• 대한소아치과학회지
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• 제44권3호
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• pp.350-357
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• 2017

본 연구는 상악 정중과잉치에서 얻은 치수유래 줄기세포(human dental pulp stem cells from supernumerary tooth, sDPSCs)를 대상으로 분화능의 변화 특성을 알아보고자 하였다. 전신 병력이 없는 6세 남자아이 상악 중절치와 측절치 사이에 매복 된 과잉치를 발치하여 sDPSCs를 얻었다. 세포들을 16계대까지 배양하였고, 1 - 8계대는 Young군으로 9 - 16계대는 Old군으로 나누었다. 각 계대 배양에 소요된 시간은 Young군에서는 $2.25{\pm}0.46$일, Old군에서는 $3.25{\pm}0.46$일을 보였으며, 이는 통계적으로 유의한 차이를 보였다(p < 0.05). 각 계대 별로 세포 형태를 관찰하고 분화를 유도한 후 Alizarin-red solution 염색을 통해 골모세포(odontoblast)로 분화되는 정도를 관찰하였다. 1, 8, 9계대에서 분화제를 처리하지 않은 세포의 형태에서는 방추형의 섬유모세포와 유사한 길쭉한 형태로 과립(nodule)이 적었지만, 16계대에서는 세포의 크기가 커지고 넓적한 형태로 변하고 과립도 많아졌다. 1계대는 분화 7일부터 과립이 관찰되며, 8계대에서는 14일 동안 분화제를 처리한 후 과립이 명확히 관찰되었다. 그러나 9계대 이후에서는 과립의 빈도가 상당히 감소되었다. ARS 염색에서는 1, 8계대는 진한 붉은색으로 염색되었으나, 9, 16계대는 염색이 옅게 되었다. 이를 통해 sDPSCs는 8계대 이전의 세포를 줄기세포의 원천으로 우선 고려하는 것이 좋다고 사료된다.

• 한국수정란이식학회:학술대회논문집
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• 한국수정란이식학회 2002년도 국제심포지엄
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• pp.77-77
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• 2002

본 연구는 체세포 및 체세포 핵이식란의 염색체 이상에 체세포의 계대의 영향성을 조사하고자 하였다. 한우 성축의 귀 조직으로 얻어진 세포를 공여세포를 체외성숙 후 제핵된 난자에 핵이식을 실시하였으며, 1.9kv/cm, 20$\mu\textrm{s}$/2times의 전기자극으로 융합후 5$\mu\textrm{g}$/ml의 ionomycin에서 4min, 1.9mM 6-DMAP에서 4h동안 배양함으로써 활성화를 유도하였다. 핵이식란은 CRlaa에서 4일간 배양 후 8 -cell단계에서 중기상의 유도를 위하여 상기 배양액 1ml당 0.05$\mu\textrm{g}$ colcemid에서 6-8시간 더 배양하였다. 이후, 6% Fetal bovine serum이 함유된 1% sodium citrate용액에 20분간 저장처리 후, methanol 5 : aceticacid 1 : distilled water 4로 1차, methanol 3: aceticacid 1 로 조성된 2차, methanol 4 : acetic acid 3 : distilled water 1의 3차고정액으로 1분간 재 침지시켰다. 고정 처리가 완료된 slide는 4% Giemsa용액으로 염색한 후 광학현미경 하에서 핵형 양상을 검경하였다. 체세포의 5계대에서는 684개의 spreads를 검경한 결과 염색체 수는 72%가 정상으로 60개이었고, 24%가 60개 이하였으며 4%가 60개 이상을 보였다. 10계대도 5계대와 비슷하여 71%가 정상, 26%가 60개 이하, 3%가 60개 이상이었고, 15계대에서는 55%가 정상이었고, 30%가 60개이하, 15%가 60개 이상을 보였다. 10계대 까지는 mixoploid의 비율의 변화가 없었으나 15계대에서 현저하게 늘어남을 볼 수 있었다. 또한 체외수정란과 핵이식란의 비교에서는 체외수정란은 250개의 spreads를 검경한 결과 염색체 수는 95.6%가 정상으로 60개이었고, 2.0%가 60개 이하, 2.4%가 60개 이상이었으나, 핵이식란은 204개를 검경하여 88%가 정상이었고, 4.9%가 60개이하, 7.1%가 60개 이상을 보임으로써, 핵이식란이 체외수정란에 비하여 염색체 이상의 비율이 높았다. 따라서 계대에 따라 체세포의 염색체이상의 비율이 상대적으로 증가하고, 체세포 핵이식에 따른 염색체 이상이 생길 수 있음을 알 수 있었다. (이 논문은 농림부 연구비에 의해 수행되었음)

• 대한소아치과학회지
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• 제45권4호
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• pp.492-498
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• 2018

이 연구는 과잉치 치수로부터 얻은 세포를 더 이상 증식하지 못한다고 판단될 때까지 계대배양을 시행하면서 초기, 중기, 후기 계대의 특성을 비교 분석하였다. 2명의 건강한 6세 남아로부터 3개의 과잉치를 발거하여 치수조직에서 줄기세포를 얻었다. 이를 SNT1(supernumerary tooth 1), SNT2라고 하고, 다른 아이로부터 얻은 과잉치는 SNT3로 명명하였다. SNT1과 SNT2는 똑 같은 시간으로 계대배양 되었고 SNT3은 조금 빠르게 계대배양 되었다. 전체 계대배양의 평균 기간은 $3.6{\pm}1.1$일이었다. 총 $23.3{\pm}0.6$계대까지 배양되었으며, 83일이 소요되었다. 이를 계대를 기준으로 3등분하여 세 군으로 나누었다. I군에서 II군까지 계대배양에 소요된 시간 증가율은 11.90%였으나, II군에서 III군 사이의 증가율은 28.62%로 2.4배가 증가하였다. 22계대까지의 배양기간에 대한 소요 시간을 회귀분석한 결과 y = 0.1169x + 2.25 ($r^2=0.4778$)과 y = 0.1169x + 2.0 ($r^2=0.6444$)으로 추론되었다. 과잉치 치수유래 줄기세포의 정상 배양은 20계대까지 가능할 것으로 판단되었으며, 후기로 넘어가면 계대배양 시간이 2.4배 증가였다. 후기 계대에서는 세포내 부유물이 증가하였고, 형태도 선형으로 변형되는 양상이 관찰되었다.

• Clinical and Experimental Reproductive Medicine
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• 제36권1호
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• pp.23-34
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• 2009

목 적: 중간엽 줄기세포를 임상에 적용하기 위해서는 체외 배양을 통한 세포증식 과정이 필요하나, 오랜 기간 동안 체외 배양을 하게 되면 노화되어 특성이 변하고 분화 능력 또한 감소하게 된다. 따라서 현재까지는 초기 계대배양의 세포만이 임상에 적용되고 있는 실정이며 체외에서의 세포 배양이 세포의 특성에 미치는 영향에 대한 연구와 함께 세포의 특성 변화 없이 체외증식이 가능하도록 하는 연구들이 골수 및 지방유래 중간엽 줄기세포에서 보고되고 있다. 그러나 현재 탯줄유래 줄기세포의 체외 배양에 따른 특성 변화 분석 연구는 아직 잘 이루어지지 않고 있다. 본 연구의 목적은 탯줄유래 줄기세포의 체외 배양 시 계대배양 증가에 따른 줄기세포의 특성 변화를 분석하고자 하였다. 연구방법: 사람의 탯줄유래 줄기세포 (human umbilical cord-derived stem cells, HUC)를 분리하여 in vitro에서 계대배양하였다. 계대배양에 따른 세포의 형태와 population doubling time (PDT)을 조사하고 RT-PCR 방법을 이용하여 mRNA 분석을 하였으며 면역세포화학 염색법을 이용하여 단백질 발현을 분석하였다. 결 과: 탯줄유래 줄기세포는 평균 10번의 계대배양 후 senescence를 나타냈다. 세포의 형태는 7번째 계대배양 이후 세포질이 넓어지고 세포의 크기가 커지는 변화를 나타냈으며 PDT가 증가하기 시작하였다. 계대배양 4, 8, 10번째 시기의 세포의 mRNA 변화를 분석한 결과 Oct-4, HNF-4${\alpha}$, mRNA는 10번째 계대배양까지 지속적으로 발현하였으나 nestin, vimentin mRNA는 지속적으로 발현이 감소하였고 SCF mRNA는 지속적으로 발현이 감소하였다. 이에 반해 HLA-DR${\alpha}$, Pax-6, BMP-2 mRNA는 모든 계대배양 시기의 세포에서 발현되지 않았다. 면역세포화학 분석법을 통한 3, 6, 9번째 계대배양 세포의 단백질 발현 분석 결과 SSEA-3와 SSEA-4는 3, 6, 9번째 계대배양 세포 모두에서 발현하였으나 ICAM-1과 HLA-ABC는 계대배양이 증가함에 따라 발현이 증가되었다. Thy-1 단백질은 p9에서 발현이 증가되었으며 이와 반대로 TRA-1-60와 VCAM-1 단백질은 p6과 p9 시기에 발현이 감소되었다. HLA-DR 단백질은 모든 계대배양 시기에 발현되지 않았다. 결 론: 본 연구결과 탯줄유래 줄기세포는 체외 배양 시 줄기세포 특성이 일부 변하는 것을 관찰하였다. 앞으로 줄기세포의 특성을 유지할 수 있는 체외 배양법의 발달을 위한 연구들이 수행 되야 할 것으로 사료된다.

• 대한소아치과학회지
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• 제48권3호
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• pp.291-301
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• 2021

이 연구의 목적은 발거 된 매복 상악 과잉치에서 얻은 치수유래 줄기세포의 초기 계대와 후기 계대의 상아질모세포 유전자의 특성을 알아보는 것이다. 전신 의과 병력이 없는 6 - 9세 사이의 남녀아이 12명에게서 서면동의를 얻고 모두 상악에 위치한 과잉치를 발거하여 당일 발거된 과잉치의 치수세포를 채취하였다. 12개의 세포를 각각 3계대와 10계대에서 골형성 유도 분화제를 처리한 군과 처리하지 않은 군을 나누어 실시간 중합효소 연쇄반응을 시행하여 상아질모세포의 특성을 알아보았다. 사용된 유전자는 osteonectin (ONT), alkaline phosphatase (ALP), osteocalcin (OCN), dentin matrix protein 1 (DMP-1), 그리고 dentin sialophosphoprotein (DSPP)였다. 유전자 발현양은, 분화제를 처리하지 않은 군 3계대에서는 ONT, ALP, OCN, DMP-1, DSPP순서로 많이 발현하였다. 분화제를 처리하지 않은 군 10계대에서는 ONT, DMP-1, OCN, ALP, DSPP순으로 ONT, OCN, DSPP의 순서에는 변화가 없지만 ALP, DMP-1의 순서는 서로 바뀌었다. 이상의 결과를 종합해 볼 때, ALP와 DMP-1은 3계대와 10계대 세포의 분화를 위한 중요한 표지자로 사용될 수 있다. 과잉치 치수유래 줄기세포는 상아질모세포의 특성을 가지며, 또한 과잉치가 어린 나이에 발거되고 10계대까지 소요되는 시간이 적게 걸린다는 것을 고려하면, 과잉치는 치아 유래 줄기세포의 공여부로서 훌륭한 활용가능성이 있음을 확인하였다.

• 대한소아치과학회지
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• 제46권2호
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• pp.219-225
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• 2019

이 연구의 목적은 과잉치 치수 유래 줄기세포의 계대 배양 속도에 대한 상아모세포 연관 유전자의 발현을 비교하는 것이다. 줄기세포는 다른 여러 형태의 세포로 분화할 수 있는 미 분화된 세포이다. 이는 환경이나 특정 자극에 의해 세포 분열이 일어나며 근육이나 골 같은 특정 장기의 조직으로 분화할 수 있다. 20명의 어린이에서 발거한 과잉치에서 과잉치 치수 유래 줄기세포가 얻어졌다. 10계대까지 배양하는 동안 가장 빠른 속도로 계대 배양된 세포와 가장 느린 속도로 계대 배양된 세포 각 3계대와 10계대 세포를 얻어 실험을 진행하였다. 각 세포는 분화제를 처리한 군과 처리하지 않은 군으로 나누었다. 이 실험에서 발현도를 살펴본 유전자는 Osteonectin (ONT), Osteocalcin (OCN), Alkaline Phosphatase (ALP), Dentin matrix acidic phosphoprotein 1 (DMP-1), Dentin sialophosphoprotein (DSPP)이다. 분화가 된 세포가 전반적으로 더 높은 유전자 발현도를 보였으며, 미분화 세포는 10계대에서, 분화된 세포는 3계대에서 더 높은 유전자 발현도를 보였다. 빠른 계대 배양 속도를 보인 세포가 OCN과 DSPP를 제외하고 상대적으로 더 낮은 유전자 발현도를 보였다.

• 월간양계
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• 제41권11호
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• pp.162-165
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• 2009

• 대한소아치과학회지
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• 제43권4호
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• pp.419-426
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• 2016

본 연구는 상악 매복 과잉치를 가지고 전신질환 및 의과 병력이 없는 만 5 - 9세 사이의 남녀 20명으로부터 서면동의를 얻고 상악 전치부에 매복된 과잉치를 발치하고 치수세포를 채취하였다. 채취 후 세포의 1차 배양 동안 오염된 3명(남자 2명, 여자 1명)을 제외하고 총 17명(남자 10명, 여자 7명)을 대상으로 하였다. 이번 연구에서 과잉치 치수조직으로부터 유래한 세포의 계대 배양에 소요된 평균 시간은 $2.91{\pm}0.29$일이었다. 최초 치수조직으로부터 세포를 얻은 후 80% confluency를 얻는데 소요되는 시간이 $4.53{\pm}0.94$일로 가장 많이 걸렸고, 이후 계대부터는 $2.73{\pm}0.32$일이 소요되었다. 남자의 비율은 58.82%, 여자의 비율은 41.18%이었다. 여자의 평균 소요시간은 $2.81{\pm}0.27$일 이었으며, 남자는 $2.98{\pm}0.29$이었다. 과잉치가 역위된 비율은 82.35%, 정위 비율은 17.65%였다. 평균 계대 소요 배양 시간은 역위가 $2.94{\pm}0.30$일, 정위는 $2.80{\pm}0.20$일이었다. 원뿔형(Conical type)은 76.47%였고, 그 외 형태는 23.53%였다. 원뿔형의 평균 소요시간은 $2.92{\pm}0.31$이었고, 그 외 형태의 소요 시간은 $2.88{\pm}0.22$이었다. 매복 방향과 형태에 따른 계대 배향 시간은 통계적으로 유의한 차이를 보이지 않았다. 향후 초기 계대와 후기 계대에서 얻어진 세포의 줄기세포로써의 능력을 평가하는 후속 연구들이 필요하며, 3일 이내의 계대 배양 시간이 소요된 점을 고려할 때, 연구의 효율성과 빠른 배양시간 등은 과잉치 유래세포가 치아유래 줄기세포의 연구에 활용가능성이 충분하리라 판단되었다.

• Parasites, Hosts and Diseases
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• 제36권3호
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• pp.191-198
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• 1998

톡소포자충의 pyrimethamine (PBM)과 methotrexate (MYX)에 대한 효소활성 및 유전자 발현 의 변화를 살펴본 결과 두 약제를 처리한 경우 모두 약제 농도의 증가에 따라 생존력이 감소하였으며, 계대가 진행에 따라 DHFR 효소활성은 증가하였다. PBM의 경우, 0.01 mM을 사용한 1차 계대시 효소 활성이 33.9%를 나타낸 반면, 10배로 농도를 증가시킨 4차 계대에서는 63.5%로 약 2배 증가하였다. WIBC의 경우에는 1차 계대시 77.4% ($1{\;}{\mu\textrm{m}}$), 4차 계대시 82.2% ($10{\;}{\mu\textrm{m}}$), 7 차 계대시에는 141.3% ($100{\;}{\mu\textrm{m}}$)로 1차 계대와 비교하여 볼 때 효소활성이 약 183% 증가한 것으로 나타났다. 특히 DHFRWIRNA의 양은 4차 계대시에 1차 계대시와 비교하였을때, PBM 농도 증가에 따라 각각 1. 5배 이상씩 증가하였으며, WRC의 경우 역시 rnRNA양의 변화는 관찰되었으나, 그 변화에 따른 유의성은 없었다. 이상의 결과로 PlM에 대한 톡소포자충의 반응은 DHFR 효소환성 증가 및 mRNA 수준 즉, transcriptional love떼서 조절되는 것임을 알 수 있었으며, Mn(에 대한 톡소포자충의 반응은 DHFR 효소활성 증가에 기인하나, PW에 의해 유발되는 반응과는 다른 약제 극복 기전이 존재하는 것으로 추정되었다.

• Current Research on Agriculture and Life Sciences
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• 제9권
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• pp.21-28
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• 1991

벼 완숙현미(完熟玄米)의 배(胚)로부터 유기(誘起)된 callus의 계대배양(繼代培養)에 영향(影響)을 미치는 계대배양(繼代培養) 회수(回數), 기간(期間) 및 배지내(培地內)에 첨가(添加)되는 생장조정제(生長調整劑)의 조성(組成) 등(等)과 같은 몇가지 요인(要因)에 대한 실험(實驗)을 수행(遂行)하여 얻어진 결과(結果)는 다음과 같다. 벼 callus의 계대배양(繼代培養)은 4주간격(週間隔)보다는 2주간격(週間隔)으로 배양(培養)하는 것이 효과적(效果的)이었고 식물체(植物體) 재분화율(再分化率)은 품종(品種)과 계대배양(繼代培養) 기간(期間)에 따라 크게 상이(相異)한 것으로 나타났다. "영덕(盈德)벼"의 경우는 2주간격(週間隔)으로 4회(回) 계대배양(繼代培養)된 callus에서 72.5%의 가장 높은 재분화율(再分化率)을 보였으며, 4주간격(週間隔) 2회(回) 계대배양(繼代培養)된 callus에서도 58.3%의 재분화율(再分化率)을 보였다. Callus유기(誘起) 배지(培地)에 CH(2g/1), MI(200mg/1), TH(2mg/1)등(等)을 첨가(添加)하면 callus생장량(生長量)도 많았고 식물체(植物體) 재분화율(再分化率)도 향상(向上)되었으며, 식물체(植物體) 재분화(再分化)에는 kinetin단용(單用)보다는 kinetin과 NAA를 혼용(混用)하는 것이 효과적(效果的)인 것으로 나타났다. Callus 계대배양(繼代培養)에 CH, MI, TH 등(等)을 첨가(添加)한 배지(培地)를 이용(利用)하면 embryogenic callus의 발생량(發生量) 증가(增加)하는 경향이었고 품종(品種)에 따라서는 식물체(植物體) 재분화율(再分化率)도 높게 유지(維持)되는 것으로 나타났다.