Korean Journal of Fisheries and Aquatic Sciences (한국수산과학회지)

The Korean Society of Fisheries and Aquatic Science (한국수산과학회)
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Anti-Inflammatory Effect of Hexane Fraction from Eisenia bicyclis on Lipopolysaccharides-Treated RAW 264.7 Cells

LPS로 유도된 RAW 264.7 대식세포에 대한 대황(Eisenia bicyclis) 헥산 분획물의 항염증 효과

  • Kim, Bowoon (Department of Food Science and Nutrition, Pukyong National University) ;
  • Choi, Chang-Geun (Department of Ecological Engineering, Pukyong National University) ;
  • Kim, Jae-Il (Department of Food Science and Nutrition, Pukyong National University) ;
  • Kim, Hyeung-Rak (Department of Food Science and Nutrition, Pukyong National University)
  • 김보운 (부경대학교 식품영양학과) ;
  • 최창근 (부경대학교 생태공학과) ;
  • 김재일 (부경대학교 식품영양학과) ;
  • 김형락 (부경대학교 식품영양학과)
  • Received : 2021.01.29
  • Accepted : 2021.02.19
  • Published : 2021.04.30
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Abstract

Eisenia bicyclis is known to have secondary metabolites exhibiting various biological activities. In a preliminary study, the n-hexane fraction obtained from the ethanolic extract of E. bicyclis showed higher anti-inflammatory activity than the ethyl acetate and butyl alcohol fractions based on the inhibition of lipopolysaccharide (LPS)-stimulated nitric oxide (NO) production in RAW 264.7 cells. Using this fraction (E. bicyclis hexane fraction, EHF), we investigated the molecular mechanisms underlying its anti-inflammatory effect in LPS-stimulated RAW 264.7 cells. Pretreatment of the cells with up to 50 ㎍/mL EHF significantly inhibited NO and prostaglandin E2 production as well as their responsible enzyme proteins and mRNAs, in a dose-dependent manner (P<0.05). Similarly, EHF markedly reduced the production of pro-inflammatory cytokines, such as interleukin (IL)-1β, IL-6 and tumor necrosis factor (TNF)-α as well as their mRNA levels. Nuclear translocation of nuclear factor-kappa B (NF-κB) was strongly suppressed by EHF treatment. EHF significantly reduced the phosphorylation of mitogen-activated protein kinases and phosphatidylinositol 3-kinase/Akt in LPS-stimulated cells. Moreover, EHF reduced ear edema in phorbol myristate acetate (PMA)-induced mice. These results indicate that EHF contains potent anti-inflammatory compounds, which may be used as a dietary supplement for the prevention of inflammatory diseases.

Keywords

서론

염증 반응은 미생물 감염, 내독소, 조직 손상과 같은 위해성 자극에 대한 방어기능으로, 이는 생명체의 구조와 기능을 정상적으로 유지시키기 위한 방어기능이다. 염증반응은 시간이 지남에 따라 염증 촉진성 매개체들의 생성은 감소되고, 항염증성 매개체들이 증가됨으로써 스스로 염증반응이 억제되는 조절 기전을 가지고 있다(Libby and Hansson, 2015). 대식세포(macro-phages)는 체내의 염증반응에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 대식세포는 interferon-γ (IFN-γ), interleukin (IL)-1β, IL-6, tumor necrosis factor-α (TNF-α)와 같은 염증 촉진성 cy- tokines, 그리고 세균 세포막성분인 lipopolysaccharides (LPS) 등의 자극에 의해 활성화된다(Xie et al., 1994). 활성화된 대식세포는 염증 촉진성 cytokines 이외에 inducible nitric oxide synthase (iNOS) 및 cyclooxygenase-2 (COX-2)와 같은 효소의 발현을 통해 nitric oxide (NO) 및 prostaglandin E2 (PGE2)와 같은 다양한 염증 매개 분자들을 생성하게 되고(Marks-Konczalik et al., 1998; Zhang and Ghosh, 2000), 이들 매개체들의 지속적인 생성은 다양한 만성염증성 질환의 주요한 원인으로 알려져 있다. 부작용이 적은 항염증 활성을 지닌 천연물의 발견은 염증 치료제 개발을 위한 방편으로 관심을 끌고 있다.

대식세포의 염증 촉진성 cytokines 및 단백질들의 발현은 nuclear factor kappa-B (NF-κB)에 의해 전사 수준에서 조절된다(Marks-Konczalik et al., 1998; Rahman et al., 2006). 정상 상태의 세포에서 NF-κB는 inhibitor of kappa B (IκB)와 결합한 상태로 불활성 형태로 세포질에 존재한다(D'Acquisto et al., 1997; Rahman et al., 2006). LPS, cytokines과 같은 자극이 주어지는 경우 IκB는 IκB kinase (Ikk)에 의해 인산화와 유비퀴 톤화(ubiquitination)를 통해 proteasome에 의해 분해되고, 유리된 NF-κB는 핵으로 이동하여 염증 관련 유전자의 발현을 유도하게 된다(Elliott et al., 2003). 또한 extracellular signal-reg-ulated kinase (ERK), c-Jun N-terminal kinase (JNK), p38 ki-nase를 포함하는 mitogen-activated protein kinases (MAPKs)와 PI3K/Akt (PKB)와 같은 단백질 인산화 효소에 의해 NF-κB가 활성화되어 염증반응을 촉진하게 된다(Marks-Konczalik et al., 1998; Kaminska, 2005).

갈조류는 다양한 종류의 생리활성물질을 함유하고 있으므로 이들을 이용하기 위하여 광범위한 연구가 지속되고 있다(Thomas and Kim, 2011). 대황(Eisenia bicyclis)은 다시마과에 속하는 갈조류로써 우리나라와 일본의 해안에 다량 존재하는 것으로 알려져 있다. 대황의 주요한 2차 대사산물들은 플로로탄닌(phlorotannin)으로 항염증(Jung et al., 2013; Paudel et al., 2014; Yayeh et al., 2014) 항산화(Kim et al., 2011; Kwon et al., 2013), 간보호(Choi et al., 2015a), 항균(Eom et al., 2014; Kim et al., 2018), 항치매(Choi et al., 2015b), 항앨러지(Sugiura et al., 2009), 항암 활성(Thomas and Kim, 2011) 등이 보고되고 있다.

대황 주정추출물을 이용한 예비실험에서 헥산(hexane), 에틸아세테이트(ethyl acetate) 및 부탄올(butanol) 획분으로 분리하여 항염증 활성을 분석한 결과 헥산획분의 항염증 활성이 가장 높은 것으로 확인되었다. 본 연구에서는 대황의 헥산 분획물의 항염증 효과 및 관련 분자적 기전을 LPS (lipopolysaccharide)로 자극한 RAW 264.7 세포를 이용하여 분석함으로써, 염증성 질환의 발병을 예방 또는 지연시킬 수 있는 건강 기능성 소재로서의 이용 가능성을 검토하였다.

재료 및 방법

추출과 분획

독도 인근에서 채취한 대황[Eisenia bicyclis (Kjellman) Setchell]의 건조 분말 1kg을 환류냉각기가 부착된 집기병에 담고 주정[95% ethanol (EtOH), v/v] 6L를 넣어 가열, 2회 추출하여(72℃, 3시간) 얻은 추출액을 여과하여 rotary vacuum evaporator로 농축하였다. 에탄올 농축물(122g)을 H2O:EtOH (9:1, v/v)의 혼합용매로 녹인 후 동량의 n-hexane을 넣어 분액 깔대기에 평형화시켜 상층액의 n-hexane 가용부를 분리하였다. 분리된 n-hexane 획분(E. bicyclis hexane fraction, EHF)을 농축하여 실험에 사용하였다.

세포 배양 및 처리

RAW 264.7 세포 (ATCC, Rockville, MD, USA)는 10% fetal bovine serum (FBS) (GIBCO, Grand Island, NY, USA)와 penicillin (100 units/mL), streptomycin sulfate (100 µg/mL)을 첨가한 Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) (Life Technology, Carlsbad, CA, USA)을 사용하였고, 5% CO2, 37℃ 배양기에서 배양하였다. Cell culture plate에 RAW 264.7 cell이 70-80% 정도 채워지면 phosphate-buffered saline (PBS)로 한번 씻어낸 후, 계대배양하였다. EHF는 100% dimethyl sulfoxide (DMSO) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)에 녹여 사용하였고, 세포 처리 전에 배지에 희석하여 처리하였다.

세포 독성 시험

RAW 264.7 cell을 96-well plate에 5×105 cells/well로 분주하고 37C에서 24시간 동안 배양한 후, EHF가 0, 10, 25, 50 µg/mL 농도로 희석된 DMEM (Life Technology, Carlsbad, CA, USA) 배지로 교체하여 1시간 처리한 후 LPS (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) (1 µg/mL)를 함유한 DMEM 배지에 다시 24시간 배양하였다. 이후 CellTiter96ⓇAqueous One Solu- tion Cell Proliferation Assay [3-(4, 5-dimethylthiazol-2-yl)- 5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazo- lium; MTS] 키트(Promega, Madison, WI, USA)를 사용하여 제조사의 방법에 따라 세포 생존율을 분석하였다. MTS 용액은 FBS-free DMEM (Life Technology)에 5%(v/v)의 농도로 섞어 100µL씩 처리하였다. 1시간 후에 microplate reader (Glo-max Multi Detection System, Promega, Madison, WI, USA)를 이용하여 490nm의 파장에서 흡광도를 측정하여 세포독성을 분석하였다.

NO 및 염증성 cytokines 생성 억제 효과

EHF의 항염증 효과 비교를 위해 RAW 264.7 세포에서의 NO 생성에 대한 억제 효과를 분석하였다. EHF를 1시간 동안 전처리 한 다음 LPS (1 µg/mL)로 24시간 동안 자극하고, 원심분리(2,000 g, 4℃, 10분)하여 배지를 회수하였다. NO의 농도는 배지(100 L)와 Griess 시약(0.1% naphthylethylene diamine di-hydrochloride+1% sulfanilamide+5% phosphoric acid)을 동일한 비율로 반응 시켜 microplate reader로 540 nm의 파장에서 흡광도를 측정하였다. 배지 중의 IL-1β, IL-6, TNF-α의 양은 enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) (R&D Sys-tems, Minneapolis, MN, USA) kit를 이용하여 제조사의 방법에 따라 측정하였다.

Reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR)

RAW 264.7 세포(1×106 cells/well)에 EHF를 0, 10, 25, 50 µg/mL의 농도로 1시간 동안 처리한 후, LPS 1 µg/mL의 농도로 6시간 동안 자극시켰다. 이후 Quiazol 시약 (Quiagen Science, Valencia, CA, USA)을 이용하여 total RNA를 분리하였다(Kim et al., 2009). Total RNA로부터 RT-PCR 분석에 의한 mRNA 발현양의 분석은 이전의 보고(Joung et al., 2012)에서 사용한 방법을 이용하였고, 유전자 발현양의 상대적인 비교를 위해서 β-actin 또는 glyceraldehyde-3-phosphate dehydro-genase (GAPDH)를 함께 분석하였다. PCR 반응에 이용된 각각의 primer는 Table 1에 나타내었다. 전기영동상 band의 정량 분석은 cooled CCD camera system EZ-Capture II (ATTO & Rise Co., Tokyo, Japan)와 CS analyzer ver. 3.00 software (ATTO and Rise Co., Tokyo, Japan)를 이용하여 최소 3번의 반복 실험을 통해 얻었다.

Table 1. Primer sequences for RT-PCR

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RT-PCR, reverse transcription-polymerase chain reaction; iNOS, inducible nitric oxide synthase; COX-2, cyclooxygenase-2; TNF-α, tumor necrosis factor- α; IL-1β, interleukin-1β; IL-6, interleukin-6; GAPDH, glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase.

세포질 및 핵 단백질 추출물의 제조

NF-κB의 활성화 정도를 분석하기 위해 EHF 및 LPS를 각각 처리한 RAW 264.7 세포로부터 세포질 단백질과 핵 단백질을 각각 분리 제조하였다(Kim et al., 2009). 즉, EHF로 처리된 세포(2×106 cells/dish)를 PBS로 세척하여 회수하고, 180 µL의 hypotonic buffer [10 mM Tris-HCl, 10 mM NaCl, 3 mM MgCl2, 0.02% NaN3, 0.5 mM dithiothreitol (DTT), 1 mM phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF), pH 7.4]를 넣고, 20 µL의 5% nonidet NP-40을 첨가하여 5분 동안 방치하였다. 이후 원심분리(1,800 g, 4℃, 5분)한 후 상층액을 세포질 추출물로 이용하였다. 침전물은 hypotonic buffer로 한번 세척하고, hypertonic buffer [20 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piper- azineethanesulfonic acid, 25% glycerol, 420 mM NaCl, 1.5 mM MgCl2, 0.2 mM ethylenediaminetetraacetic acid, 0.02% NaN3, 0.5 mM DTT, 1 mM PMSF, pH 7.4]를 넣고 1시간 동안 얼음 위에 방치시킨 다음 원심분리(13,000 g, 4℃, 10분)하여 상층액을 회수하여 핵단백질 추출물로 이용하였다.

Western blot에 의한 단백질 분석

염증관련 단백질과 신호전달 단백질의 인산화 정도는 세포를 EHF로 전처리한 후 LPS로 처리하여 세포 단백질을 시료로, NF-κB 및 IκB의 활성화 및 인산화 정도는 상기의 핵 및 세포질 추출물을 시료로 이용하였고, 단백질 양은 이전의 보고(Joung et al., 2017)와 마찬가지로 전기영동으로 분리된 단백질을 nitrocellulose 막에 이전 시켜 Western blot으로 분석하였다. 검출된 band의 정량 분석은 mRNA 분석과 마찬가지로 cooled CCD camera system EZ-Capture II (ATTO and Rise Co., Seoul, Korea)와 CS analyzer ver. 3.00 software (ATTO and Rise Co., Seoul, Korea)를 이용하여 최소 3번의 반복 실험을 통해 얻었고, 그 결과를 각 blot의 하단에 수치로 표기하였다.

면역형광분석

RAW 264.7 세포를 glass coverslips (SPL Lifesciences Co., Pocheon, Korea) 위에 24시간 배양한 뒤, EHF로 1시간 전처리하고, LPS (1 µg/mL)로 30분 자극시켰다. 세포를 4.0% para- formaldehyde가 첨가된 PBS로 실온에서 15분 동안 반응시켜 고정시키고, 0.5% Triton X-100이 첨가된 PBS를 넣어 10분 동안 반응시켰다. PBS로 세척한 뒤에 3% BSA/PBS를 넣고 30분 동안 blocking 시킨 후, anti-NF-κB polyclonal anti-body (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA)가 희석된 3% BSA/PBS를 넣어 2시간 동안 반응시켰다. 그 다음, Alexa FluorⓇ 488-conjugated secondary antibody (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)가 희석된 3% BSA/PBS를 넣고 1시간 동안 반응시킨 뒤, 2 µg/mL의 4, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)로 핵을 염색하고 LSM700 laser scanning confocal microscope (Carl Zeiss, Oberkochen, Germany)로 관찰하였다.

NF-κB Promoter 활성

RAW 264.7 세포(2×105 cells/well)가 들어있는 24-well plate의 각 well에 1 µg의 pNF-κB firefly luciferase DNA와 20 ng의 pRL-TK renilla luciferase DNA를 Lipofectamine/Plus reagent (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)와 함께 처리하여 40시간 동안 transfection 시켰다. 그다음, EHF를 1시간 전처리하고, LPS (1 µg/mL)로 6시간 자극시켰다. 이후 PBS로 세척하고 100 µL의 lysis buffer (0.5 mM HEPES, pH 7.8, 1% Triton N-101, 1 mM CaCl2, and 1 mM MgCl2)로 lysate를 만들고, luciferase assay kit (Promega, Madison, WI, USA)를 사용하여 luciferase 활성을 측정하였다.

귀 부종 억제 효과

동물시험 방법과 과정은 부경대학교 동물윤리 위원회의 승인을 받아 수행하였다. ICR 생쥐(수컷, 25-30 g)는 샘타코 바이오 코리아(Osan, Korea)에서 구입하였다. 구입된 생쥐들은 1주일간 동물사육실에 적응시킨 후 그룹별로 6마리씩 할당하였다.

귀 부종은 phorbol 12-myristate 13-actate (PMA) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)를 0.2 μg/mL 농도로 아세톤에 녹여 사용하여 유도하였다. 대조군은 생리식염수로 처리하고, PMA 처리군, PMA+0.5 mg EHF 처리군, PMA+1.0 mg EHF 처리군 및 PMA+indomethacin (Indo) 처리군으로 나누었다. 왼쪽 귀(reference)는 30 µL의 아세톤으로 처리하였다. EHF (0.5 mg, 1.0 mg)와 Indo (1 mg)는 30 µL의 아세톤에 녹여 오른쪽 귀 안쪽에 처리하고, 1시간 후에 동일 부위에 PMA 6 µg을 30 µL의 아세톤에 녹여 처리하였다. PMA 처리 6시간 후에 생쥐를 희생시켜 6 mm 구경의 금속펀쳐로 부종 부위를 절취하여 무게를 재었다. 귀 부종 무게는 오른쪽 귀의 무게에서 왼쪽 귀 무게를 뺀 값으로 하였다. 저해 퍼센트(inhibition percentage, IP)는 PMA 처리군에 대한 상대적인 무게를 나타낸 값이다.

통계 처리

본 연구의 모든 실험은 세 번 이상 반복하였으며, 얻어진 결과들을 평균값과 표준편차(mean±SD)를 계산하여 나타내었다. 실험군 간의 유의성 검증은 Student’s t-test로 검증하였다.

결과

EHF에 의한 NO와 PGE2 생성 억제 효과

RAW 264.7 세포에 대한 EHF의 세포독성을 측정하기 위하여 0-50 µg/mL 농도 범위로 EHF를 24시간 처리한 다음 세포생존율의 변화를 MTS assay로 분석하였다. Fig. 1A에 나타난 바와 같이 세포의 생존율은 EHF 처리에 의해 뚜렷한 변화가 없었다. 따라서 이후의 실험은 EHF를 50 µg/mL 이하의 농도에서 행하였다. LPS로 자극된 세포에서 생성되는 NO에 대한 EHF의 억제 효과를 확인하기 위하여 세포를 EHF (0-50 µg/mL)로 1시간 전처리한 후 LPS로 24시간 자극하여 배지에 방출된 ni- trite 생성량을 측정하여 NO 생성량을 분석하였다. LPS 처리에 의해 증가된 NO는 EHF의 전처리에 의해 농도 의존적으로 현저하게 감소하는 것으로 나타났고, 특히 25 µg/mL 이상의 농도 처리군에서는 50% 이상의 감소 효과가 나타났다(Fig. 1B). EHF에 의한 PGE2 생성억제 효과 또한 NO 생성억제 효과와 유사한 결과를 나타내었다(Fig.1C).

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Fig. 1. Effect of EHF on cell viability, nitric oxide (NO) and prostaglandin E2 (PGE2) production in LPS-stimulated RAW 264.7 cells. (A) Cell viabilities were measured with MTS assay. Cells pretreated with various concentrations of EHF for 1 h were stimulated with LPS (1 μg/mL) for 24 h. (B) The culture media of the treated cells were used to measure the amount of nitrite to evaluate NO level, or (C) the amount of PGE2. All data are presented as mean±SD of three independent experiments. #P<0.001 compared to non-treated group. *P<0.05 and **P<0.01 compared to LPS-only group.

EHF에 의한 iNOS와 COX-2 발현 억제 효과

NO는 iNOS에 의해 그리고 PGE2는 COX-2에 의해 생성되므로, 거식 세포에 EHF를 전처리한 다음 LPS로 처리 후에 세포 단백질을 분리하여 iNOS와 COX-2 단백질 발현 수준을 Western blot으로 분석하였다. LPS 처리에 의해 생성된 iNOS 단백질은 EHF 처리에 의해 농도 의존적으로 감소하는 경향을 나타내었다(Fig. 2). COX-2 단백질 역시 EHF에 의해 감소하는 경향을 보였다(Fig. 2). iNOS와 COX-2 단백질 발현이 전사 수준에서 조절되는 것을 확인하기 위하여 iNOS와 COX-2 mRNA 발현을 RT-PCR로 분석하였다. 단백질과 마찬가지로 두 유전자의 mRNA 발현 양상이 유사하게 나타났고, 25 µg/mL 이상의 농도 처리 군에서는 감소 경향이 보다 현저하였다(Fig. 2). 따라서 EHF에 의한 iNOS와 COX-2 단백질의 발현 감소는 전사 수준에서 효과적으로 조절되고 있음을 보여주었다.

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Fig. 2. Effect of EHF on LPS-stimulated inducible nitric oxide synthase (iNOS) and cyclooxygenase-2 (COX-2) protein and mRNA expressions in RAW 264.7 cells. Cells pretreated with various concentrations of EHF for 1 h were stimulated with or without LPS (1 μg/mL) for 16 h. Whole proteins were separated with SDS-PAGE. The expression of iNOS, COX-2, and β-actin was analyzed by Western blot using corresponding antibodies. Cells were incubated with various concentrations of EHF for 1 h, and then stimulated with LPS (1 μg/mL) for 6 h. Total RNA was prepared for RT-PCR. The results presented are representatives of three independent ex- periments.

LPS로 유도되는 염증성 cytokines의 생성에 대한 EHF의 억제 효과

LPS로 자극된 RAW 2645.7 세포에서 생성되는 염증 촉진성 cytokines의 생성에 대한 EHF의 효과를 ELISA 방법으로 분석하였다. LPS 자극에 의해 TNF-α (Fig. 3A), IL-1β (Fig. 3B) 및 IL-6 (Fig. 3C)와 같은 염증 촉진성 cytokines의 생성량은 크게 증가하는 것으로 나타났고, 이러한 증가는 다소 차이는 있지만 EHF 처리에 의해 농도-의존적으로 현저하게 감소하는 것으로 관찰되었다(Fig. 3A, 3B, 3C). 또한 처리된 세포로부터 mRNA를 분리하여 RT-PCR로 분석한 결과 ELISA 결과와 유사하게 나타났다(Fig. 3D).

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Fig. 3. Effect of EHF on the production of pro-inflammatory cytokines in LPS-stimulated RAW 264.7 cells. Cells pretreated with various concentrations of EHF were stimulated with or without LPS (1 μg/mL) for 24 h. TNF-α (A), IL-1β (B), and IL-6 (C) in the culture media were measured by ELISA. (D) Cells were incubated with various concentrations of EHF for 1 h, and then stimulated with LPS (1 μg/mL) for 6 h. Total RNA was prepared for RT-PCR. The results presented are representatives of three independent experiments. Data represent mean±SD of three independent experiments. #P<0.001 compared to non-treated group. **P<0.01 compared to LPS-only group.

LPS로 유도되는 NF-κB의 활성화에 대한 EHF의 억제 효과

염증 촉진성 cytokines, iNOS 및 COX-2의 발현은 전사인자인 NF-κB에 의해 조절된다. LPS로 자극된 RAW 264.7 세포를 이용하여 NF-κB의 활성화에 대한 EHF의 효과를 분석하였다. 먼저 면역 형광 법으로 염색을 하고 confocal microscopy로 분석한 결과를 Fig. 4A에 나타내었다. 자극이 가해지지 않은 상태에서 NF-κB/p65 subunit (녹색)는 주로 세포질에 분포하는 것이 관찰되었다. LPS로 처리된 세포의 경우 녹색인 NF-κB p65의 대부분은 핵에 분포하는 것으로 나타났고, 이는 NF-κB가 활성화되어 핵으로 이동했음을 보여주는 결과이다. 그러나 세포에 EHF (50 µg/mL)를 전처리한 경우 NF-κB/p65는 핵 주변의 세포질에 대부분 분포하는 것으로 관찰되었다. 이러한 결과는 EHF에 의해 NF-κB의 활성화가 현저하게 억제되고 있음을 보여주고 있다(Fig. 4A). NF-κB의 활성화에 영향을 미치는 단백질을 Western blot으로 분석한 결과를 Fig. 4B에 나타내었다. LPS에 의해 과도하게 인산화된 IKK-β와 IκBα는 EHF 처리에 의해 인산화 정도(p-IKK-β 및 p-IκBα)가 농도 의존적으로 감소함을 보여주었다. LPS에 의해 핵으로 이동된 NF-κB p65 또한(CE) HF 처리에 의해 감소됨을 보여주고 있다. 다음은 LPS로 자극된 대식 세포주에 있어 NF-κB의 promoter activity에 대한 EHF의 효과를 분석하였다(Fig. 4C). 이를 위해 RAW 264.7 세포에 NF-B promoter를 가진 luciferase construct를 일시적으로 transfection하고, 이 세포를 다양한 농도의 EHF로 2시간 전처리하고 이어서 LPS로 6시간 동안 자극하였다. Fig. 4C에 나타내었듯이 luciferase 활성은 LPS 자극에 의해 현저하게 증가하였으며, 이는 LPS 자극에 의해 활성화된 NF-κB가 NF-κB의 promoter를 가진 luciferase의 발현을 크게 증가시켰음을 의미한다. 이에 대한 EHF의 억제 효과는 10 µg/mL의 낮은 농도뿐만 아니라 50 µg/mL 농도에 이르기까지 유의적으로 감소하는 것으로 나타났다. 이들 결과는 대식세포에서 LPS 자극에의 해 유도되는 NF-κB의 활성화가 EHF에 의해 효과적으로 억제되고 있음을 보여주고 있고, 이는 EHF에 의한 상기의 염증성 cytokines 및 iNOS의 발현 억제는 부분적으로 NF-κB 활성화 경로에 의해 조절되고 있음을 의미하고 있다.

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Fig. 4. Inhibitory effect of EHF on the activation of NF-κB in LPS- stimulated RAW 264.7 cells. A, celluar distribution of p65 subunit of NF-κB (green) protein was analyzed by immunofluorescence staining with confocal microscopy. Cells were pretreated with EHF (50 μg/mL) for 1 h, followed by LPS stimulation for 30 min. DAPI (blue) was used for nuclear staining; B, nuclear localization of NF- κB and the regulation of IκB-α phosphorylation was analyzed by Western blot. Cells pretreated with EHF for 1 h were stimulated with LPS for 30 min; C, effect of EHF on NF-κB promoter activity. Cells were transfected with 1 μg of NF-κB promoter-containing luciferase DNA for 40 h. Transfected cells pretreated with EHF for 1 h were stimulated with LPS for additional 6 h. The results pre-sented are representatives of three independent experiments; AU, arbitrary unit. #P<0.001 compared to non-treated group. **P<0.01 compared to LPS-only group.

LPS로 유도되는 MAPKs의 인산화에 대한 EHF의 억제 효과

EHF에 의한 NF-κB 신호 경로에 어떠한 신호 단백질들이 관여하는지를 확인하기 위하여 MAPKs (ERK, JNK, p38 MAPK)와 Akt의 인산화를 Western blot으로 분석하였다. Fig. 5에 나타내었듯이, LPS로 유도된 세포에서 EHF 처리에 의하여 ERK, JNK, p38 MAPK 및 Akt의 인산화가 농도 의존적으로 감소하였다. 이러한 결과는 EHF가 IKK-β의 인산화는 물론 NF-κB의 상위 단백질의 인산화를 조절함으로써 염증 억제 효과를 나타낸다는 것을 의미한다.

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Fig. 5. Effect of EHF on the phosphorylations of MAPKs and Akt in LPS-stimulated RAW 264.7 cells. Cells were incubated with various concentrations of EHF for 1 h, and then stimulated with LPS (1 μg/mL) for 30 min. Whole cell lysates were prepared and analyzed by Western blot for phosphorylated proteins of Akt, JNK, p38 MAPK or β-actin using corresponding antibodies. The results presented are representatives of three independent experiments.

부종에 대한 EHF 효과

생쥐의 귀에 PMA를 처리하여 귀 부종을 유도한 결과 6시간 후 PMA에 의해 귀 부종의 무게가 현저히 증가하였다(Fig. 6). Indo 는 비스테로이드성 항염증제(nonsteroidal anti-inflamma-tory drug, NSAID)로써 부종의 치료 효능을 평가하기 위하여 양성 대조 약물로 사용하였다. Fig. 6에 나타난 바와 같이 부종은 EHF 처리에 의해 감소하는 경향이 나타났고, 특히 1 mg의 EHF 처리에 의해 유의적인 차이가 확인되었다(P<0.05). 이러한 결과에서 EHF의 부종 억제 효과를 확인할 수 있었다.

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Fig. 6. Effect of EHF on ear edema induced by phorbol 12-my- ristate 13-actate (PMA) in mice. EHF or indomethacin (Indo) were topically administered on inner surface of the right ears of mice 1 h before application of PMA. 6 h after application of PMA, ear edema and the inhibition percentage (IP) of the ear edema by the treatment were calculated. #P<0.001 compared to non-treated group. **P<0.05 compared to PMA-only treated group.

고찰

NO는 NOS에 의해 L-arginine으로부터 생성되며, 세균의 endotoxin 또는 염증성 cytokines에 iNOS가 급격하게 유도되어 NO 생성량이 급증한다(Guha and Mackman, 2001). 병리적인 조건하에서 iNOS에 의한 NO의 현저한 증가는 다른 염증성매개체들과 함께 과도한 염증을 유발하게 되고 조직의 손상을 유발하는 것으로 알려져 있어 염증성 손상의 주요 매개체이다 (Pan et al., 2011). PGE2는 COX-2의 작용에 의해 arachidonic acid로부터 생성된다(Sil and Ghosh, 2016). 체내의 염증 작용이 증가함으로써 생성되는 PGE2는 통증, 염증, 체온상승, 혈소판 응집 등의 작용을 한다(Park et al., 2006). 따라서 iNOS와 COX-2의 발현을 억제하거나 활성을 억제함으로써 NO와 PGE2의 생성을 억제할 수 있는 화합물은 항염증 물질로 이용될 수 있다.

염증 촉진성 cytokines들은 체내에서 다양한 면역 및 염증반응을 조절하는 역할을 한다. 세균의 LPS에 의해 자극된 대식세포는 TNF-α를 생성하고 분비된 TNF-α는 IL-1와 IL-6의 생성을 유도함으로써 염증반응을 증폭시키게 된다(Minnich and Moldawer, 2004). LPS에 의해 유도된 TNF-α는 염증반응의 개시를 촉진하며 지속적인 생성은 만성 염증을 유발하며 결국에는 패혈성 쇼크, 염증 등의 다양한 생리적 과정에 관여하고 있다 (Scheller et al., 2011). IL-1β는 대식세포에서 생성되는 주요 염증촉진성 cytokine으로, 세균 감염에 대한 염증 응답의 개시 및 강화에 중요한 cytokine이다(Li and Verma, 2002). IL-6도 대식세포에서 생성되는 중요한 염증성 cytokine으로서 급성 면역반응에 작용한다(Bonizzi and Karin, 2004). 본 연구에서 관찰된 결과는 EHF가 LPS-자극에 의해 유도되는 IL-1β, IL-6, TNF-의 생성을 억제시키는 것으로 나타났고, 이는 EHF가 LPS-자극에 의한 염증성 응답의 초기 단계를 억제하고 있음을 의미한다. NF-κB의 활성화를 억제하는 단백질인 IκBα는 IKKβ의 인산화에 의하여 IκBα가 인산화됨으로써 유비퀴틴화되어 프로테아좀에 의해 분해된다(Nguyen et al., 2003). 따라서 IκB-α로부터 유리된 NF-κB는 핵으로 이동하여 염증성 유전자들의 발현에 기여하게 된다. 또한 NF-κB 활성화 경로는 세포 내 다양한 신호전달에 관여하는 MAPKs나 Akt와 같은 protein kinase들에 의해 조절된다(Liu et al., 2017; Tian et al., 2017). 많은 연구들에서 p38, JNK, ERK와 같은 MAPKs가 설치류의 대식세포에서 LPS에 인한 NF-κB의 활성화에 중요한 역할을 한다고 밝히고 있다(Guha and Mackman, 2001; Joung et al., 2017). 그리고 Akt 또한 NF-κB의 활성화를 조절함으로써 여러 염증성 유전자의 발현을 조절하는 것으로 알려져 있다(Joung et al., 2015). 본 연구에서 LPS 자극에 의해 유도되는 NF-κB의 활성화에 대한 EHF의 억제효과는 MAPKs 및 Akt와 같은 kinase의 인산화 과정과 관련되어 있음을 나타낸다.

앞서 설명한 것처럼 모자반류에서 분리된 sargaquinoic acid (Gwon et al., 2015; Joung et al., 2015), fucosterol (Jung et al., 2013; Gwon et al., 2017), sargachromenol (Gwon et al., 2017)과 같은 화합물들의 항염증 활성에 대해 활발한 연구가 진행되었다. 본 실험에 사용된 EHF를 HPLC로 분석한 결과 sargahy-droquinoic acid, sargaquinoic acid 및 sargachromenol은 발견되지 않았다. 따라서 이들 항염증 활성을 나타내는 유효성분을 분리 동정하기 위한 후속적인 연구가 필요하다.

이상의 결과에서, LPS로 자극한 RAW 264.7 세포에 있어 NO와 같은 염증성 매개체뿐만 아니라 염증 촉진성 cytokines의 생성 및 발현이 EHF에 의해 억제된다는 것을 증명하였다. 이러한 EHF의 억제 효과는 IκB의 분해를 저해함으로써 NF-κB 활성화 경로를 억제시키는 것으로 나타났다. 또한 EHF는 NF-κB 활성화의 상위 신호전달 경로인 MAPKs 및 Akt에도 영향을 미치는 것으로 확인되었다. 여러 만성염증성 질환에 과도한 염증성 매개체들의 발현 및 생성이 중요한 병인적 역할을 하고 있음을 고려했을 때, 본 연구 결과는 EHF가 항염증 효능을 가진 기능성 식품의 소재로 이용될 수 있다는 가능성을 제시하고 있다. 향후 EHF의 항염증 효과를 나타내는 유효화합물의 분리·동정 및 활성 분석에 대한 연구가 진행되어야 할 것으로 판단된다.

사사

이 논문은 부경대학교 자율 창의 학술연구비(2019년)에 의하여 연구되었음.

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