리그닌 분해에 관련된 효소 중 laccase는 구리 결합부위가, lignin peroxidase와 manganese peroxidase는 헴(heme) 결합부위의 아미노산 서열이 잘 보존된 단백질들이다. 국내에서 분리한 구름버섯(Trametes versicolor)을 대상으로 관련 유전자들의 보존된 지역의 염기서열을 근거로 중합연쇄반응(PCR)에 필요한 primer를 제작하였고, 이를 사용하여 해당 유전자의 조각을 확보하였다. 이를 pGEM-T vector에 cloning하고 그 염기서열을 분석한 결과 약 1.3 kb의 laccase조각은 다른 백색부후균의 laccase와 65~97%의 상동성을 보였다. 또한 185 bp의 lignin peroxidase 조각과 443 bp의 manganese peroxidase조각을 타 백색부후균의 효소들과 비교한 결과 각각 80~95% 및 61~83%의 상동성을 보였다.
Lignocellulose 분해 이용을 위해 토양 등에서 lignin분해 능력이 우수한 세균을 분리 및 동정함으로서 방향족 화합물의 이용을 위한 생물전환의 기초를 확보하고자하였다. 토양 등의 시료로부터 38주의 리그닌 분해 균주를 분리하였다. 분리된 LG2를 공시 균주로 선정하여 형태학적, 배양학적 및 생리학적 특성을 조사한 결과 Pseudomonas sp. LG2로 명명하였다. 이 균주는 리그닌을 분해 할 수 있었으며, 리그닌 함유 배지에 배양하여 배양 분해 산물을 HPLC로 분석한 결과 다수의 방향족 화합물을 생산하였다 Poylacrylamide gel활성 분석에 의해서 3종류로 구성된 peroxidase가 조사되었다.
Mechanism of lignin biodegradation caused by basidiomycetes and the history of lignin biodegradation studies were briefly reviewed. The important roles of fungal extracellular ligninolytic enzymes such as lignin and manganese peroxidases (LiP and MnP) were also summarized. These enzymes were unique in their catalytic mechanisms and substrate specificities. Either LiP or MnP system is capable of oxidizing a variety of aromatic substrates via a one-electron oxidation. Extracellular fungal system for aromatic degradation is non-specific, which recently attracts many people working a bioremediation field. On the other hand, an intracellular degradation system for aromatic compounds is rather specific in the fungal cell. Structurally similar compounds were prepared and metabolized, indicating that an intracellular degradation strategy consisted of the cellular systems for substrate recognition and metabolic response. It was assumed that lignin-degrading fungi might be needed to develop multiple metabolic pathways for a variety of aromatic compounds caused by the action of non-specific ligninolytic enzymes on lignin. Our recent results on chemical stress responsible factors analyzed using mRNA differential display techniques were also mentioned.
One of the most economically viable processes for the bioconversion of many lignocellulosic waste is represented by white rot fungi. Phanerochaete chrysosporium is one of the important commercially cultivated fungi which exhibit varying abilities to utilize different lignocellulosic as growth substrate. Examination of the lignocellulolytic enzyme profiles of the two organisms Phanerochaete chrysosporium and Rhizopus stolonifer show this diversity to be reflected in qualitative variation in the major enzymatic determinants (ie cellulase, xylanase, ligninase and etc) required for substrate bioconversion. For example P. chrysosporium which is cultivated on highly lignified substrates such as wood (or) sawdust, produces two extracellular enzymes which have associated with lignin deploymerization. (Mn peroxidase and lignin peroxidase). Conversely Rhizopus stolonifer which prefers high cellulose and low lignin containg substrates produce a family of cellulolytic enzymes including at least cellobiohydrolases and ${\beta}-glucosidases$, but very low level of recognized lignin degrading enzymes.
A screening has been performed to find hyper-ligninolytic fungi, which degtrade beech and pine lignin extensively in order to broaden the understanding of the ligninolytic enzymes elaborated by various white-rot fungi. One hundred and twenty two ligninolytic strains were selected from decayed woods with a selective medium for screening ligninolytic wood-rotting fungi. Two of them, Phanerochaete sordida YK-624 and YK-472, showed much higher ligninolytic activity and selectivity in beech-wood degradation than typical lignin-degrading fungi, phanerochaete chrysosporium and Coriolus versicolor. They also degraded birch dioxane lignin and residual lignin in unbleached kraft pulp(UKP) much more extensively than P. chrysosporium and C. versicolor. During fungal treatment of beech wood-powder, the fungus strain P. sordida YK-624 showed higher activity of extracellular manganese peroxidase (MnP) in the medium than P. chrysosporium. It also showed MnP activity, which would not be lignin peroxidast during treatment of oxygen-bleached kraft pulp(OKP) and under enzyme-inducing conditin.
목재부후균은 리그닌 분해효소로 lignin peroxidase (LIP), Mn-peroxidase (MNP) 및 laccase를 생성하는데 균류에 따라 위의 효소중 하나 혹은 둘 이상의 효소를 분비하거나 전혀 생성하지 않는 균도 있다. 본 실험은 이러한 목재 부후균의 효소생성 양상과 몇 종의 염료화합물 탈색과의 상관관계를 조사하고자 하였다. 조사한 23종 36균주 중 MNP 생성균은 30균주였으며 LIP 혹은 laccase 생성균은 각각 11균주와 12균주였다. 또한 같은 종에서도 효소활성은 다양한 양상을 보여 주었다. 리그닌 분해효소 활성과 비교하여 염료 탈색 정도는 세 효소가 모두 분비되는 백색 부후균의 경우 염료 탈색율이 상대적으로 우수하였고 균주에 따라 차이가 있으나 MNP 활성만을 갖는 균주의 경우, poly R-478 polymeric dye 및 anthron-type dye 인 remazol brilliant blue R염료는 효소 활성도와 다소 유연관계를 보였으며 methylene blue, bromophenol blue및 congo red 염료는 위의 효소들과는 직접적인 관련이 없는 것으로 판단되었으며, 오히려 균사의 생장과 비례하여 탈색율을 나타냈다. LIP, MNP 및 laccase 효소활성이 거의 검출되지 않은 갈색 부후균에서는 bromophenol blue를 제외하고는 염료의 탈색이 10%미만 혹은 전혀 탈색이 되지 앓았다.
구름버섯(Trametes versicolor)은 phenolic compound인 CV와 MG를 효과적으로 탈색할 수 있었으며 고체와 액체배양 상태 모두에서 CV보다 MG를 더 효과적으로 탈색시켰다. 구름버섯에 의한 두 색소의 탈색 과정에서 phenolic compounds를 분해하는 것으로 알려진 세 가지 효소 중 laccase의 활성이 가장 높았다. MnP 역시 적은 수치지만 활성을 나타냈으며 LiP의 활성은 나타나지 않았다. 따라서 구름버섯에 의한 합성염료의 분해과정에서 laccase가 주로 사용되고 MnP는 탈색과정에서 보조적인 작용을 하는 것으로 추정된다. 그러나 CV의 경우 MnP가 활발하게 염료분해에 관여하는 것으로 판단된다. 또한 MG가 대부분 탈색되었을 때의 laccase 활성(0.16 U/mg)이 CV가 대부분 탈색되었을 때의 활성(0.23 U/mg)보다 현저하게 낮은 것으로 보아 구름버섯이 CV를 탈색시키는데 더 높은 활성의 laccase가 필요로 하는 것이 밝혀졌다. 본 실험에서 한국산 구름버섯 종의 CV와 MG 탈색능력이 확인되었으며 앞으로 한국산 구름버섯을 이용한 triphenyl methane계에 속하는 합성염료의 분해에 관한 친환경적 처리기술 개발에 도움이 될 것으로 기대된다.
백색부후균류가 가지는 리그닌 분해효소들은 기질특이성이 넓기 때문에 다양한 난분해성 화합물들을 분해할 수 있다. 본 실험에서는 3가지 다른 방법을 사용하여 laccase와 manganese peroxidase가 각각 도입된 아교버섯 형질전환체의 배양 상등액 효소를 고정화 효소로 만들어 대표적 염료의 하나인 Remazol Brilliant Blue R (RBBR)의 탈색을 실험하였다. 그 결과 알긴산을 효소 용액과 직접 반응하여 만든 고정화 효소에서 48시간 반응 후 약 75% 탈색을 보였다. 비록 한번 사용했던 고정화 효소를 재사용하였을 경우 탈색능이 10-15% 정도 감소되었으나 본 실험에서 제시한 방법이 리그닌 분해효소의 고정화 효소 활용에 기여할 것으로 기대한다.
Wood-rotting basidiomycetous fungi are the most efficient degraders of lignin on earth. The white-rot fungus Phanerochaete chrysosporium has been used as a model microorganism in the study of enzymology and its application. Because of the ability of the white-rot fungus to degrade lignin, which has an irregular structure and large molecular mass, this fungus has also been studied in relation to degrading and mineralizing many environmental pollutants. The fungus includes an array of enzymes, such as lignin peroxidase (LiP), manganese-dependent peroxidase (MnP), cellobiose:quinone oxidoreductase, and $H_2O_2$-producing enzymes and also produces many other components of the ligninolytic system, such as veratryl alcohol (VA) and oxalate. In addition, the fungus has mechanisms for the reduction of degradation intermediates. The ligninolytic systems have been proved to provide reductive reactions as well as oxidative reactions, both of which are essential for the degradation of lignin and organopollutants. Further study on the white-rot fungus may provide many tools to both utilize lignin, the most abundant aromatic polymer, and bioremediate many recalcitrant organopollutants.
Lim, Seon-Hwa;Kwak, A Min;Min, Kyong-Jin;Kim, Sang Su;Kang, Hee Wan
한국균학회소식:학술대회논문집
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한국균학회 2014년도 추계학술대회 및 정기총회
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pp.19-19
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2014
Pleurotus ostreatus, P. eryngii, and Flammulina velutipes are major edible mushrooms that account for over 89% of total mushroom production in Korea. Recently, Agrocybe cylindracea, Hypsizygus marmoreus, and Hericium erinaceu are increasingly being cultivated in mushroom farms. In Korea, the production of edible mushrooms was estimated to be 614,224 ton in 2013. Generally, about 5 kg of mushroom substrate is needed to produce 1 kg of mushroom, and consequently about 25 million tons of spent mushroom substrate (SMS) is produced each year in Korea. Because this massive amount of SMC is unsuitable for reuse in mushroom production, it is either used as garden fertilizer or deposited in landfills, which pollutes the environment. It is reasonably assumed that SMS includes different secondary metabolites and extracellular enzymes produced from mycelia on substrate. Three major groups of enzymes such as cellulases, xylanases, and lignin degrading enzymes are involved in breaking down mushroom substrates. Cellulase and xylanase have been used as the industrial enzymes involving the saccharification of biomass to produce biofuel. In addition, lignin degrading enzymes such as laccases have been used to decolorize the industrial synthetic dyes and remove environmental pollutions such as phenolic compounds. Basidiomycetes produce a large number of biologically active compounds that show antibacterial, antifungal, antiviral, cytotoxic or hallucinogenic activities. However, most previous researches have focused on therapeutics and less on the control of plant diseases. SMS can be considered as an easily available source of active compounds to protect plants from fungal and bacterial infections, helping alleviate the waste disposal problem in the mushroom industry and creating an environmentally friendly method to reduce plant pathogens. We describe extraction of lignocellulytic enzymes and antimicrobial substance from SMSs of different edible mushrooms and their potential applications.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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