Evaluation of the Antioxidant Efficacy of Padina boryana Extract from Maldivian Seaweed from Laccadive Sea Area

라카디브 해역 몰디브 자생 해조류 Padina boryana 추출물의 항산화 효능 평가

Abstract

Global warming has affected the distribution of organisms for decades and has displayed rapid ascent recently. Research into the effects on tropical organisms are vital. Padina boryana is a resourceful marine microalgae in the Maldives Sea in the Laccadive region. A 70% ethanol extraction (PBE) of this seaweed was used to investigate its antioxidant potential. Both in vitro and in vivo models were implemented. PBE exhibited protective potential against H₂O₂ induced apoptosis. ROS levels were suppressed due to PBE. PBE expressed a cytoprotective nature. In vivo experiments involving the zebra fish model conformed its validity. The antioxidant efficacy of PBE was dose dependent. Study outcomes suggest PBE has potential as a novel and valuable marine resource to aid the functional food and cosmeceutical industries.

서론

인도 연안과 스리랑카 섬의 인도양 가장자리는 라카디브해 (Laccadive sea)로 표시된다. 라카디브해는 평균 수심이 2,000 m에 이르며 최대 4 m 높이의 언덕과 환초가 있고 얕은 물에서는 바닥이 모래로 덮여 있다. 빈번한 온도 변화가 일반적이고 섬에 습도는 80%로 봄과 여름은 매우 덥고 길며 겨울은 온화하다. 라카디브해는 몰디브에 위치한 많은 리조트 덕분에 세계적으로 명성을 얻었다. 몰디브는 1,190여개의 작은 산호섬으로 이루어져 있는데, 그 가운데 200여개의 섬에만 사람이 거주한다. 몰디브는 인간의 손때가 묻지 않은 자연이 보존되고 있기 때문에 청정의 이미지가 강하다. 그렇기 때문에 많은 연구자들은 청정한 몰디브 소재를 활용한 연구에 관심을 나타내고 있다. 현재까지 몰디브 해역의 해양생물 연구는 정도가 미비한 상황으로 꾸준한 연구가 필요한 실정이다. 해양생물 중 해조류는 바다에서 나는 조류를 총칭하는 것으로서, 함유된 색소에 따라 색깔이 달라져 녹조류, 갈조류, 홍조류 등 3가지로 분류된다(Heo et al., 2005a). 녹조류는 클로로필(chlorophyll)을 함유하고 있어 녹색을 띠고, 갈조류는 클로로필(chlorophyll)과 푸코잔틴(fucoxan-thin)을 함유하여 갈색, 홍조류는 클로로필(chlorophyll)과 피코 에리스린(phycoerythrin), 피코시아닌(phycocyan)을 함유하여 홍색이나 흑자색을 띤다(Yalcin et al., 2020). 최근 해조류 자원으로부터 인간 생활에 유용한 생리활성 물질을 얻으려는 시도가 지속되고 있으며, 해양 천연물 신약이라는 용어가 나올 만큼 해조류 유래 천연물을 이용한 생물 소재 개발이 주목 받고 있다(Choi et al., 2019). 이전 연구들에서 해조류 유래 천연물의 우수한 항산화 연구들이 확인된다(Heo et al., 2005b; Kang et al., 2019; Kim et al., 2020b).

활성산소종은 체내에 여러 대사과정에 의하여 생성되거나 여러가지 작용들에 의해서 생성되게 되는데, 활성산소종의 생성은 노화 및 성인병과 같은 여러가지 질병들의 원인이 된다(Ko et al., 2017). 여러가지 합성 항산화제들은 이러한 활성산소종의 생성 억제에 많이 사용되고 있지만 부작용과 독성이 발견 되기 때문에 합성 물질을 대체하기 위한 천연 항산화제 발굴은 아주 필수적이다. 본 연구에서는 최근 다양한 생리활성 연구가 이루어지는 갈조류 부챗말 종을 활용한 연구를 진행하였다. 부챗말은 탈모방지 효능(Kang et al., 2020), 미백 효능(Kim et al., 2020a), 혈관보호 효능(Park et al., 2008)등의 연구가 최근 보고됐다. 이러한 사전연구를 통해 다양한 2차 대사산물을 포함하고 있을 것이라 예상되는 부챗말을 이용하여 H₂O₂ 산화 유도된 세포와 동물모델에서 항산화 효능 평가를 진행하였다.

따라서, 본 연구에서는 몰디브 해안에서 채집한 부챗말(Padi-na boryana)의 70% EtOH 추출물(70% ethanol extract, PBE)을 제조한 다음 추출물의 산화 보호 효능을 확인하기 위해 산화 유도된 vero 세포와 zebrafish에 추출물을 처리하여 생존률과 ROS 소거율 확인을 통해 P. boryana의 우수한 항산화 효능을 입증하였다.

재료 및 방법

실험시약 및 재료

본 실험에서는 몰디브 홀리데이섬에서 채취한 부챗말(Padina boryana)을 수세하여 동결건조기를 이용해 건조시켜 분쇄 후 분말형태로 만들어 사용하였다. 추출을 위해 ethanol (Daejung Chemicals and Metals Co., Seoul, Korea)을 구매하여 사용 하였고 항산화 활성을 확인하기 위하여 2’, 7’-dichlorodihy- droflurescin diacetate (DCFH-DA), 3-(4, 5-dimethylthiazol- 2yl)-2, 5-diphenyltetrazolium bromide (MTT), dimethyl sulf-oxide (DMSO), H₂O₂, 1, 3-bis(diphenylphosphino) propane (DPPP)는 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)에서 구입하여 사용하였다. RPMI-1640 medium, Dulbecco’s modified Ea- gle medium (DMEM), penicillin/streptomycin 및 fetal bovine serum (FBS)는 Gibco BRL (Life Technologies, Burlington, ON, Canada)에서 구입하여 사용하였다. 그 외 기타 시약은 분석용 특급 시약을 구입하여 사용하였다.

추출물 제조

P. boryana 분말 50g을 취하여 삼각 플라스크에 넣고 70% ethanol 1L를 첨가해 상온에서 24시간동안 교반기에 넣고 총 3회 반복 추출하였다. 이후 필터 후 회전 진공 농축기로 농축하여 ethanol 추출물을 얻었다. 수율을 측정하기 위해 추출물 1mL을 건조된 수율 측정용 펜에 담아 건조 오븐에 24시간동안 보관하여 전, 후 무게의 차이를 이용하여 측정하였다.

세포배양

Vero cell (Korean Cell Line Bank, Seoul, Korea)은 10% FBS, 1% antibiotic을 포함하는 RPMI 1640 배지를 사용하여 배양하였다. Cell culture flask에 적정 농도로 37°C, 5% CO₂ 조건에서 세포 상태에 따라 2-3일간 계대 배양하여 실험에 사용하였다.

Vero cells에서의 세포독성 측정

시료에 대한 세포독성을 확인하기 위해 Kim et al. (2020b)의 방법을 따라 MTT [3-(4, 5-dimethylthiazol-2yl)-2, 5-diphen- yltetrazolium bromide] assay 방법으로 측정하였다. 먼저 vero cells (1×10⁵ cells/mL)으로 96 well plate에 190 μL를 분주하고, 37°C, 5% CO₂ 조건에서 24시간 배양하여 시료들을 농도 별로 처리하였다. 이후 37°C 인큐베이터에서 24시간 배양하였으며 2 mg/mL 농도의 MTT를 50 μL 처리하였다. 그리고 37°C에서 3시간 배양하고 형성된 불용성 결정을 dimethylsufoxide (DMSO)로 완전히 녹인 후에 빛을 차단시켜 12시간 보관 후 ELISA reader (Genios Pro, Tecan, Austria)를 사용하여 540 nm 흡광도에서 측정한 뒤 값을 구하였다.

Vero cells에서의 ROS 생성 측정

산화적 스트레스를 유도하였을 때 PBE에 의한 ROS (reactive oxygen species) 소거능을 확인하기 위해 Kim et al. (2020b)의 방법에 따라 H₂O₂ 자극을 주어 ROS의 변화를 측정하였다. 먼저 1×10⁵ 세포 농도의 vero cells을 만들어 96 well plate에 180 μL를 분주하였고, 37°C 인큐베이터에서 24시간 배양하여 시료들을 농도 별로 처리하였다. 이후 37°C 인큐베이터에서 30분 배양하여 1 mM H₂O₂ 10 μL를 처리하였고, 37°C 인큐베이터에서 30분간 반응시켜 0.05% DCF-DA ethanol 용액을 10 μL 처리하고 빛을 차단시켜 37°C 인큐베이터에서 10분간 반응시킨 후 ELISA reader를 사용하여 측정하였다.

Vero cells에서 H₂O₂에 의한 산화적 손상에 대한 보호 효과 측정

H₂O₂로 세포에 산화적 스트레스를 유도하였을 때 PBE의 보호효과에 대한 활성을 확인하기 위해 Kim et al. (2020b)의 방법을 따라 H₂O₂ 자극을 주어 시료처리에 대한 세포 생존력을 측정하였다. 먼저 1×10⁵ 세포 농도의 vero cells을 만들어 96 well plate에 180 μL를 seeding 하였고, 37°C 인큐베이터에서 24시간 배양하였으며 시료를 농도 별로 처리하였다. 이후 37°C인 큐베이터에서 1시간 배양하였으며 1 mM H₂O₂ 10 μL를 처리하였다. 그 다음 37°C 인큐베이터에서 24시간 배양하였으며 2 mg/mL 농도의 MTT를 50 μL 처리하였다. 이후 37°C 인큐베이터에서 3시간 반응시켜, 후에 형성된 불용성 결정을 DMSO로 완전히 녹여 빛을 차단시키고 12시간 보관 후에 ELISA reader를 사용하여 540 nm 흡광도에서 측정한 뒤 값을 구하였다. 대 조구는 시료처리 없이 산화적 스트레스만 유도시킨 실험군과 산화적 스트레스를 유도시키지 않은 실험군으로 구분하였다.

Zebrafish embryo에서의 H₂O₂ 산화 보호효과 측정

Zebrafish는 인간과 유전적 상동성이 유사한 척추동물로서 초기 발생 단계에서 산화적 스트레스를 유도하였을 때 시료 처리에 의한 산화 보호 효과를 확인하고자 시간 경과에 따른 생존율 변화와 cell death, ROS 생성량을 측정하였다(Yang et al., 2018). 7-9 hpf (hours post-fertilization)에 zebrafish embryo를 12 well plates에 각각 15마리씩 넣어준 뒤 embryo medium 1.8 mL을 맞추고 농도별(25, 50, 100 μg/mL) 시료를 100 μL씩 처리하였다. 1시간 노출시킨 후 10 mM 농도의 H₂O₂를 100 μL 처리하였고 이후 생존율 변화를 관찰하였다. 세포사멸 측정은 acridine orange 염색법을 이용해 살아있는 embryo에서 확인하였고, ROS 생성량은 zebrafish embryo에서 산화 반응이 일어나는 부분에 선택적으로 염색 시키는 DCFH-DA 시약, lipid peroxidation은 DPPP [1, 3-bis(diphenylphosphino) propane] 염색법을 이용하였다. CoolSNAP-Pro dolor 디지털 카메라가 장착된 형광 현미경(Olympus Life Science, Tokyo, Japan)으로 관찰하고 촬영하였으며, 촬영한 각각의 zebrafish embryo의 형광 강도를 image J program을 사용하여 정량화 하였다. 대조구는 시료처리 없이 산화적 스트레스만 유발시킨 실험군과 산화적스트레스를 유도시키지 않은 실험군으로 하였다. Zebraf-ish 실험은 제주대학교 동물 관리 및 사용 위원회(승인번호 No. 2019-O-0074)의 승인을 받았다.

통계분석

실험결과의 통계처리는 각각의 시료에 대한 평균±표준편차로 나타내었다. SPSS프로그램(Ver. 12.0, SPSS Inc., Chicago, IL, USA)을 사용하여 Oneway ANOVA-test를 실시하였다. 조사 항목들 간의 유의성 검증은 Turkey’s multiple range test로 P<0.05 수준에서 실시하였다.

결과 및 고찰

P. boryana 추출물 제조 및 세포 내 H₂O₂ 산화 보호 효과

P. boryana의 70% EtOH 추출 수율은 약 5%로 이전 연구결과와 유사한 수치가 확인되었다(Jayawardena et al., 2020). 이전 연구 결과에서 PBE의 total polyphenol 함량은 8.84%로 확인되고 total polysaccharide와 proteins 함량은 각각 1.26%, 1.31%로 확인된다(Jayawardena et al., 2020). PBE에 다량 함유된 폴리페놀은 산화를 방지하는 항산화 기능을 가지고 있다고 알려져 있다. 폴리페놀 화합물은 flavonoids, anthocyanins, tannins, catechins, isoflavones, lignans, resveratrols 등을 총칭하며, 해양식물인 갈조류에는 tannins들이 다량 함유되어 있다 (Dai and Mumper, 2010). PBE도 우수한 폴리페놀 함량으로 다량의 tannins들을 포함하고, 우수한 항산화 효능이 있을 것으로 예상되어 vero 세포를 H₂O₂ 산화 유도해 세포 내 산화 보호 효과를 측정하였다. PBE의 산화 보호 효능을 위한 세포 실험은 MTT assay 법을 사용하였다. MTT assay 법은 MTT 시약이 세포 내로 흡수되면 미토콘드리아의 숙신산탈수소효소(succinate dehydrogenase)에 의해 보라색의 불용성 포르마잔(formazan)을 형성하는데 이 물질의 세포 내 축적은 미토콘드리아의 활성, 넓게는 세포의 활성을 의미하므로 세포의 생장률 및 살아있는 세포수의 측정에 사용되는 대표적인 방법이다 (Yang and Boo, 2013). PBE의 독성이 없는 농도 25, 50, 100 μg/mL 시료를 1 mM H₂O₂로 산화 유도된 vero 세포에 처리하여 세포 생존률을 확인하였다. 그 결과, PBE가 농도의존적으로 H₂O₂ 산화에 의한 세포 보호효과가 있음을 확인하였다(Fig. 1A). 그리고 세포 내 H₂O₂ 산화에 의한 ROS 생성 정도를 측정한 결과로, 세포 보호효과와 마찬가지로 PBE가 농도의존적으로 H₂O₂에 의한 세포 내 ROS 생성을 줄여 주는 것이 확인되었다(Fig. 1B). Apoptosis를 통한 세포사망의 변화를 현광현미경을 통해 분석하였다. Hoechst 33342 염색을 통해 세포핵의 변화를 확인하였고, H₂O₂를 처리하였을 때 핵의 크기가 작아지는 응축과정과 세포의 진한 염색비율이 정상군(control)에 비해 크게 증가하는 것이 관찰되어 손상된 세포들이 apoptosis 과정을 거치고 있음이 확인되었다(Fig. 2). 이 조건에 PBE를 농도 별로 처리하였을 때, 세포핵의 응축과정과 염색정도가 H₂O₂ 처리 그룹에 비해 감소하는 것을 확인할 수 있었다(Fig. 2). 특히 100 μg/mL 그룹에서 apoptosis의 특징이 뚜렷히 감소함이 확인되 었다. 이러한 결과들은 다량의 폴리페놀이 함유된 PBE가 H₂O₂ 에 의해 apoptosis가 유도된 vero 세포에서 우수한 ROS 억제와 세포생존률 보호 효과가 있음을 확인하였다.

Fig. 1. Protective effects of PBE against H₂O₂-induced cell death in vero cells (A) and intracellular reactive oxygen species (ROS) scaveng-ing activities of PBE against H₂O₂-induced oxidative stress in vero cells (B). *P<0.05, **P<0.01 as compared to the H₂O₂-treated group and ^##P<0.01 as compared to the control group. PBE, 70% ethanol extract.

Fig. 2. The apoptotic body formation was observed under a fluorescence microscope after Hoechst 33342 staining.

P. boryana 추출물의 zebrafish 생존율 및 심박수 변화 측정

동물모델로서 zebrafish는 포유류와 생리적 유사성으로 다양한 실험 모델로 사용되고 있으며, 공간의 제약을 받지 않는 작은 크기, 대부분 조직 및 장기의 단시간 형성되는 빠른 발생과정, 대량으로 쉽게 확보할 수 있는 투명한 수정란, 낮은 비용 등의 장점을 가지고 있다(Kim et al., 2016). PBE의 zebrafish 발달 변화(생존률, 심박수)에 미치는 영향을 알아보기 위해 PBE의 농도별 시료를 10 mM H₂O₂와 함께 처리하여 현상을 관찰 하였다. 그 결과, PBE의 100 μg/mL 농도에서 대조구와 비교해 유의적인 embryo 생존률 보호효과가 확인되었다(Fig. 3A). Zebrafish의 심장은 처음 발달되고 기능을 발휘하는 기관으로 생리적 상관관계에서 심장 박동수는 zebrafish의 대사성 질환 을 예측하는데 사용된다(Wang et al., 2014). PBE의 zebrafish 내 기능을 탐색 하고자 심박수를 확인한 결과, 대조구와 비교하였을 때 생존률과 마찬가지로 100 μg/mL 농도에서 유의적인 심박수 감소를 확인할 수 있었다(Fig. 3). 이러한 결과는 PBE가 H₂O₂ 산화로 인한 zebrafish 내 다양한 기능 장애로 인한 폐사를 보호하고 심박수를 낮춰 줌으로써 산화 보호효과가 있음을 확인할 수 있었다.

Fig. 3. The survival rate (A) and heart-beating rate (B) after pretreatment with or without PBE in zebrafish Danio rerio exposed to H₂O₂. The experiments were conducted in triplicate, and the data were expressed as the mean±standard error (S.E). *P<0.05, **P<0.01 as compared to the H₂O₂-treated group and ##P<0.01 as compared to the control group. PBE, 70% ethanol extract.

P. boryana 추출물의 zebrafish 내 cell death, ROS와 lipid peroxidation 생성량 변화 측정

앞에서 PBE의 zebrafish 생존율 보호와 심박수 저해 관찰을 통해 산화 보호 작용을 확인하였고, 이어서 acridine orange 염색법, DCFH-DA 염색법과 DPPP 염색법을 통해 세포사멸, ROS 생성과 지질과산화 생성량을 관찰하였다. Acridine orange는 핵산을 선택적으로 염색시켜 세포사멸을 연구하는데 유용하며 이전 연구들에서는 acridine orange 염색법을 통해 zebrafish의 심장 이상을 확인하였다(Deng et al., 2009). Acridine orange 염색이 된 zebrafish를 형광현미경을 이용해 관찰했을 때 H₂O₂를 이용해 산화 유도된 그룹에서는 난황을 비롯하여 망막, 소뇌, 척수, 근육 등 거의 모든 부위에 흡수가 되는 것이 관찰되는 반면 PBE를 처리한 그룹들에서는 특이적으로 형광이 줄어듬 을 이미지를 통해 확인할 수 있었다(Fig. 4). 형광 정도를 그래 프를 통해 분석했을 때도 마찬가지로 PBE의 농도의존적으로 zebrafish 형광 정도가 줄어 H₂O₂ 산화에 대한 보호효과가 있음을 확인하였다. 따라서, PBE의 zebrafish 내 세포 산화 보호효과로 zebrafish의 생존율 보호가 이루어짐을 확인할 수 있었다.

Fig. 4. Protective effect of PBE on cell death in H₂O₂-induced zebrafish Danio rerio embryos. Fluorescence intensity of images was measured using the ImageJ software. The experiments were conducted in triplicate, and the data were expressed as the mean±standard error (S.E). *P0.01 as compared to the control group. PBE, 70% ethanol extract.

ROS가 항산화 효소들의 작용 범위를 초과하여 과산화지질을 형성하면 세포막을 손상시키고, 유전자변형으로 인한 세포 사멸을 유도한다(Kim et al., 2018). 또한 염증성 사이토카인의 분비를 촉진하여 matrix metalloproteinases의 합성을 증가시켜 콜라겐과 엘라스틴의 분해를 촉진해 주름, 색소침착, 탈수 등의 피부노화를 일으키고 그와 더불어 백내장, 치매, 암과 같은 질병들의 원인이 된다(Jang et al., 2018). 따라서, 우리는 다양한 질병의 원인이 되는 ROS 억제 효능을 zebrafish DCFH-DA 염색 방법을 통해 확인하였다. 이러한 염색법은 H₂O₂로 유도된 zebrafish에 DCFH-DA가 세포 내로 투과된 후 아세틸기가 유리된 DCFH의 형태에서 ROS와 반응하여 형광물질을 생성하는 성질을 이용하였다(Kim and Bak, 2015). PBE를 처리하였을 때 H₂O₂만 처리한 양성대조군과 비교하여 농도의존적으로 형광의 세기를 줄여 줌을 이미지와 그래프를 통해 확인할 수 있었다(Fig. 5). 이러한 결과를 통해 다양한 질병들의 원인이 되는 ROS를 PBE가 효과적으로 줄여주는 것이 확인되었다.

Fig. 5. Protective effect of PBE on reactive oxygen species (ROS) in H₂O₂-induced zebrafish Danio rerio embryos. Fluorescence intensity of images was measured using the ImageJ software. The experiments were conducted in triplicate, and the data were expressed as the mean±standard error (S.E). *P<0.05, **P<0.01 as compared to the H₂O₂-treated group and ^##P>0.01 as compared to the control group. PBE, 70% ethanol extract.

지질 과산화 및 DNA 손상은 활성산소 생성, 세포 사멸 및 괴사 발생의 공통적인 결과를 초래한다(Ohinata et al., 2003). 활성산소들이 과량 생성되면 생체 세포막 구성성분인 다가 불포화지방산을 공격하여 과산화 지질이나 산화분해물이 생체내 축적되고 축적된 과산화지질은 일시적 혹은 영구적으로 생체에 손상을 주어 단백질, 효소, DNA 손상을 일으킨다. 이런 작용들은 여러 가지 질환들의 매개가 되어 동맥경화증, 류마티스성 관절염, 염증 등 각종 성인병과 암을 유발시키는 원인으로 알려져 있으며, 이 외에도 노화의 원인이 된다고 알려져 있다(Ignarro et al., 1999). PBE를 H₂O₂ 산화 유도한 zebrafish에 처리하여 lipid peroxidation 억제 효능을 평가한 결과로, 양성대조군과 비교하여 농도의존적으로 lipid peroxidation 생성량을 줄여주는 것이 확인되었다(Fig. 6). 이러한 결과는 PBE 샘플이 다양한 생체 손상의 원인으로 질환들의 매개가 되고 노화의 원인이 되 는 lipid peroxidation을 효과적으로 줄여줌으로써 우수한 항산화 효능이 있음을 확인할 수 있었다.

Fig. 6. Protective effect of PBE on lipid peroxidation in H₂O₂-induced zebrafish Danio rerio embryos. Fluorescence intensity of images was measured using the ImageJ software. The experiments were conducted in triplicate, and the data were expressed as the mean±standard error (S.E). *P<0.05, **P<0.01 as compared to the H₂O₂-treated group and ^##P>0.01 as compared to the control group. PBE, 70% ethanol extract.

본 연구의 목적은 라카디브 해역 몰디브에서 채집한 부챗말의 항산화 효과를 평가하기 위한 것으로서 70% ethanol을 이용해 추출물을 제조하였고 항산화 효과를 H₂O₂ 산화 유도된 vero 세포와 zebrafish에서 세포 생존율과 ROS, cell death, lipid peroxidation의 저해율을 통해 확인하였다. 결과, PBE가 효과적으로 vero 세포에서 생존율을 높이는 것을 MTT assay법과 현광 현미경 관찰을 통해 확인할 수 있었고, ROS 또한 효과적으로 줄여주는 것을 확인할 수 있었다. 이어서 zebrafish 내 산화 작용과 관련되는 cell death, ROS와 lipid peroxidation을 형광 현미경 관찰로 산화 작용을 효과적으로 줄여주는 것이 확인되어 in vivo에서도 우수한 항산화 활성이 있음을 확인 할 수 있었다. 열대지역의 자생 식물인 몰디브 부챗말의 결과는 온대성 기후 변화로 인한 국내 자생 해양식물들의 변화에 대비해 추후 우리 나라에 자생하게 될 해양식물들의 사전 연구결과로 사용이 가능할 것이다. 또한 국내 근연 종들의 연구결과들과 비교를 통해 부챗말 종들의 연구에도 많은 도움이 될 것이고, 건강기능식품, 향장 소재로서의 가능성을 확인할 수 있다.