• Journal of Plant Biotechnology
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• 제38권1호
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• pp.15-21
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• 2011

Agrobacterium tumefaciens와 운반체 416을 이용하여 cryIAc1 유전자가 형질전환된 배추 14개체를 선발하였다. Southern blot을 통하여 분석한 결과 1 사본 유전자가 도입된 개체가 6개이었으며 backbone 염기서열이 포함되지 않은 경우는 4개체이었다. LB 인접서열 분석 결과, 416-2과 416-3은 23 bp의 LB 부위가 남아있는 동일한 염기서열을 보였고, 416-9 경우 15 bp가 남았으며, 416-17 경우 LB를 포함하여 안쪽의 염기서열의 최대 36 bp의 결실이 확인되었다. T-DNA의 염기서열을 제외한 배추 gDNA의 499 bp의 LB 인접염기서열은 B. oleracea의 염기서열과 96% 상동성을 가진 유전자로 확인되었다. RB border 인접서열 분석용 primer를 제작하여 PCR을 수행한 결과 모두 834 bp의 염기서열을 확인하였고, vector의 구성 요소 중 cryIAc1의 3' 말단 부위, nos-terminator 부위와 52 bp 및 배추 gDNA RB 인접염기서열로 확인되었다. RB 염기서열은 확인할 수 없었으며 nos-terminator 3' 말단의 21개의 염기를 포함하여 모두 58개의 염기서열이 결실된 것을 확인하였다. 형질전환식물체를 제작할 경우 발생하는 전이유전자나 식물의 염색체에 염기 결실은 매우 다양한 형태로 나타난다. 이번 실험의 경우, 전이유전자가 삽입된 위치에서 약 10 bp의 배추의 gDNA 염기가 결실된 것이나 삽입된 전이유전자의 RB 말단부분이 결실된 것은 예상할 수 있는 결과였지만, 특히 전이유전자의 말단인 nos-terminator 3' 끝에 65 bp 정도의 배추의 다른 유전자가 삽입되어 있다는 것을 확인하였고 이는 기대하지 않았던 결과였다. 삽입된 다른 배추유전자의 절편은 앞으로 더 많은 연구를 통하여 위치와 기능확인이 필요할 것이다.

• 대한핵의학회지
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• 제38권1호
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• pp.99-108
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• 2004

목적: 생체 내로 이식한 신경 줄기 세포의 이동과 증식을 비침습적으로 추적하는 것은 기초와 임상에서 중요한 것으로 알려져 있다. 신경줄기 세포주(F3)를 생체내로 이식 후, 비침습적으로 추적하기 위해 사람의 hNIS 유전자를 F3 세포에 안정적으로 형질 도입하여 세포 배양 시간 및 조건에 따른 F3-NIS 세포 내에서 hNIS 유전자의 발현 변화를 알아보았다. 방법: HB1.F3는 태아 종뇌에서 신경 줄기 세포를 분리한 후 v-myc유전자로 불멸화한 신경줄기 세포주이다. CMV 프로모터 조절 받도록 hNIS와 하이그로마이신 저항 유전자를 IRES(internal ribosomal entry site)를 이용하여 재조합하였다(pIRES-NIS/Hyg). pIRES-NIS/Hyg를 리포좀을 이용하여 HB1.F3 세포를 형질전환 하였다. 탈메틸화시약(5-Azacytidine)와 히스톤탈아실화효소저해제(trichostatin; TSA)을 세포주에 24시간 처리한 후, hNIS 발현을 I-125 섭취율과 역전사효소 중합효소연쇄반응(RT-PCR)으고 측정하였다. 결과: pIRES-NIS/Hyg 재조합 유전자를 HB1.F3에 형질도입 후, 2주 동안 하이그로마이신 B를 처리해 hNIS 유전자를 안정적으로 발현하는 HB1.F3 세포를 얻었다(F3-NIS III). I-125 섭취율은 HB1.F3에 비해 F3-NIS가 12.9배 높았으며, $KClO_4$를 처리 했을 때 F3-NIS의 I-125 섭취가 완전히 저해되었다. F3-NIS를 계대 배양하면 hNIS 유전자의 발현이 1.9배 까지 서서히 감소하였다. 5-Azacytidine과 TSA를 F3-NIS에 24시간 처리한 결과, I-125 섭취율이 5-Azacytidine과 TSA 농도에 따라 증가되었다. 또한 같은 방법으로 F3-NIS 세포에 5-Azacytidine과 TSA를 처리한 후 hNIS 프라이머로 RT-PCR을 수행한 결과 hNIS mRNA가 농도에 따라 증가 되었다. 결론: hNIS 유전자 이입된 F3 세포는 계대 배양하는 동안 생물학적인 특성이 변화되는 것으로 관찰되었으며, 이는 줄기 세포에 이입된 외래 유전자의 발현이 DNA 탈메틸화나 히스혼아세틸화를 통한 에피지네틱 조율 때문이라고 생각한다.

• 한국가축번식학회지
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• 제25권4호
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• pp.339-347
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• 2001

정자를 매개체로 한 유전자 전이는 형질 전환 동물의 생산을 위한 가능성 있는 간단한 방법이다. 또한 세포질내 정자 주입법에 의한 외래 유전자의 전이에 의한 형질 전환 동물의 생산이 최근에 보고되었다. 본 연구에서는 정자를 EGFP유전자와 공배양한 후 이를 난모세포내에 미세 주입한 다음, 수정란의 발달과 EGFP유전자의 발현을 조사하였다. 돼지 난자에 정자, 세포질막이 파괴된 정자 또는 정자를 주입하였다. 주입 후 수정된 난자는 NCSU23 배양액에서 배반포까지 배양하였으며, 배발생율과 EGFP 유전자의 발현을 연구하였다. 정자를 미세 주입한 결과 난할율은 67.0%로 정자두부를 미세주입한 난할율인 59.7%보다 높았고, 수정란의 EGFP 유전자 발현율은 각각 42.1와 20.0%로서 전자가 유의하게 높았다. 세포질막을 파괴하기 위해 다른 방법들로 정자를 처리하여 주입하였을 시 구정란의 배발생율에 영향을 주지 않았다 정자, 세포막이 파괴된 정자를 주입하여 배반포 발생율을 조사한 결과, 15.0과 14.2%로서 유의차가 없었다. 동결융해하거나 Triton X-100으로 처리한 정자를 주입하여, EGFP 발현율을 조사한 결과, 동결융해 정자를 사용했을 때의 성적이 38.4%로 타군의 성적인 22.4%에 비해 유의하게 높았다. 미세 주입에 앞서 정자는 EGFP 유전자의 0.01 ng/${\mu}\ell$ 부터 1 ng/${\mu}\ell$까지의 여러 농도로 배양되었다. 그러나 난할율을 조사한 결과 EGFP 유전자의 농도 차이에 따른 유의차가 없었다. 정자 배양액에 첨가된 EGFP 유전자의 농도가 0.1 ng/$m\ell$일 때 EGFP 발현율은 37.4%로서 가장 높은 결과를 보였다. 따라서 본 연구의 결과에 의하면 세포질막을 제거한 정자에 외래 유전자가 묻게 되며, 이 정자는 외래유전자를 수정란내로 옮겨 매개체로서의 역할이 가능할 것으로 생각된다.

• 생명과학회지
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• 제19권7호
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• pp.839-844
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• 2009

본 연구는 비유전자변형 계통(낙동벼)과 2개의 다른 Promoter (aize ubiquitin과 abscisic acid)를 각각 삽입한유전자변형 벼와 abscisic acid promoter이용한 유전자변형 계통을 잡초성벼(Oryza sativa)와 인공수정 한 후 다음세대인 F$_1$, F$_2$, F$_3$의 활분활력, 형태형성 생장차이를 비교하여 평가하였다. 화분이 열개된 후 3-{4,5 dimethylthiazoly1-2}-2-,5-diphynly monotetrazolium bromide (MTT)반응을 살펴본 결과, Nakdongbeyo에서 86%, ABC-pro-moter 이용한 유전자변형 벼에서 75%, maize ubiquitin promoter이용한 유전자변형 벼에서 62%,F$_1$에서 68%, F$_2$에서 79% 및 F$_3$에서 78%의 각각 최대 화분활력을 보여주었다. 유전자변형 계통과 잡초성벼와의 교잡종의 F$_1$, F$_2$, F$_3$ 세대간의 화분활력을 비교하였을 때 화분 열개된 후 20분 까지는 유의한 차이를 보이지 않았으나, 40분에서 90분 사이에서는 F$_3$의 화분활력이 다른 두 세대 F$_1$, F$_2$보다 높게 나타났다. 화분을 열개된 90분 후 F$_3$ 세대 에서 최대 화분 활력이 36.2% 이었고 F$_2$ 세대 에서는 화분 활력이 최소 3.5% 보였다. 따라서 화분에 의해 벼의 유전자가 다른 계통으로 전이되는가를 조사하기 위하여 연차실험을 수행하였는데, 결론적으로 두 유전자변형 계통으로부터 잡초성벼로 유전자가 전이될 위험성이 나타날 것으로 보였다.

• 한국수정란이식학회지
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• 제32권3호
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• pp.227-233
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• 2017

Pig has been known to be one of the most feasible animals as a bioreactor to produce pharmaceuticals in milk and as a mediator in xenotransplantation research. Previously, we generated transgenic pigs for both purposes, which were expressing Factor 8, vWF, hTPA, and hEPO in milk, along with expression of MCP at GalT gene locus ($GalT^{-MCP/-MCP}$) as well as expressing MCP at GalT gene loci with CD73 expression ($GalT^{-MCP/+}/CD73$). In this study, we performed comparative analyses of sperm parameters between wild type male (WT) pig and those transgenic males to examine the effects of transgenes integrated into the pigs on motility, morphology, viability, and acrosome integrity of the spermatozoa. Our results showed that the rates of actively motile spermatozoa of WT, Factor 8, vWF, hTPA, hEPO, $GalT^{-MCP/+}/CD73$, and $GalT^{-MCP/-MCP}$ pigs were 85.0%, 83.3%, 82.5%, 83.3%, 82.5%, 77.5%, and 78.7%, respectively. Whereas, the rates of morphologically normal spermatozoa of WT, Factor 8, vWF, hTPA, hEPO, $GalT^{-MCP/+}/CD73$, and $GalT^{-MCP/-MCP}$ pigs were 90.0%, 80.0%, 80.0%, 83.3%, 85.0%, 91.8%, and 80.8%, respectively. In addition, the viability in spermatozoa of WT, Factor 8, vWF, hTPA, hEPO, $GalT^{-MCP/+}/CD73$, and $GalT^{-MCP/-MCP}$ pigs were 93.9%, 82.4%, 89.9%, 83.9%, 87.4%, 92.8%, and 83.6%, respectively. The rates of spermatozoa with normal acrosome integrity in WT, Factor 8, vWF, hTPA, hEPO, $GalT^{-MCP/+}/CD73$, and $GalT^{-MCP/-MCP}$ pigs were 98.1%, 98.6%, 98.6%, 98.7%, 98.1%, 99.5%, and 95.1%, respectively. There were no significant differences in motility, morphology, viability, and acrosome integrity of the spermatozoa among WT, Factor 8, vWF, hTPA, and hEPO, $GalT^{-MCP/+}/CD73$, and $GalT^{-MCP/-MCP}$ pigs. These mean that neither random integration nor targeted integration of the transgene into chromosome of pig effect on characteristics of spermatozoa. Ultimately, the transgenic male pigs subjected in this study could apply to propagate their progenies for production of human therapeutic proteins and advancing the xenotransplantation research.

• 현장농수산연구지
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• 제25권4호
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• pp.138-147
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• 2024

본 연구는 국내 밀 43 품종에 대한 A. tumefaciens 형질 전환 효율을 검정하기 위해 GUS staining 분석을 수행한 것으로서 대부분의 밀 형질전환 연구가 특정 품종에 국한되어 있기 때문에 국내 장려 밀 품종에 대한 형질전환 효율에 영향을 미치는 조건에 대한 검정이 필요하다. 국내 밀 품종 중 32개에서 1개 이상의 조직에 염색된 신호가 관찰되었으며 4개 품종에서는 염색된 신호가 관찰되지 않았고 6개 품종에서 과도한 A. tumefaciens 성장이 관찰되었고, 7개 품종은 미성숙배의 크기 등의 이유로 GUS staining 분석이 불가능하여 추가 분석에서 제외하였다. 국내 밀 품종별 A. tumefaciens 감염 효율 비교 결과, 백립계 8개 품종 및 적립계 28개 품종에서는 평균적으로 유의한 차이가 없었다. 특히 조농밀, 조품밀, 새올밀, 조중밀, 새금강밀 등 적립계 품종에서 90% 이상의 높은 감염 효율이 관찰되었고, 전체 품종 중 22개는 50% 이상의 효율을 나타내었다. 본 연구를 통하여 조농밀 및 새올밀은 미성숙배에서 전체 조직에서 강한 GUS 발현으로 형질전환에 적합한 품종으로 나타났으며 금강 품종은 백립계에서 상대적으로 높은 발현을 보여 A. tumefaciens을 이용한 형질전환에 적합한 것으로 확인되었다. 추가적인 연구를 통해 품종의 조직배양 효율을 검정하고, 안정적인 GUS 발현 효율을 조사하는 것이 필요하며, 이를 통해 밀 형질전환에 이용 가능한 품종을 더욱 정밀하게 선발할 수 있을 것으로 판단된다. 해당 연구 결과는 국내 밀품종의 형질전환 효율을 높이기 위한 기초 자료로 활용 가능할 것이다.