• Journal of Microbiology and Biotechnology
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• 제26권9호
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• pp.1542-1550
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• 2016

This is the first report that paromomycin, an antibiotic derived from Streptomyces sp. AG-P 1441 (AG-P 1441), controlled Phytophthora blight and soft rot diseases caused by Phytophthora capsici and Pectobacterium carotovorum, respectively, in chili pepper (Capsicum annum L.). Chili pepper plants treated with paromomycin by foliar spray or soil drenching 7 days prior to inoculation with P. capsici zoospores showed significant (p < 0.05) reduction in disease severity (%) when compared with untreated control plants. The disease severity of Phytophthora blight was recorded as 8% and 50% for foliar spray and soil drench, respectively, at 1.0 ppm of paromomycin, compared with untreated control, where disease severity was 83% and 100% by foliar spray and soil drench, respectively. A greater reduction of soft rot lesion areas per leaf disk was observed in treated plants using paromomycin (1.0 μg/ml) by infiltration or soil drench in comparison with untreated control plants. Paromomycin treatment did not negatively affect the growth of chili pepper. Furthermore, the treatment slightly promoted growth; this growth was supported by increased chlorophyll content in paromomycin-treated chili pepper plants. Additionally, paromomycin likely induced resistance as confirmed by the expression of pathogenesis-related (PR) genes: PR-1, β-1,3-glucanase, chitinase, PR-4, peroxidase, and PR-10, which enhanced plant defense against P. capsici in chili pepper. This finding indicates that AG-P 1441 plays a role in pathogen resistance upon the activation of defense genes, by secretion of the plant resistance elicitor, paromomycin.

• Journal of Plant Biotechnology
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• 제35권4호
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• pp.275-280
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• 2008

Agrobacterium공동배양법으로 오이의 기관발생을 통한 형질전환에서 가장 문제점 중 하나는 chimeric 형질전환체의 발생빈도이다. 이러한 문제점을 극복하기 위하여 항생제로서 paromomycin이 첨가된 선발배지에서 "은성" 품종의 배축절편으로부터 체세포배발생을 통한 형질전환시스템을 개발하였다. 배축절편을 pPPTN290발현벡터가 도입된 Agrobacterium 균주 (EHA101)에 30분간 접종한 후 2일간 공동배양 하였고, 선발배지에서 2주 간격으로 5회 계대 배양하면서 항생제 저항성 캘러스 선발, 체세포배발생 및 식물체를 유도하였다. pPPTN290발현벡터의 T-DNA는 reporter유전자로서 Ubi 프로모터에 의해 gus유전자가 발현조절 되도록 그리고 항생제로서 paromomycin에 저항성을 갖는 nptII유전자가 35S 프로모터에 의해 발현되도록 제조하였다. 안정적 형질전환과 빈도는 캘러스의 paromomycin항생제 저항성과 GUS유전자의 발현 여부에 의해 조사하였다. Agrobacterium과 공동배양한 928개의 배축절편에서 paromomycin에 저항성을 갖는 56개의 캘러스 클론을 얻었고, 이중 48개 캘러스 클론 (5.2%)에서 GUS유전자가 안정적으로 발현되고 있음을 확인하였다. 48개의 캘러스 클론중에서 오직 5개의 캘러스 클론으로부터 식물체를 얻어 낮은 빈도 (0.5%)를 나타냈다. 수확한 $T_1$종자에서 GUS양성반응은 gus유전자가 오이 게놈에 안정적으로 도입 및 발현되고 있음을 확인하였다.

• Journal of Plant Biotechnology
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• 제33권4호
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• pp.271-276
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• 2006

정상' 배추와 '서울' 배추의 배축절편을 선발마커로서 hygromycin 저항성유전자를 갖고 있는 pCAMBIA1301와 paromomycin저항성유전자를 갖고 있는 pPTN290으로 각각 형질 전환된 LBA4404 또는 EHA101균주와 공동배양한 후 선발배지에서 배양하면서 형질전환체를 선발하였다. 형질전환빈도는 사용된 항생제와 품종에 따라서 현저하게 차이가 있었으며, 특히 paromomycin은 hygromycin보다 효과적이었고 정상 배추는 서울배추보다 양호하였다. 가장 높은 형질전환빈도는 (0.70%) 100mg/L paromomycin이 첨가된 선발배지에서 정상배추의배축을 배양할 경우 얻어졌다. GUS양성반응으로 확인 한 결과 정상배추에서 9개체와 서울배추에서 3개체를 각각 얻었으며, 온실에서 생장한 후 $T_1$종자를 수확하였다. $T_1$ 종자를 다시 발아시켜 유식물체를 얻은 후 GUS양성반응을 확인함으로서 외래유전자가 안정적으로 발현하고 있음을 확인하였다.

• Journal of Plant Biotechnology
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• 제34권4호
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• pp.375-380
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• 2007

국내 옥수수 순계주에서 Agrobacterium 공동배양으로 CP4 5-Enol-pyruvylshikimate-3-phosphate synthase (CP4 EPSPS) 유전자가 도입된 제초제저항성식물체를 개발하였다. 5개의 순계주 (HW1, KL103, HW3, HW4, HW7)의 미숙배를 Ubiquitin promoter-CP4 EPSPS 유전자와 CaMV35S promoter-nptII 유전자가 발현되도록 제조된 pCAMBIA2300 벡터를 C58C1 Agrobacterium에 형질전환하여 공동 배양하였다. 항생제로 paromomycin이 첨가된 배지에서 선발된 옥수수 형질전환체를 PCR, RT-PCR 및 Northern 분석을 통하여 유전자의 도입과 발현을 확인하였다. 또한 형질전환 식물체의 glyphosate 처리에 따른 shikimate 축적반응을 확인하였다. Paromomycin 저항성 캘러스 형성빈도는 옥수수 각 순계주 HW1, KL103, HW3, HW4, HW7에서 각각 0.37%, 0.03%, 2.20%, 2.37%, 0.81%로 나타났으며, PCR분석을 통하여 최종적으로 2개의 옥수수 순계주 (HW3, HW4)의 paromomycin 저항성 캘러스로부터 분화된 식물체에서 확인하였다. 이러한 형질전환체중에서 RT-PCR 및 Nothern blot 분석을 통하여 CP4 EPSPS 유전자가 발현되는 2개의 계통 (M266, M104) 을 선발하였고, shikimate 축적반응을 통하여 glyphosate에 대한 저항성을 갖는 계통 (M266)을 최종적으로 선발하였다. 이러한 결과는 국내 옥수수 순계주에서 제초제저항성을 갖는 옥수수 형질 전환체를 개발할 수 있음을 시사한다.

• Journal of Plant Biotechnology
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• 제34권2호
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• pp.139-144
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• 2007

'정상' 배추의 배축절편을 선발마커로서 paromomycin 저항 성유전자를 갖고 있는 pPTN290으로 각각 형질전환된 EHA101, LBA4404, GV3101균주와 공동배양한 후 갤러스유도배지에서 형질전환캘러스를 얻은 후, 뿌리유도배지에서 부정근을 그리고 신초유도배지에서 신초를 각각 순차적으로 유도하였다. 형질전환캘러스를 얻은 후, 뿌리유도배지에서 부정근을 그리고 신초유도배지에서 신초를 가각 순차적으로 유도하였다. 형질전환캘러스 형성은 Agrobacterium균주에 따라 차이가 있었으며, 특히 EHA101균주에 공동배양된 배축절편으로부터 최대 6.1%까지 얻어졌다. 또한 각각의 형질전환캘러스 클론으로부터 형질전환 부정근과 신초 발생은 EHA101균주에서 60.7%와 38.2%, LBA4404에서 8.3%와 0%, GV3101에서 20.5%와 85.7%까지 각각 얻을 수 있었다. 형질전환식물체는 특별한 형태적 이상 없이 온실에서 정상적으로 자라 $T_{2}$종자를 얻을 수 있었다. GUS방법으로 7개의 후대 유식물체를 분석한 결과 gus유전자가 안정적으로 발현하고 있음을 확인하였고, 배추 genome에 single 또는 multiple copy로 전달되고 있음을 추측할 수 있었다.

• Journal of Plant Biotechnology
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• 제38권3호
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• pp.198-202
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• 2011

Agrobacterium과 자엽절 절편 공동배양으로 오이 형질전환체를 생산하였다. 오이 자엽절 절편 (c.v. Eunsung)은 선발 마커로서 nptII유전자와 유용유전자로서 DQ유전자가 포함된 pPZP211를 EHA101에 형질전환하여 공동 배양하였다. 3회 반복실험으로부터 평균 형질전환 빈도는 4.01%를, 최대 빈도는 5.97%를 보여 주었다. Paromomycin항생제 저항성을 갖는 9개의 식물체를 선발과정을 통해 얻었으며, Southern blot 분석에 의해 6개 식물체의 genome에 nptII유전자자 안정적으로 도입되어 있음을 확인할 수 있었다.

• Journal of Plant Biotechnology
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• 제34권1호
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• pp.37-45
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• 2007

수박은 형질전환이 매우 어렵고 직접적인 신초 유도방법으로는 안정된 형질전환을 기대할 수 없어서, 다른 여러 작물에서 높은 효율을 보였던 캘러스 유래 신초 유도 방법을 도입하고자 하였다. 수박의 최적 캘러스 유도조건은 자엽 절편체의 경우 2.0 mg/L zeatin과 0.1 mg/L IAA이었으며 뿌리 절편체의 경우 2.0 mg/L BA와 0.1 mg/L 2,4-D이었다. NptII 유전자의 선발 항생제는 kanamycin보다는 paromomycin 빠르고 효과적이었으며, 수박의 절편체에 Agrobacterium을 접종 한 후 paromomycin을 125 mg/L 첨가한 배지에서 선발하였다. pmGFP5-ER vector로 형질전환한 후 캘러스 상태에서 형광현미경을 통해 GFP 유전자의 도입을 확인하였으며, 딱딱한 초록색의 캘러스에서 강한 GFP 발현을 관찰하였고, 자엽유래 캘러스의 경우 WM8에서 9.0%, 뿌리유래 캘러스의 경우 WM6에서 8.3%의 가장 높은 GFP 발현 효율을 보였다. GFP 유전자 도입과 같은 방법으로 WMV-CP 유전자가 있는 pWMV2300 vector로 형질전환한 후 캘러스 상태에서 PCR 및 Southern blot 분석을 한 결과, 두 점의 캘러스에서 WMV-CP 유전자가 도입되었음을 확인하였다. 본 연구를 통하여 확립된 수박의 캘러스 유도 시스템은 안정된 수박 형질전환 방법에 기초 자료로서 이용될 것이다.

• Journal of Plant Biotechnology
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• 제32권2호
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• pp.91-95
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• 2005

옥수수 미숙배배양과 Agrobacterium tumefaciens공동배양법에 의해 형질전환체를 생산하였다. Hi II계통의 미숙배를 Ubiquitin 1 promoter-GUS유전자와 선발마커로서 nptII 유전자로 제작된 pPTN290벡터를 C58C1에 도입한 후 형질전환 균주로 사용하였다. 7개의 paromomycin저항성 배 발생캘러스를 얻었으며, GUS양성반응을 나타내는 7개의 독립적인 식물체를 얻었다. Southern분석법에 의하여 $T_1$세대 식물체로부터 nptII유전자가 안정적으로 도입되어 있음을 확인하였다.

• Journal of Plant Biotechnology
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• 제37권3호
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• pp.313-318
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• 2010

돼지 흉막폐렴백신을 개발하기 위해 옥수수 HiII genotype 으로부터 유도한 type II형의 배발생캘러스를 식물발현벡터 pMYV611, pMYV613, pMYV616, V621, V622 및 V623로 형질전환시킨 Agrobacterium (C58C1)과 공동배양 하였다. 이들 식물발현벡터는 paromomycin 항생제 저항 유전자인 NPTII 선발마커와 표적 유전자로서 흉막폐렴균의 여러 가지 혈청을 생산하는 apxIIA유전자로 재조합하여 구축하였다. 식물발현벡터pMYV611, pMYV613, pMYV616, V621, V622 및V623의 경우 각각 4,120개, 5,959개, 7,581개, 52,329개, 48,948개 및 56,188개의 캘러스 클론을 Agrobacterium과 공동한 후 NPTII assay kit에 의해 nptII유전자의 발현빈도를 조사한 결과 각 벡터별로 2.3-4.4%의 캘러스 클론에서 항체결합 양성반응을 보였고, 이들 중 최종적으로 선발된 형질전환 캘러스 클론은 pMYV611에서 3개 (0.07%), pMYV613에서 4개 (0.07%), pMYV616에서 2개 (0.02%), V621에서 51개 (0.1%), V622에서 72개 (0.15%) 및 V623에서 102개 (0.18%)를 각각 얻었다. 형질전환된 캘러스 클론으로부터 재분화된 식물체에서 유전자 도입여부를 Southern 분석으로 통해 확인한 결과 pMYV613에서 2개 식물체 및 V623에서 얻은 2개 식물체에서 각각 확인되었다.

• Journal of Plant Biotechnology
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• 제40권4호
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• pp.198-202
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• 2013

환경스트레스 저항성 오이 형질전환체 생산을 위해서 오이 "Eunsung" 품종의 자엽절 절편을 Nit유전자를 포함하는 pPZP211와 pCAMBIA2300 발현벡터로 각각 형질전환된 Agrobacterium과 공동 배양하였다. 공동배양 후 형질전환체 선발, 형질전환체 유도, 신장, 유식물체 생산 등은 자엽절 절편을 이용하는 CTM방법(Jang et al. 2011)에 따라 수행하였다. 발현벡터에 따라 선발배지에 100 mg/L paromomycin을 첨가하여 선발과정을 거쳤으며, 선발배지에서 3 cm크기의 shoot를 유도한 후 PCR, Southern, RT-PCR 및 Northern분석을 통해 형질전환 여부를 확인하였다. 공동배양 한 2,547개의 자엽절 절편으로부터 105개체(4.12%)가 선발배지로부터 얻어졌으며, 그들 중 45개체(1.77%)만이 Nit유전자의 PCR product를 얻을 수 있었다. 오이 genome에 Nit유전자의 도입여부를 확인하기 위하여 45개체에 대한 Southern분석을 수행한 결과 각각 39개체(1.53%)서 확인할 수 있었으며, 이중 오직 6개체(0.24%)에서만 Nit유전자가 안정적으로 발현되고 있음을 RT-PCR과 Northern분석을 통해 확인하였다. 이러한 결과는 Nit유전자가 오이 genome에 안정적으로 도입 및 발현되고 있음을 보여 주고 있음을 알 수 있었다.