량 분석하기 위하여 두 가지 서로 다른 정량 분석법을 시도하였으며 이 둘의 정량 결과를 비교${\cdot}$분석 하였다. 첫째는 고체상 추출과 HPLC(High Performance Liquid Chromatography)를 이용한 분석법을 이용하였으며 둘째는 마이크로시틴의 단일클론항체를 이용한 효소면역흡착분석법(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay,ELISA)을 이용하였다.
남조류 독소인 마이크로시스틴은 여름철 우리나라 여러 호수들에 존재하여 물고기와 가축 그리고 인간에게 강한 독성을 나타내는 독소이다. 지금까지는 남조류독소인 마이크로시스틴을 분석하기 위하여 HPLC를 사용하거나 ELISA 분석법을 이용하였으나 본 연구에서는 대량배양을 통해서 얻어진 남조류들 속에 미량존재하는 마이크로시스틴을 분석하기 위해 스트립을 이용하는 새로운 분석방법을 시도하였다. 이 분석법은 항원-항체기술을 이용하여 높은 특이도(specifisity)와 테스트 스트립(test strip)의 신속성, 그리고, 형광리더(reader)의 고감도(sensitivity) 분석능력 등의 장점을 이용하였다. 따라서 새로 개발된 분석법을 이용하면 다양한 물시료속에 존재하는 마이크로시스틴을 독소 표준품 없이 단시간에 고감도로 분석할 수 있다.
보툴리눔 독소는 사시, 안검경련, 뇌성마비, 경부근 근육긴장이상, 다한증, 얼굴의 주름 같은 미용 치료, 그리고 만성 편두통 치료에 미국 식약청의 승인을 받아 사용되고 있다. 이외에도 강직유발 통증, 포진후 신경통, 근막통증, 아프타성 구내염 등과 같은 통증을 조절하는 데 효과가 있을 것이라 기대되어 다양한 의료영역에서 연구가 진행되고 있는데, 최근 코골이 및 수면무호흡 치료에 있어서 보툴리눔 독소의 효과에 관한 연구들이 보고된 바 있어 그 유용성에 관해 고찰해 보고자 한다.
보툴리눔 독소 주사는 이마, 눈가 주름치료 등 미용성형분야 뿐만 아니라 만성 편두통(chronic migraine), 근육긴장이상(dystonia), 경직(spasticity), 측두하악장애의 치료 등에 사용되어 왔다. 특히 보툴리눔 독소 주사는 만성편두통환자의 예방적 치료요법으로 현재까지 유일하게 승인된 요법이다. 기존에 잘 알려진 운동신경에서의 마비효과와는 달리, 편두통에 대한 작용기전은 감각신경에서 말초감작과 신경원성염증과 관련되는 substance P, CGRP, glutamate 등 비콜린성 신경전달물질의 유리를 차단하여 통증신호를 차단하는 역할을 한다는 가설이 제기되고 있다. 본 논문에서는 보툴리눔독소가 갖는 진통효과에 대한 고찰과 함께 이를 통하여 추후 만성편두통환자에 대한 주사법 개발에 대한 방향성을 제시하고자 한다.
남조류 독소인 마이크로시스틴은 여름철 우리나라 여러 호수들에 존재하여 물고기와 가축 그리고 인간에게 강한 독성을 나타내는 독소이다. 본 연구에서는 화학적 산화제인 염소($Cl_2$), 과망간산칼륨($KMnO_4$), 과산화수소수($H_2O_2$)를 이용하여 마이크로시스틴중 가장 독성이 강한 마이크로시스틴 LR의 분해실험을 시도하였다. 수중 마이크로시스틴LR의 농도 측정은 마이크로시스틴 LR의 단일클론항체를 이용한 효소면역흡착분석법으로 측정하였다. 실험결과 염소는 마이크로시스틴 LR의 농도 800 pg/mL, $Cl_2$의 농도 12 ppm, 암소방치시간 40분, pH 7에서 가장 잘 분해되었으며, 또한 pH 8 이상에서는 독소 파괴가 눈에 띄게 감소하였다. 과망간산칼륨의 경우 마이크로시스틴 LR의 농도 2000 pg/mL, $KMnO_4$의 농도 1.2 ppm, 암소방치시간 60분, pH 7에서 가장 잘 분해되었다. 그러나 과산화수소수에 의한 마이크로시스틴 LR의 분해는 느린 화학 반응 속도 때문에 효과적이지 못함을 알수 있었다.
적리를 동반하는 돼지 분변에서 용혈성 균주를 분리 동정한 후, 장 독소 생성 유 무 및 항생제 감수성 시험을 수행하였다. 분리된 용혈성 균주 B. cereus BY06의 gyrB 유전자 염기서열을 분석한 결과, B. cereus와 99% 유사성을 나타내었다. PCR법에 의한 장 독소 유전자 검출 시험에서 B. cereus BY06는 장 독소 분비 양성으로 판정됨에 따라 설사형 식중독 균임이 확인되었다. B. cereus BY06를 이용한 항균제의 감수성 시험 결과, penicillin G에는 내성을 나타낸 반면 cephalothin, vancomycin, clindamycin, fusidic acid, gentamicin, ciprofloxacin, tetracycline 및 rifampin에 대하여 감수성을 나타냈다. 본 연구를 통해 돼지 분변에서 분리된 B. cereus 균주는 설사를 유발하는 장 독소를 분비하며, penicillin G에 대한 내성을 확인하였다.
보툴리눔 독소는 여러 영역에서 치료적 목적으로 사용되어 왔으며, 그 사용량과 적용범위가 점차 커지는 추세이다. 보툴리눔 독소가 강력한 독성 물질임에도 불구하고, 그 효과가 6개월이면 사라지는 가역적 치료방법이라는 인식이 강해서, 부작용이나 사용시 주의사항을 중요하게 생각하지 않는 경향이 있었다. 하지만 미국에서 부작용으로 사망하는 사례가 발생하여, 사용시 사망에 대한 주의사항이 추가되었다. 이에 본 종설은 보툴리눔 독소가 인체 내에서 대사되는 과정과, 발생 가능한 부작용, 사용시 유의사항, 사망 부작용 사례 등에 대해 지금까지 보고된 문헌들을 토대로 자세히 검토하고자 한다.
Single base substitution and deletion mutation have been introducted into the verotoxin 2 (VT2)A subunit gene from O157:H7 isolates to reduce cytotoxicity of VT2 and the cytotoxicity between wild type toxin and mutant toxoid were compared. A M13-derived recombinant plasmid pEP19RF containing a 940bp EcoRI-PstI fragment of VT2A gene was constructed for oligonucleotide-directed mutagenesis. The duoble mutant pDOEX was constructed by point and deletion mutation of two different highly conserved regions of VT2A encoding active site cleft of enzymatic domain. The key residue, Glu 167(GAA) and the pentamer(WGRIS) consisting of the enzymatic domain were replaced by ASP(GAC) and completely deleted in nucleotide sequence analysis of mutant, respectively. In the comparision of vero cell cytotoxicity between wide type toxin and toxoid from mutant, the wild type toxin expressed cytotoxicity in dilution of $10^{-6}$, but the toxid from mutant did not show cytotoxicity to vero cells.
독소루비신 고 생산성 산업균주인 BR-Dox의 충분한 양의 세포를 얻어내기 위해 R2YE 배지를 사용하였으며, 방선균의 포자형성이 잘 일어나는 R2YE 배지의 각 성분별로 첨가한 결과, CaCO$_3$를 첨가하였을 때 인위적인 원형질체 유도에 적합한 양의 세포를 얻어낼 수 있었다. 독소루비신 생합성 능력이 향상된 균주를 선별하기 위해 BR-Dox를 배양하여 세포를 인위적으로 원형질체로 유도하여 세포벽을 재생시킨 결과, 특이적으로 독소루비신 색소로 추정되는 붉은 색을 많이 내는 콜로니를 선별하여 정성 및 정량분석을 수행하였다. 선별된 파생균주 BR-Dox4와 BR-Dox6의 경우 TLC 정성분석 및 HPLC 정량분석 결과, BR-Dox에 비해 각각 25.2%, 12.2%의 생산성이 향상되었다. 본 연구결과는 인위적 원형질체 도입과 세포벽 재생을 통한 새로운 개념의 방선균 균주개량 방법을 제시하고, 이를 이용한 독소루비신 고생산성 균주개발의 가능성을 제시하였다.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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