• 생명과학회지
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• 제19권7호
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• pp.845-851
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• 2009

본 연구는 5-L 발효기를 이용하여 재조합 고스트 박테리아(E.coli $DH5{\alpha}$/ pHCE-InaN-(enolase, GAPDH, sagA or piaA)-ghost 37 SDM) 백신의 산업화를 위해 탄소원 공급조건, 교반속도, 산소공급 조건등의 최적 배양조건과 고스트 박테리아 발현 유도를 위한 온도조절 시점과 그에 따른 발현효율 최적화를 조사하기 위해 수행하였다. 각각 다른 4종의 항원 유전자를 보유한 고스트 박테리아를 LB 배지를 이용하여 배양한 결과 모두 1 g / 1 glucose, 300 rpm, 1vvm에서 최대 균주 성장을 나타내었다. 고스트 박테리아 생성 효율의 경우 초기 대수증식기(OD$_{600}$=1.0)에서 고스트 발현을 유도했을 때 각각 최대효율인 99.99%를 나타내었으나 증기 대수증식기(OD$_{600}$=2.0)와 말기 대수증식기 (OD$_{600}$=3.0)에서는 고스트 박테리아 생성이 낮은 효율을 나타내었다. 또한 SDS-PAGE 와 western blot를 이용하여 각각 다른 4종의 항원 단백질 발현 여주를 확인한 결과 enolase (78kda), GAPDH (67kda),sagA(26kDa), piaA(26kDa)에서 항원 단백질 band를 확인할 수 있었다. 따라서 본 연구결과 확립된 배양 조건과 발현효율 최적화 조건은 연쇄구균증 질병에 대해 E.coli를 이용한 고스트 박테리아 백신이 양식 산업에 있어 상업적으로 유용한 백신의 최적생산을 위해 사용 될 수 있을 것으로 사료된다.

• Molecules and Cells
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• 제40권3호
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• pp.230-242
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• 2017

In the Arabidopsis genome, approximately 80 MAP3Ks (mitogen-activated protein kinase kinase kinases) have been identified. However, only a few of them have been characterized, and the functions of most MAP3Ks are largely unknown. In this paper, we report the function of MAP3K16 and several other MAP3Ks, MAP3K14/15/17/18, whose expression is salt-inducible. We prepared MAP3K16 overexpression (OX) lines and analyzed their phenotypes. The result showed that the transgenic plants were ABA-insensitive during seed germination and cotyledon greening stage but their root growth was ABA-hypersensitive. The OX lines were more susceptible to water-deficit condition at later growth stage in soil. A MAP3K16 knockout (KO) line, on the other hand, exhibited opposite phenotypes. In similar transgenic analyses, we found that MAP3K14/15/17/18 OX and KO lines displayed similar phenotypes to those of MA3K16, suggesting the functional redundancy among them. MAP3K16 possesses in vitro kinase activity, and we carried out two-hybrid analyses to identify MAP3K16 substrates. Our results indicate that MAP3K16 interacts with MKK3 and the negative regulator of ABA response, ABR1, in yeast. Furthermore, MAP3K16 recombinant protein could phosphorylate MKK3 and ABR1, suggesting that they might be MAP3K16 substrates. Collectively, our results demonstrate that MAP3K16 and MAP3K14/15/17/18 are involved in ABA response, playing negative or positive roles depending on developmental stage and that MAP3K16 may function via MKK3 and ABR1.

• 미생물학회지
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• 제45권4호
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• pp.291-299
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• 2009

본 연구에서는 Human HtrA3 (HtrA3)의 효소활성을 분자수준에서 연구하기 위해 HtrA간의 상동성과 기존에 알려진 maturation site들을 비교 분석하여 예상 mature HtrA3인 M1-HtrA3와 M2-HtrA3를 발현하는 construct를 제작하였다. pGEX system을 통해 Top10 균주에서 발현, 정제한 M1-HtrA3 단백질은 $10{\mu}g$/L를 정제할 수 있었으며 발현량 대비 1%를 회수할 수 있었다. M2-HtrA3는 M1보다 5배 가량 많은 양을 정제할 수 있었으며 발현량 대비 회수율은 3배 정도 더 높았다. $\beta$-Casein을 이용한 in vitro cleavage test를 통해 M1, M2 form 모두 protease 활성을 갖는 것을 확인하였다. 또한, $\beta$-casein cleavage를 통해 HtrA serein protease들 간의 상대적인 활성을 비교한 결과, HtrA3와 HtrA2는 HtrA1보다 약 2배 더 높은 proteolytic cleavage 활성을 보였다. 본 연구에서 정립한 protease 활성을 지닌 HtrA3의 제작과 정제 조건은 HtrA3의 substrate를 탐색을 용이하게 할 수 있을 것이며, HtrA3 연관된 질환의 발병기전과 세포 신호전달을 이해하는 연구에 활용될 수 있을 것이다.

• 생명과학회지
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• 제15권4호
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• pp.542-547
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• 2005

시스플래틴이나 마이토마이신 C (MMC)와 같은 DNA 사슬간 교차결합 (interstrand cross-link ; ICL) 물질에 대해 Brca1 결손세포들이 보이는 높은 감수성은 Brca1 단백질이 세포의 ICL복구반응에 중요한 역할을 담당하고 있음을 암시하고 있다. Brca1 단백질은 재조합 의존성 또는 재조합 비의존성 경로를 통한 DNA 이중사슬 절단(double-strand break ; DSB) 복구에 필수적인 역할을 담당한다. 최근 본인이 속한 연구그룹에서 재조합 의존성 경로를 통한 세포의 ICL복구반응에 Brca1이 관여한다는 것을 밝혀 보고한바 있다. 본 연구에서는 Brca1 단백질의 재조합 비의존성 복구반응에 대한 관여여부를 $p53^{-/-}$와 $p53^{-/-}\;Brcal^{-/-}$ 세포주를 사용하여 연구하였다. 교차결합 복구 실험에서 Brca1 결손 세포주는 Brca1 정상 세포주보다 현저히 낮은 활성을 보였다. 또한, Brca1 결손세포 주의 MMC 에 대한 감수성과 ICL복구능이 Brca1 단백질 발현을 통해 회복되는 것을 확인하였다. 흥미롭게도, Brca1의 11번 엑손 결손세포주 $(Brca1^{\Delta11})$는 높은 MMC저항성과 ICL 복구능을 보였다. 이러한 결과들을 종합하여 볼 때, Brca1 단백질은 ICL복구에 재조합 의존성 경로뿐만 아니라 재조합 비의존성 경로를 통해서도 관여하며, 이러한 활성에는 엑손 11 부분이 아닌 N 말단의 RING 핑거 도메인이나 C 말단의 BRCT도메인이 중요하다는 것을 알 수 있다.

• Journal of Microbiology and Biotechnology
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• 제26권6호
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• pp.1115-1123
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• 2016

_L-Asparaginase (E.C. 3.5.1.1) is an enzyme involved in asparagine hydrolysis and has the potential to effect leukemic cells and various other cancer cells. We identified the _L-asparaginase gene (_L-ASPG86) in the genus Mesoflavibacter, which consists of a 1,035 bp open reading frame encoding 344 amino acids. Following phylogenetic analysis, the deduced amino acid sequence of _L-ASPG86 (_L-ASPG86) was grouped as a type I asparaginase with respective homologs in Escherichia coli and Yersinia pseudotuberculosis. The _L-ASPG86 gene was cloned into the pET-16b vector to express the respective protein in E. coli BL21 (DE3) cells. Recombinant _L-asparaginase (r-_L-ASPG86) showed optimum conditions at 37-40℃, pH 9. Moreover, r-_L-ASPG86 did not exhibit glutaminase activity. In the metal ions test, its enzymatic activity was highly improved upon addition of 5 mM manganese (3.97-fold) and magnesium (3.35-fold) compared with the untreated control. The specific activity of r-_L-ASPG86 was 687.1 units/mg under optimum conditions (37℃, pH 9, and 5 mM MnSO₄).

• 한국미생물·생명공학회지
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• 제40권3호
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• pp.274-277
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• 2012

본 연구에서는 다제내성을 보이는 인체 병원균의 하나인 S. aureus에서 유래된 FtsZ 단백질의 유전자를 클로닝하고 대장균에 형질전환하여 재조합 단백질을 만들고, in vitro 상에서 폴리머 형성 활성을 측정하였다. Bradford 방법을 이용하여 SA FtsZ단백질의 농도를 측정한 후, SA FtsZ단백질의 폴리머 형성 활성을 확인하기 위해 형광계를 이용하여 excitation 방향과 $90^{\circ}$의 방향에서 산란되는 빛의 양을 측정하는 방법을 사용하였을 때에 대조군에서는 빛이 산란되지 않았고, SA FtsZ 단백질에 GTP와 $Mg^{2+}$를 처리한 실험군에서만 빛이 산란되는 현상을 관찰하였다. 1분여의 시간이 지난 이후에는 다시 산란되는 빛이 줄어드는 것을 볼 수 있는데, 이것은 SA FtsZ 단백질의 아미노말단 도메인의 GTPase 활성에 의해서 GTP가 분해되어서 SA FtsZ 단백질의 폴리머가 단량체로 분해되었기 때문이라고 예측된다. 본 연구를 통하여 확립된 SA FtsZ 활성 측정 방법은 향후 SA FtsZ 단백질의 폴리머 형성을 저해하는 방식으로 S. aureus를 표적으로 하는 항생제 후보물질 도출을 위한 스크리닝 방법으로 사용될 수 있을 것이다.

• Applied Biological Chemistry
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• 제38권3호
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• pp.224-231
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• 1995

형질전환 식물체에서 외래 단백질의 발현을 높이기 위하여, 외래 단백질 유전자를 TMV RNA 또는 Gy2 5'-untranslated leader 부위와 재조합시킨 plasmid들을 제조하였다. pGA643에서 유래된 이들 plasmid에는 cauliflower mosaic virus의 35S promoter와 Gy2 terminator를 포함하고 있고, 외래 유전자로는 옥수수의 10kDa zein (10kZ) 유전자를 사용하였다. Gy2 또는 TMV RNA의 leader 부위는 promoter 부위와 단백질 coding sequence 사이에 삽입하였다. Agrobacterium을 매개로 하는 leaf disc 형질전환법을 이용하여 재조합 단백질들을 담배에 도입하였다. Leader를 포함하지 않은 도입 유전자의 전사 효율이 leader를 포함하는 도입 유전자들 보다 높았지만, leader를 포함한 mRNA들이 보다 효율적으로 전사되었다. 이는 5'-untranslated sequence의 길이와 AUG codon 주위의 context에 의한 영향보다는 이들 leader sequence의 특이적 염기서열에 의한 영향이 큼을 의미한다. 이러한 결과는 형질전환된 담배에서 외래 유전자의 전이효율을 조절하는 데 있어서 Gy2와 TMV의 leader sequence들이 enhancer로서 역할을 하고 있음을 의미한다.

• 미생물학회지
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• 제36권3호
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• pp.203-208
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• 2000

재조합 플라스미드 pAL850에 함유된 Bacillus circulans KCTC3004 $\alpha$-amylase 유 전자를 pUB110을 이용하여 shuttle 플라스미드 pALS111을 만들어 Bacillus 세포에 이동. 발현시켰다. Bacillus subtilis(고초균)와 Bacillus megaterium(거대균)으로 형질전환된 pALS111로부터 $\alpha$-amylase는 세포증식과 비례하여 생산되었다. 형질전화주가 생산하는 $\alpha$ -amylase의 최대활성을 유전자 공여 균주인 B. circulans와 비교했을 때 고초균은 약 95배, 거대균은 약 34배 정도의 높은 활성을 나타내었다. 그리고 대장균 형질전환주는 분비율이 10% 정도인데 반하여 고초균 형질전화주는 생산된 효소전부를 , 거대균 형질전환주는 약 98%를 세포외로 분비함을 보임으로써 고초균과 거대균은 실용적인 면에서 대장균보다 우월 함을 나타내었다, pALS111의 각 숙주 내에서의 안정성을 살펴본 결과 거대균에서는 92%, 고초균에서는 76%, 대장균에서는 38% 로 나타났다. SDS-PAGE와 zymogram을 통해 추정 된 대장균과 고초균, 거대균에서 발현된 효소의 분자량은 약 55,000으로 확인되었다. 이들 형질전환주가 생산하는 $\alpha$-amylase는 starch 에 작용하여 주된산물로서 maltotriose 이상의 다양한 maltooligosaccharide들을 생산함이 확인 되었다.

• 미생물학회지
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• 제47권4호
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• pp.328-334
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• 2011

Leucine zipper motif는 여러 개의 주기적인 leucine 잔기로 구성되어 amphipathic alpha helix형태의 구조를 나타내며 소수성 결합에 의해 이량체를 형성한다. 이 leucine zipper motif를 single chain Fv 항체의 C-terminus에 도입하면 leucine zipper motif의 소수성 결합에 의해 amphipathic alpha helix의 이량체가 형성되면서 융합된 single chain Fv 항체의 이량체 (Dimer) 형성 또한 유도할 수 있다. 이량체 형태의 single chain Fv 항체는 2개의 항원 결합부위를 갖게 되므로 단량체 형태의(monomer) single chain Fv 항체에 비해 항원 결합력(Avidity)이 증가 될 것이다. 이 개념에 기초하여 이전 연구에서 제조된 단량체 형태인 닭 single chain Fv 항체인 8C3 ScFv 항체의 C-terminus에 leucine zipper motif를 도입하여 이량체 형태의 8C3 ScFv 항체를 개발하였다. 이량체 8C3 ScFv 항체는 가금류의 대표적인 기생충 질병인 coccidiosis를 유발하는 Eimerian sporozoite에 특이적으로 결합하는 기능을 나타내었다. 또한 이량체 8C3 ScFv 항체는 avidity 증가로 인하여 단량체에 비해 항원 결합력이 약 3배 증가됨을 확인할 수 있었으며 단백질 회수율 또한 2배 증가되는 부수적인 효과를 얻을 수 있었다.

• Parasites, Hosts and Diseases
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• 제57권6호
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• pp.671-680
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• 2019

Cathepsin D (CatD, EC 3.4.23.5) is a member belonging to the subfamily of aspartic endopeptidases, which are classified into the MEROPS clan AA, family A1. Helminth parasites express a large set of different peptidases that play pivotal roles in parasite biology and pathophysiology. However, CatD is less well known than the other classes of peptidases in terms of biochemical properties and biological functions. In this study, we identified 2 novel CatDs (CsCatD1 and CsCatD2) of Clonorchis sinensis and partially characterized their properties. Both CsCatDs represent typical enzymes sharing amino acid residues and motifs that are tightly conserved in the CatD superfamily of proteins. Both CsCatDs showed similar patterns of expression in different developmental stages of C. sinensis, but CsCatD2 was also expressed in metacercariae. CsCatD2 was mainly expressed in the intestines and eggs of C. sinensis. Sera obtained from rats experimentally infected with C. sinensis reacted with recombinant CsCatD2 beginning 2 weeks after infection and the antibody titers were gradually increased by maturation of the parasite. Structural analysis of CsCatD2 revealed a bilobed enzyme structure consisting of 2 antiparallel β-sheet domains packed against each other forming a homodimeric structure. These results suggested a plausible biological role of CsCatD2 in the nutrition and reproduction of parasite and its potential utility as a serodiagnostic antigen in clonorchiasis.