Antifungal bacteria for biological control of plant diseases or production of novel antibiotics to plant pathogens were isolated in 1997 from various soils of Ansung, Chunan, Koyang, and Paju in Korea. Sixty-four bacterial strains pre-screened from approximately 1,400 strains were tested on V-8 juice agar against eight plant pathogenic fungi using in vitro bioassay technique for inhibition of mycelial growth. Test pathogens were Alternaria mali, Colletotrichum gloeosporioides, C. orbiculare, Fusarium oxysporum f. sp. cucumerinum, F. oxysporum f. sp. lycopersici, Magnaporthe grisea, Phytophthora capsici, and Rhizoctonia solani. A wide range of antifungal activity of bacterial strains was found against the pathogenic fungi, and strain RC-B77 showed the best antifungal activity. Correlation analysis between inhibition of each fungus and mean inhibition of all eight fungi by 64 bacterial strains revealed that C. gloeosporioides would be best appropriate for detecting bacterial strains producing antibiotics with potential as biocontrol agents for plant pathogens.
Soil cyanobacteria isolated from the rice paddy fields of 10 different locations across Korea were evaluated by agar plate diffusion test for antifungal activity. Aqueous, petroleum ether, and methanol extracts from one hundred and forty two cyanobacterial strains belonging to the 14 genera were examined for antifungal properties against seven phytopathogenic fungi causing diseases in hot pepper (Capsicum annuum L). Of total cyanobacteria, nine cyanobacteria (6.34%) exhibited antifungal effects. The nine cyanobacteria selected with positive antifungal activities were two species of Oscillatoria, two of Anabaena, three of Nostoc, one of Nodularia, and one of Calothrix. Alternaria alternata and Botrytis cinerea were inhibited by nine and eight species of cyanobacteria, respectively. Rhizopus stolonifer was suppressed by only methanol extract of Nostoc commune FK-103. In particular, Nostoc commune FK-103 and Oscillatoria tenuis FK-109 showed strong antifungal activities against Phytophthora capsici. Their antifungal activity at the late exponential growth phase is related to the growth temperature and not associated with the growth parameters such as cell biomass and $chlorophyll-{\alpha}$ concentration. The high inhibition levels of antibiotics were 22.5 and 31.8 mm for N. commune FK-103 and O. tenuis FK-109, respectively. The optimal temperature for antibiotic productivity was $35^{\circ}C$.
Pseudomonas aeruginosa strain B5 with antagonistic activity against Phytophthora capsici and Magnaporthe grisea, was isolated from pepper-growing soil. From the culture of P. aeruginosa strain B5 grown on King's medium B, antibiotic substances were purified using XAD-2 column chromatography. XAD-2 eluates inhibited not only the mycelial growth of P. capsid and M. grisea, but also the development of Phytophthora blight on pepper plants. The crude antibiotic substances were further purified by using silica gel column chromatography, Sephadex LH-20 column chromatography, thin layer chromatography on silica gel plates, and high performance liquid chromatography. Silica gel column chromatogrphy gave good separation of the four antibiotic substances. The pure antibiotics P1, P2, and P3 finally purified by preparative HPLC inhibited the mycelial growth of P. capsici, at concentrations from 7 to 10 $\mu g/ml$. Only P1 and P2 had antifungal activity against M. grisea at 8 $\mu g/ml$. P1 and P3 were highly inhibitory to the mycelial growth of Botryosphaeria dothidea and Botrytis cinerea at relatively low concentrations. However, the three antibiotics had no antifungal activity against Rhizoctonia solani. The chemical structures of these antibiotics are being identified.
벼 교엽병 방제를 위한 새로운 항진균성 항물질을 개발하기 위하여 우리나라 전국 각지역에서 임의로 채취한 1600여점의 토양시료에서 방선균 1300여주를 분리하고 액침배양법, Denroid test, green house test 등으로 벼에 대한 생리독성이 없으면서 벼 교엽병에 치료효과를 나타내는 방선균 1주를 소요산 부근의 토양시료에서 분리, 선정하였다. 분러선정균의 배양액에서 항진균성 항생물로서 연한 황색의 무정형 분말과 백색침상결정의 두가지를 분리, 정제하였다.
항진균제를 개발하기 위하여 토양으로부터 700주의 세균, 방선균, 곰팡이를 분리하였으며, 이들 배양액을 조사한 결과 Candida albicans의 성장을 억제시킬 수 있는 LAM 97-44 균주를 항진균성 항생물질 생산균으로 선발하였다. 분리균주를 동정하기 위해 생산균 LAM 97-44 균주의 형태학적 특성, 배양학적 특성, 생리학적 특성, 균체성분 등을 조사하였다. LAM 97-44 균주는 $2{\sim}3{\times}1{\sim}1.5\;{\mu}m$ 크기의 포자를 형성하는 간균이며, 포자의 형태는 ellipsoid 형 이었다. LAM 97-44 균주는 arabinose, cellulose, xylose를 이용하지 못하였으나 fructose, glucose, glycerol, maltose, raffinose 등은 이용하는 것으로 나타났다. 지방산 분석결과는 iso-와 anteiso-인 성분으로 구성되어 있었으며, menaquinone은 Bacillus속 세균의 전형적인 isoprenoid 사슬이 7개인 menaquinone(MK-7)이었다. 이러한 결과를 종합하면 LAM 97-44 균주는 Bacillus subtilis와 유사한 균으로 동정되었다.
A potential biocontrol bacterium, YB-70 was isolated from a rhizosphere in suppressive soil and identified as a strain of Bacillus subtilis. In several biochemical and in vitro antibiosis tests on Fusarium solani with the culture filterates from B. subtilis YB-70, we found that antifungal mechanism of B. subtilis YB-70 was mediated by antibiotic substances produced from the bacterium. These antifungal substances were appeared to be hear-resistant, micromolecular, and ethy alcohol soluble. Antifungal agents produced by B. subtilis YB-70 showed strong inhibified against root-rotting fungi F. solani in in vivo pot test. An antifungal substance. YBS-1s, was purified from the culture broth of B. subtilis YB-70 by isoelectronic precipitation, silica gel column chromatography and Sephadex LH-20 column chromatography analysis by Fab-MASS, $^{1}$H-NMR, $^{13}$C-NMR, DEPT, and amino acid analyzer revealed that the YBS-1A was a peptide antibiotics of iturin class containing seven amino acids from five different groups, and the other(YBS-1B) was an analogue of iturin group composed of 11 amino acids with larher molecular weight of about 1, 500 dalton, which was lager than that of iturin A.
Bacillus strains produce various types of antibiotics, and random mutagenesis has traditionally been used to overproduce these natural metabolites. However, this method leads to the accumulation of unwanted mutations in the genome. Here, we rationally designed a single nucleotide substitution in the degU gene to generate a B. subtilis strain displaying increased plipastatin production in a foreign DNA-free manner. The mutant strain (BS1028u) showed improved antifungal activity against Pythium ultimum. Notably, pps operon deletion in BS1028u resulted in complete loss of antifungal activity, suggesting that the antifungal activity strongly depends on the expression of the pps operon. Quantitative real-time PCR and lacZ assays showed that the point mutation resulted in 2-fold increased pps operon expression, which caused the increase in antifungal activity. Likewise, commercial Bacillus strains can be improved to display higher antifungal activity by rationally designed simple modifications of their genome, rendering them more efficient biocontrol agents.
During the screening of antifungal antibiotics from microbial metabolites, we selected Pseudomonas aeruginosa KGM-100 showing powerful antagonistic activity against various phytopathogenic fungi. Antibiotics KGM-100A and KGM-100B were purified from the culture broth of Pseudomonas aeruginosa KGM-100 by diaion HP-20 column chromatography, ethyl acetate extraction, silica gel column chromatography, preparative TLC and recrystallization. KGM-100A which was recrystallized in MeOH showed antimicrobial activities against a broad spectrum of fungi and bacteria. Physico-chemical properties of KGM-100A were determined and identified to be phenazine-l-carboxylic acid by UV, IR, $^{1}$H-NMR, $^{13}$C-NMR, mass spectrum, and elemental analyses.
AF-011A is a novel lipopeptide with potent antifungal activity isolated from Pseudomonas cepacia AF6008 deposited as KFCC 10759. The compound was isolated from the fermentation broth by extraction with 50% isopropyl alcohol. Purification was effected by chromatography on Diaion HP-20, Alumina and C18 followed by HPTLC on silica gel. These techniques affored two closelt related compounds. AF-011A1 ans AF-011A2. The molecular weights of AF-011A1/A2 were determined by fast atom bombardment mass spectrometry(A1 m/z 1,215 : A2 m/z 1,199).
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[게시일 2004년 10월 1일]
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