Drug Release from Thermosensitive Liposomes by High-Intensity Focused Ultrasound

고강도 집속 초음파에 의한 온도민감성 리포솜으로부터 약물 방출

Abstract

Development of liposomes has been actively studied for effective delivery of drug at tumor site. However, despite their preferential accumulation at tumor site, the therapeutic efficacy of such liposomal drug has been limited because of low drug release. Therefore, we developed a temperature-sensitive liposome (TSL), which can be made to maximize release of drug by external stimulation such as ultrasound. Doxorubicin (DOX) as a model drug was encapsulated into TSL by a pH gradient method. The particle size of the TSL was $142.0{\pm}6.24nm$. Surface charge was $-10.55{\pm}1.12mV$. Release of drug from TSLs was up to 80% within 15 min at over $42^{\circ}C$ measured by fluorescence intensity. Cytotoxicity of released DOX from TSLs with ultrasound was highly increased compared to TSLs without ultrasound. Taken together, we demonstrate that temperature sensitive drug release from TSLs with ultrasound, which may be useful for cancer therapy to increase drug concentration at tumor site by external stimulation.

종양 조직으로 약물을 효과적으로 전달하기 위하여 리포솜의 개발이 활발이 연구되고 있다. 그러나 리포솜이 종양조직에 효과적으로 축적됨에도 불구하고, 낮은 약물 방출 때문에 리포솜의 치료 효과가 제한적이다. 따라서 우리는 외부 자극에 의하여 약물방출을 최대화 시킬 수 있는 온도민감성 리포솜을 개발하였다. 모델약물인 독소루비신은 pH 전위차 방법에 의하여 리포솜 내부에 봉입하였다. 리포솜의 입자 크기는 $142.0{\pm}6.24nm$ 이었고, 표면전하는 $-10.55{\pm}1.12mV$ 이었다. 온도민감성 리포솜으로부터 약물의 방출은 형광광도계로 측정하였으며 $42^{\circ}C$ 이상에서 5분 이내에 80% 이상의 방출률을 나타냈다. 초음파에 의해 온도민감성 리포솜으로부터 방출된 독소루비신의 세포독성은 초음파를 조사하지 않은 온도민감성 리포솜보다 월등히 우세하였다. 이번 연구에서 우리는 초음파에 의하여 온도민감성 리포솜으로부터 온도에 민감한 약물방출을 증명하였고, 이것은 외부 자극에 의한 종양조직의 약물 농도를 증가시킬 수 있는 암치료에 효과적일 것이다.

서 론

최근 대상 질병에 효과적으로 약물을 전달하기 위한 운반체로서 기존 약물운반체에 비하여 독성이 적고, 유효약물을 표적부위에 효과적으로 전달할 수 있는 리포솜에 대한 개발이 활발하다.1 리포솜은 구성성분을 조절함으로서, 전신 투여 후 생체 내 약물 분포를 조절할 수 있고, 구조가 세포막과 유사하여 독성이 적으며, 종양조직으로 전달이 용이하다는 장점이 있다.2−5 그러나 표적부위에 전달된 리포솜으로부터 효과적인 약물의 방출이 이루어지지 않아 약물에 의한 치료효과가 감소되는 단점을 가지고 있다.6,7

따라서, 표적부위에 도달된 리포솜으로부터 약물의 방출을 극대화 시키기 위하여 외부의 자극을 이용하는 방법들이 연구되고 있다. 외부 자극을 이용하는 방법으로는 초음파8, 근적외선9, 빛10,11 등을 이용한 방법들이 있으며, 특히 고강도 집속초음파(high-intensity focused ultrasound, HIFU)는 초음파 에너지를 집속시켜 초점 부위에서 열을 발생시킴으로서 국소적으로 환부에만 열을 전달할 수 있는 장점이 있다. 또한, 초음파는 인체에 무해하며 초음파가 집중되는 초점에서만 열이 발생하므로 마취나 수술 없이 종양을 치료할 수 있는 장점이 있다.12 그러나 초음파 단독치료로는 혈류 속도에 의하여 에너지의 감소가 일어나므로 치료효과가 감소되는 문제점이 있다.13 따라서, 이러한 초음파치료와 온도에 민감한 리포솜의 복합치료에 의해서 약물치료의 효과를 증가시킬 수 있는 복합치료 방법의 개발이 절실하다.14,15

온도민감성 리포솜은 표적부위에서 외부로부터 전해지는 온열에 의해서 약물의 방출을 증가시킬 수 있기 때문에 외부 온열을 이용하는 항암치료분야에서 연구가 활발히 진행되고 있다.16,17 온도민감성 리포솜은 온도에 민감한 지질의 구성 성분을 조절함으로서 지질의 상전이온도 이상에서 리포솜의 구조를 변성시킴으로서 리포솜 내부로부터 약물의 방출을 제어할 수 있는 장점이 있다.18 특히, Lyso-lipid는 전이 온도가 40−42 ℃ 이므로 전이온도 이상에서 리포솜의 구조를 변성시킴으로서 리포솜 내부로부터 급격한 약물 방출을 유도한다.19

그러나 온도민감성 리포솜의 급격한 약물방출에도 불구하고 항암치료 효과가 완벽하진 않다.20 따라서 리포솜 내부의 약물방출을 더욱 증가시키기 위하여 온도민감성 리포솜과 초음파 치료를 혼용하는 항암치료법을 설계하였다. 따라서 본 연구에서는 초음파 시스템에 민감한 온도 민감성 리포솜을 개발함으로서 외부 자극에 민감하게 반응하여 리포솜내부의 약물 방출을 극대화 시킬 수 있는 초음파 민감형-온도민감성 리포솜을 개발하고자 하였다.

 

실험방법

시약 및 기기

리포솜의 제조에 사용된 지질인 L-α-phosphatidylcholine soy hydrogenated (HSPC), Cholesterol, Dipalmitoylphosphatidylcholine (DPPC), Monopalmitoylphosphatidylcholine (MPPC), Monostearoylphosphatidylcholin (MSPC), 그리고 1,2-distearoyl-sn-glyero-3-phosphoethanolamine-N-[meth-oxy(polyethylene glycol)-2000] (DSPE-mPEG-2000)은 Avanti Polar Lipids Inc. (Alabaster, AL, USA)에서 구입하여 사용하였고, 모델 약물로 사용한 독소루비신은 Boruyng Inc. (Seoul, Korea)에서 구입하여 사용하였다. Citric acid, HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethane sulfonic acid), 그리고 Sephadex® G-50은 Sigma Chemicals Co.에서 구입하였다. 리포솜을 제조하기 위하여 회전 응축 증발기(Rotavapor R-200, Buchi, Switzerland)와 초음파 발생기(Ultrasonicator, 500, Fisher Scientific, USA)를 사용하였으며, 제조된 리포솜의 입자크기 및 표면전하는 입도분석 및 제타전위측정기(ELS-Z, Particle analyzer, Otuska Electronics Co., Japan)를 사용하여 측정하였다. 상전이 온도 측정은 differential scanning calorimetry (DSC2910, TA instruments)를 사용하여 측정하였다. 리포솜의 세포 내 이입효율은 유세포 분석기(FACS, Becton Dickinson, Sanjose, CA, USA) 및 공초점 현미경(CLSM, LSM5 LIVE, Carl Zeiss, Germany)으로 측정하였다. 또한 초음파 발생기(High Intensity Focused Ultrasound, HIFU)는 HF Ultrasonic Amplifier (MIRAE Ultrasonic Co., Korea)를 사용하였다. 그밖에 실험에 사용한 클로로포름과 메탄올 등은 일급 및 특급시약을 그대로 사용하였다.

리포솜의 제조

본 실험에 사용한 리포솜의 종류와 지질 배합조건은 Fig. 1A에 나타내었다. 대조군 리포솜으로서 비온열민감성 리포솜(NTSL)은 HSPC : CHOL : DSPE-mPEG-2000을 12.6 : 8.3 : 1.2의 몰 비율로 혼합하여 제조하였다. 또한 온 도 민감성 리포솜(TSL1)은 DPPC : MPPC : DSPE-mPEG-2000을 21.6 : 2.6 : 1.0으로 제조하였으며, TSL2는 DPPC : MSPC : DSPE-mPEG-2000을 각각 21.6 : 2.6 : 1.0으로 각각 제조하였다(Fig. 1A). 리포솜의 제조는 각각의 지질을 클로로포름에 용해시킨 후, 회전 증발 응축기를 사용하여 40 ℃에서 감압 증류하여 둥근 플라스크 벽면에 얇은 지질 막을 형성시킨 후, 지질 막에 300 mM citrate buffer (pH 4.0)로 수화하여 제조하였다. 제조된 리포솜은 100 nm의 공극을 갖는 폴리 카보네이트 분리막(Whatman, USA)이 장착된 가압압출기를 이용하여 2번씩 가압-압출하였다. 리포솜은 sephadex G-50 columns(20 mM HEPES buffer pH 7)을 이용하여 분리하였다. 제조되어진 리포솜에 독소루비신을 약물 :지질비율이 1:10(w/w)이 되도록 첨가하여 NTSL은 60 ℃에서 2시간, TSL1은 24 ℃에서 20시간, 그리고 TSL2는 37 ℃에서 20분씩 각각 숙성하여, pH gradient loading 방법을 이용하여 독소루비신을 봉입하였다.21 리포솜 내부에 봉입되지 않은 독소루비신은 sephadex G-50 columns을 이용하여 제거하였다. 봉입효율은 UV-vis 분광광도계를 이용하여 최대 흡수파장 497 nm에서 측정하여, 식 (1)에 의하여 계산하였다.

Figure 1.Composition and physical properties of NTSL, TSL1, and TSL2. Mean and S.D. are shown (n=3).

여기서 cf는 클로로포름 :메탄올(8:2)로 리포솜을 용해 시킨 후의 독소루비신 농도이고 ci는 초기에 첨가한 독소루비신의 농도이다.

리포솜으로부터 약물의 방출 특성

리포솜으로부터 약물의 방출 특성을 확인하기 위하여 각각의 온도와 시간에 따라 방출되는 독소루비신의 농도를 UV분광광도계를 사용하여 측정하였다. 약물이 봉입된 NTSL, TSL1, TSL2으로부터 약물의 농도를 일정하게 증류수를 이용하여 희석 후 석영으로 된 UV cuvette에 담지하여 측정하였다. 온도에 따른 리포솜으로부터 독소루비신의 방출은 NTSL, TSL1 그리고 TSL2를 2분 간격으로 각각의 온도에 노출시킨 후, 리포솜 용액의 흡광도를 측정하였다. 시간에 대한 독소루비신의 방출 농도는 각각의 온도를 일정하게 유지시킨 후, 매 2분 마다 리포솜 용액을 채취하여 분광광도계로 측정하여 다음 식 (2)에 의하여 계산하였다.

이때, Ft는 온도와 시간에 따라 리포솜으로부터 방출되는 독소루비신의 흡광강도이고, Fi는 약물의 방출이 일어나지 않는 범위(4 ℃)에서의 흡광강도이며, Ff는 클로로포름 :메탄올(8:2) 로 리포솜을 녹인 최초 독소루비신의 로딩에 대한 흡광강도이다.

초음파 자극에 의한 리포솜으로부터 약물의 방출

초음파에 의한 리포솜으로부터 독소루비신의 방출을 확인하기 위하여 초음파의 세기와 조사시간을 변화시키며 NTSL과 TSLs로부터 방출되는 독소루비신을 UV-vis 분광광도계로 측정하여 초음파 민감도를 확인하였다.

초음파 자극으로 리포솜으로부터 방출된 약물의 세포 독성

리포솜으로부터 방출된 독소루비신의 세포 독성을 MTT방법으로 평가하였다. 유방암 세포주인 MDA-MB231은 10% FBS가 첨가된 Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM, Invitrogen Corp, Carlsbad, CA, SUA) 배지를 사용하여 37 ℃, 5% CO2인큐베이터에서 배양하였다. 초음파를 가하여 NTSL, TSL1, 그리고 TSL2로부터 독소루비신의 방출을 유도한 후, 원심분리를 통하여 방출된 독소루비신을 획득하였다. MDA-MB231(96 well plate, 1×103 cells/well)에 방출된 독소루비신을 처리 한 후, 48시간 숙성 후에 microplate reader를 이용하여 590 nm에서 흡광도를 측정하여 세포 독성을 평가하였다.

 

결과 및 고찰

리포솜의 물리적 특성

본 실험에서 제조한 리포솜의 물리적 특성은 Fig. 1B, C, 그리고 D에 나타내었다. NTSL의 입자 크기는 112.0 ± 1.07 nm였고, 표면전하는 −17.38 ± 2.47mV이었으며, TSL1의 크기는 142.0 ± 6.24 nm였고, 표면전하는 −10.55 ± 1.12 mV였다. TSL2의 크기는 170.6 ± 9.43 nm 였고, 표면전하는 −10.55 ± 1.12 mV이었다. 제조된 리포솜(NTSL, TSL1, 그리고 TSL2)의 내부에 로딩된 독소루비신의 로딩 효율은 모두 90% 이상이었다.

리포솜표면의 상전이 온도

리포솜으로부터 약물의 방출은 리포솜을 구성하고 있는 지질의 상전이온도와 밀접한 관련이 있다. 특이 지질의 상전이 온도 이상에서는 리포솜을 구성하고 있는 지질의 상이 변화되므로 약물의 방출이 시작되는 것을 예측할 수 있다.22 따라서 온도민감성 리포솜의 약물방출 특성을 확인하기 전에 리포솜을 구성하고 있는 지질의 상전이 온도 변화를 DSC 분석을 통하여 확인하였다(Fig. 2). NTSL의 상전이 온도는 47.5 ℃이며, TSL1는 40.54 ℃, TSL2는 41.07 ℃로 TSL1이 가장 낮은 상전이 온도를 나타냈다. 결과적으로 NTSL은 리포솜을 구성하는 있는 지질 성분 중 온도에 민감한 DPPC, MPPC, 또는 MSPC를 포함하고 있지 않기 때문에 상전이 온도가 상대적으로 증가하였으며, 그렇기 때문에 온열온도의 범위에서는 약물의 방출이 최소한으로 이루어질 것이고, TSLs은 온열치료온도 범위에서 약물의 방출이 증가할 것이라 판단된다.

Figure 2.Phase transition temperature of NTSL, TSL1, and TSL2 via differential scanning calorimetric scan.

리포솜으로부터 약물의 방출 특성

외부 온도에 대한 약물방출의 민감성을 확인하기 위하여 NTSL, TSL1 과 TSL2로부터 온도 및 시간의 변화에 따른 약물의 방출 경향을 확인하였다(Fig. 3). 온도에 의한 약물의 방출민감성은 TSL1의 경우, 37−42 ℃에서 약 80%의 급격한 방출현상을 나타내었다. 또한 TSL2는 38−44 ℃ 범위에서 약 80% 이상의 방출을 나타냈으며, NTSL은 모든 온도범위에서 약물의 방출이 미비하게 나타났다. 또한 37 ℃ 이하에서는 TSL1과 TSL2 모두 약 5% 이내로 방출이 제한적이었다(Fig. 3A). 본 결과로부터 체온(37 ℃) 이하의 온도에서는 약물의 방출이 제한적이고 리포솜이 안정하며, 외부에서 체온 이상의 온도가 도입되었을 때 리포솜으로부터 약물의 방출을 급격히 증가시킬 것이라고 예상된다. 본 결과는 Fig. 2의 지질 상전이 온도에 대한 결과와 유사성을 나타내며, 예상대로 상전이 온도 이상에서 약물의 방출이 급격히 증가된다는 것을 확인하였다.

Figure 3.Release of DOX from TSL1 (●), TSL2 (○) and NTSL (■) at different temperatures and time courses. (A) Release of DOX with different temperature. Release of DOX with time at (B) 37 ℃, (C) 42 ℃, and (D) 45 ℃. Data are mean ± S.D. (n=3).

한편, 온열온도 부근에서 시간에 대한 약물방출 특성을 확인하기 위하여 NTSL과 온도 민감성을 지닌 TSL1과 TSL2로부터 시간에 따른 약물 방출 경향을 확인하였다 (Fig. 3B, C, 그리고 D). NTSL은 37 ℃에서 시간에 대해서 무관하게 약물의 방출이 증가하지 않았다. 또한 TSL1과 TSL2 모두 체온(37 ℃)에서는 약물의 방출이 시간에 무관하였다(Fig. 3B). 한편, NTSL은 42 ℃와 45 ℃ 범위에서 시간에 무관하게 약물의 방출이 증가하지 않은 반면, TSL1과 TSL2는 42 ℃와 45 ℃ 범위에서 10분 이내에 약물의 방출이 80%정도 증가하였다. 특히 TSL1는 42 ℃에서 2분 동안에 약 80%가 방출되었으며, 45 ℃에서는 1분 내에 80%가 방출되었다. 이에 반해 상전이 온도가 높은 TSL2는 TSL1에 비해 42 ℃에서는 다소 약물 방출 속도가 느리게 진행됨을 확인할 수 있었으며, 45 ℃에서는 42 ℃에 비해 빠른 방출 거동들을 보였다. 모든 TSL에 대하여 약물의 방출이 45 ℃ 이상에서는 1−2분 이내에 최대가 되는 것을 확인할 수 있었다.

본 결과로부터, 체온(37 ℃)에서는 시간과는 무관하게 약물의 방출이 최소한으로 제어됨으로서, 리포솜을 체내 주사 후, 리포솜이 체온에서는 비교적 안정한 상태로 유지되며 온도에 의하여 큰 영향을 받지 않음을 예측할 수 있다. 한편, TSL 리포솜은 온열 치료 범위에서 1−2분 이내에 약물의 방출이 최대한으로 증가함으로 외부에서 종양 조직의 온도를 상승시켜 줄 경우, 종양 치료에 효과가 있을 것이라 판단된다. 따라서 우리는 외부에서 온도를 증가시켜 주기 위해서 외부 자극원으로서 HIFU시스템을 도입하였고, HIFU와 관련된 약물방출 경향을 확인하였다.

초음파 자극에 의한 리포솜으로부터 약물의 방출

초음파 강도에 대한 TSLs로부터 약물 방출 효과를 관찰하였다(Fig. 4). NTSL은 초음파 자극에 대하여 약물의 방출이 미량으로 나타나는 반면, TSL1과 TSL2는 특정 초음파 세기(283.04 W/cm2)에서 약물의 방출이 60% 이상 나타났다(Fig. 4A). 또한, 283.04 W/cm2에서 2분 안에 NTSL은 약 10%인 것에 비하여 TSL1의 경우 약 80%로 방출 최대치를 나타났으며, TSL2는 70%로 약물 방출이 나타났다 (Fig. 4B). 외부열원으로서 초음파를 도입하였을 때, 1−2분 이내에 급격한 약물 방출 거동이 나타나므로 TSLs은 초음파 장비와 복합치료를 할 경우, 리포솜의 치료 효과를 최대한으로 증가시킬 수 있으리라 예상된다.23

Figure 4.Release of DOX from NTSL (■), TSL1 (●), and TSL2 (○). (A) Drug release from liposomes at different acoustic power (W/cm2) for 2 min. (B) Drug release from liposomes at 283.04 W/cm2 with different exposure times. Data are mean ± S.D. (n=3).

초음파에 의해 리포솜으로부터 방출된 약물의 세포 독성

초음파는 리포솜을 구성하고 있는 지질의 변성을 가속화하여 리포솜 내부로부터 약물의 방출을 증가시킨다.24

초음파에 의해 리포솜으로부터 방출된 독소루비신의 세포독성을 MTT 방법를 통하여 확인하였다(Fig. 5). 초음파를 조사하지 않은 NTSL, TSL1, TSL2는 37 ℃에서 독소루비신의 방출이 미비하기 때문에 독성이 낮은 반면, 초음파(283.04 W/cm2, 2분)를 조사하여 준 TSL1과 TSL2는 독소루비신의 방출량이 증가하여 세포독성이 증가하였다. 따라서 온열에 민감한 TSL1과 TSL2와 외부열원인 초음파를 동시에 암조직에 전달하게 되면, 암조직으로 전달된 온열리포솜에서 초음파에 의하여 약물 방출이 최대화됨으로서 효과적으로 종양세포의 성장을 억제할 수 있으리라 판단된다.

Figure 5.Cytotoxicity of liposomes by MTT assay after 48 hr incubation at 37 ℃. Mean and S. D. are shown (n=3).

 

결 론

유효약물을 표적부위까지 안전하게 전달하기 위하여 리포솜 제형이 활발히 개발되고 있다. 그러나 이러한 리포솜이 표적부위에 도달이 된 후, 리포솜으로부터 약물의 방출이 지연되어 치료효과가 감소되는 경향이 있다. 따라서 치료효과를 향상시키기 위하여 리포솜으로부터 약물의 방출을 극대화시켜야 한다. 본 연구는 초음파를 외부자극열원으로 도입하여 온도에 민감한 온도민감성 리포솜을 개발함으로서 표적부위에서 약물의 방출을 급격히 증가시키고자 하였다. 개발된 리포솜은 지질의 비율을 미세하게 변화시키며 온열, 초음파에 민감하게 제조하였으며, 이러한 약물전달 운반체의 개발은 외부자극으로 약물의 방출을 효율적으로 제어 할 수 있는 치료방법으로서 다양한 질병에 활용이 가능할 것이다.