배추의 절임조건에 따른 수분함량, 염도 및 pH 변화를 측정하였다. 절임에 사용한 소금의 농도가 높고 절임 시간이 증가할수록 배추의 수분 함량은 감소하는 것으로 나타났다. 이는 삼투압에 의하여 조직액의 용출 및 소금의 침투로 나타나는 현상으로 절임배추 특유의 조직 감과 관련이 있는 것으로 판단된다. 염분 농도가 비교적적은 6%에서는 삼투압의 변화가 비교적 적게 일어나 비교적 일정한 염분 농도를 유지하는 반면에, 소금의 농도를 증가시키면 절임과정 중에 배추의 삼투압에 변화가 일어나 배추에서 유출된 수분으로 초기에 사용한 소금의 염도보다 감소하였다. 절임 전 신선한 배추의 pH는 약 알칼리(pH 7.8~8.2)에서 절임시간이 경과할수록 점차로 낮아지는 것으로 나타났다. 이는 절임 과정 중에 배추에 존재하는 유기산이 용출 및 초기 발효에 의해 pH가 감소했을 것으로 판단된다. 절임시간이 경과할수록, 절임에 사용한 소금의 농도가 증가할수록 myrosinase 활성이 점차로 감소하였다. 배추의 절임시간이 길어지고 사용한 소금의 농도가 증가할수록 pH가 감소하는 것은 myrosinase 의 최적 활성을 나타내는 pH 범위를 벗어나게 되어 효소활성이 급격히 감소하는 것으로 판단된다. 절임에 사용한 소금의 농도와 절임시간이 증가함에 따라 total glucosinolates의 함량도 더 많이 감소함을 확인하였다. 이는 배추와 소금물이 접촉하면서 배추의 세포막이 파괴되고 세포 내에 있는 myrosinase의 작용에 의해 glucosinolates가 가수분해 되어 다양한 분해산물을 형성하는 것으로 판단된다. 이러한 변화는 절임공정에서 물리적 절단, 삼투압 현상으로 인한 조직의 손상, pH 변화 등에 의하여 glucosinolates가 가수분해 과정을 거쳐 분해산물을 생산하는 것으로 판단된다.
한천분해세균 SC-22균을 대전 대청댐부근의 담수에서 분리하였다. 생화학적 분석 및 16S rRNA 염기서열 분석을 통한 계통학적 분류를 통해 SC-22는 Cellvibrio mixtus로 동정되었다. 분리균의 생육 및 agarase 효소 생성능을 검토한 결과, SC-22는 탄소원으로 0.2% agar를 첨가한 배지에서 배양 36시간에 최대 생육을, 배양 48시간에 58.5 units/mL의 최대 효소활성을 나타내었다. 분리균은 세포외 및 세포내 agarase를 생성하였으며, zymogram 실험에 의해 P1, P2 및 P3의 isoenzyme을 분비하는 것으로 확인 되었다. 배양여액으로부터 겔여과법과 이온교환수지법을 단계적으로 이용하여 SC-22 균주로부터 SDS-PAGE에 의해 25 kDa의 효소를 정제하였으며, 정제효소는 zymogram에서 확인된 주 단백질인 P2(29 kDa)과 동일한 단백질임이 확인되었다. 또한 정제한 agarase의 효소학적 성질을 검토한 결과, 효소의 최적 pH와 최적온도는 pH 7.0과 $50^{\circ}C$이었으며, 금속이온 효과의 경우 1 mM 농도의 수준에서도 $Fe^{2+}$, $Na^+$, $Ca^{2+}$ 이온 등은 정제효소의 활성을 10-20% 증가시킨 반면 $Hg^{2+}$, $Mn^{2+}$ 및 $Cu^{2+}$ 이온들은 효소 활성을 크게 저해하였다. 또한 TLC 분석을 통해 정제효소는 한천 분해 올리고당으로 주로 단당류와 이당류를 생성하므로 $\beta$-agarase의 작용특성을 보였다. 기질특이성 실험에서는 정제효소는 agar와 agarose만을 이용 하였고 유사 해조 다당류인 alginate는 물론 다른 다당류를 분해하지 못하였다.
라세미코발트(III)착물인 $[Co(en)_3]^{3+},\;[Co(tn)_3]^{3+},\;cis-[Co(NH_3)(en)_2]^{3+},\;[Co({\beta}-ala)(en)_2]^{2+},\;[Co(gly)(en)_2]^{2+}$ 및 [Co(acac)(en)$_2]^{2+}$을 실온에서 d-주석산염의 수용액에 녹여 원편광이색성 spectra를 측정하였다. 측정된 모든 착물에 대해서 가시부영역 (400∼500nm)에 한개의 음의 CD spectrum이 관측되었다. 이것은 d-주석산이온과 ${\Lambda}$-및 ${\Delta}$-거울상이성질체의 상호작용에 대한 차에의한 것이라고 해석되었다. 즉 ${\Lambda}$-및 ${\Delta}$-거울상이성질체에 d-주석산이온을 각각 부가했을때 ${\Lambda}$-거울상이성질체는 크게 변하였고 ${\Delta}$-거울상이성질체는 약하게 변하여 그 결과 유발원편광이색성 spectrum으로 나타났다. 이온교환 관크로마토그래피에 있어서 용리제와 더 강하게 회합하는 거울상이성질체가 관으로부터 더 빨리 용출된다. 만일 chiral음이온과 착물과의 더 강한 상호작용이 착물의 원래 부호로부터 크로마토그래피의 용리순서를 예측할 수가 있고, 실험결과 용리순서는 측정된 모든 착물에 대하여 유발 원편광이색성 spectrum의 부포로부터 예측된 거울상이성질체의 절대구조와 완전히 일치하였다.
1. CWPC중의 새로운 생리활성물질의 검색 Mouse 임파세포의 증식효과를 지표로 하는 면역기능을 검토하여 CWPC중의 면역 부활작용을 갖는 새로운 성분의 검색을 실시하였다. CWPC를 여러 가지 분획법으로 분획하여 mouse 임파세포의 증식효과를 지표로 면역 활성성분을 검색하였다. 그 결과 gel filtration, 음이온교환법을 사용하여 분획한 당을 다량 포함한 부분에 강한 면역 부활담당세포에 대하여 증식활성을 나타내는 물질을 발견하였다. 이 물질은 SDS-PAGE상에서 분자량이 약 16kDa에 위치하여 Ca, p및 당쇄를 포함한 물질이며, 이것을 GPP로 하였다. GPP에는 우유케이신의 trypsin분해물이며 Ca와 무기인을 풍부하게 포함하는 ${\beta}$-CPP와 유사한 phosphoserin 영역을 갖는 성분과 갖지 않는 성분의 2종류가 존재하며, 각각의 면역 부활활성이 인정되었다. 각 성분의 아미노산 분석, 당 분석의 결과에서 지금까지 보고된 우유중의 면역담당세포에 대한 증식활성을 갖는 물질과는 상이한 성분인 것으로 밝혀졌다. 더우기 이 활성물질(GPP)은 PP cell에서도 동등한 활성이 있는 것으로 판단되었다. 이러한 결과를 종합하여 보면 CWPC중에는 지금까지 알려지지 않았던 새로운 면역 부활물질이 존재하며, 그 성분에는 CPP와 유사한 phophoserine영역이 존재하는 성분이 포함되어 있고, N-글리코실 결합의 당쇄가 존재하는 것으로 시사되었다. 이 성분은 전신면역의 지표인 비장세포에 대해서만이 아니고, 장관면역계에 중요한 역할을 담당하는 PP Cell에서도 활성이 있는 것으로 보아 전신 및 국부적인 면역기능의 부활성분으로서 응용의 가능성이 시사되었다.
본(本) 연구(硏究)는 한국인(韓國人) 산모(産母)로 부터 수집한 초유(初乳) 및 Holstein종(種)으로 부터 수집한 초유(初乳) 중에 존재하는 Secretory immunoglobulin A의 분리방법(分離方法)을 검토하고 분리(分離)된 분획들의 면역화학적(免疫化學的) 특성을 비교 검토하여 향후 인공영양(人工營養)에 대한 시험(試驗) 자료를 얻고자 하였으며 그 결과(結果)는 다음과 같다. 1. 인유(人乳) 초유(初乳) 중의 SIgA는 Sephadex G-200과 Sepharose 6B를 통한 gel-filtration 만으로도 순수한 상태로 분리(分離) 정제할 수 있었으나, 우유(牛乳) 초유(初乳) 중의 SIgA는 gel-filtration을 반복하는 방법(方法)으로는 순수한 상태로 분리(分離) 및 정제할 수 없었으며, gel-filtration으로 얻어진 SIgA rich fraction을 모아서 DEAE를 실시한 결과(結果) 또한 마찬가지로 SIgA를 순수한 상태로 분리(分離)할 수는 없었다. 2. 인유(人乳) 초유(初乳)로 부터 gel-filtration을 통하여 분리(分離)한 분획들을 Immunoelectrophoresis 및 Double immunodiffusion 방법(方法)으로 면역화학적(免疫化學的) 특성을 살펴본 결과(結果), 첫번째 peak의 분획에서 IgM이 존재하고 있음을 확인할수 있었으며 두번째 peak의 분획에서 SIgA가 순수한 상태로 존재하고 있음을 확인할수 있었다. 반면에 우유(牛乳) 초유(初乳)로 부터 gel filtration 및 DEAE를 통하여 분리(分離)한 분획들을 같은 방법(方法)으로 면역화학적(免疫化學的) 특성을 살펴본 결과(結果), SIgA rich fraction 중에는 IgG가 다량(多量)으로 혼재(混在)되어 있음을 확인할 수 있었다. 3. 우유(牛乳) 초유(初乳)에서 분리(分離)한 SIgA rich fraction의 Fragment를 SDS-PAGE로 분자량을 측정해 본 결과(結果), Secretory component가 77,000-80,000, Heavy chain이 50,000-60,000, Light chain이 25,000-27,000 dalton으로 나타났으며 J-chain은 Light chain과 중복되어 분자량 측정이 어려웠다. 이와같은 결과(結果)는 인유(人乳) 초유(初乳) 중에 존재하는 SIgA Fragment 분자량과 유사한 결과(結果)를 보여주었다.
식물에서 Ca2+는 세포의 중요한 2차 신호 전달 분자 중 하나이다. Ca2+ 및 인산화 효소의 센서 단백질인 칼슘-의존성 단백질 카이네즈(CDPKs)는 식물 세포에서 가장 풍부한 세린/트레오닌 키나아제이다. 이들은 다양한 자극에 대한 신호를 변환하여 식물에서 특정 반응을 일으킨다. 벼에는 31개의 CDPK 유전자 족이 확인되었다. 그들은 주로 식물의 생장과 발달에 관여하며 다양한 스트레스 조건에 반응하여 기능을 하는 것으로 알려져 있다. 그러나 CDPK 단백질의 생화학적 특성에 대해서는 알려진 바가 별로 없다. 이 연구에서는 벼의 CDPK 중 하나인 OsCPK11을 부분 정제하여 그 생화학적 특성을 조사하고자 하였다. 벼 유식물에서 3단계 칼럼 크로마토그래피 과정을 거쳐 부분 정제된 OsCPK11을 얻었다. 정제 과정에는 DEAE를 사용한 음이온 교환 크로마토그래피, Phenyl-Sepharose를 사용한 소수성 상호작용 크로마토그래피 및 Sephacryl-200HR를 사용한 겔 여과 크로마토그래피를 포함하였다. 부분 정제된 OsCPK11은 분자량이 54kDa이며 소수성 수지와 강한 소수성 상호작용을 보였다. 부분 정제된 OsCPK11으로 in vitro kinase assay를 실시한 결과, OsCPK11은 Ca2+-의존성 자가인산화 활성을 가짐을 보여 주었다. OsCPK11은 histone III-S를 인산화 하였으며, 카이네즈 활성의 최적 pH는 7.5-8.0이었다. Native OsCPK11은 이전에 연구된 재조합 OsCPK11과 몇 가지 생화학적 특징을 공유하였는데, 둘 다 Ca2+-의존성 자가인산화 활성을 나타냈다. 또한, 둘 모두 카이네즈 활성을 위한 기질로서 histone III-S를 선호하였으며, Ca2+ 의존성을 보여 주었다.
핵산 및 그 관련물질 연구의 일환으로서 미생물 효소에 의하여 핵산을 분해하여 5'-mononucleotides 생성을 목적으로 미생물에서 5'-phosphodiesterase 생성균주를 얻기위하여 전국 각지 76개 지역에서 논, 밭, 산, 하천의 토양 그리고 퇴비, 누룩, 메주 등 시료 210종을 수집하였다. 이 수집 시료로 부터 dilution pour plate method 로서 Aspergillus속 240주, Penicillium속 232주, Neurospora속, 19주, Monascus속 16주, 그리고 Streptomyces속 265주로 총 758주를 순수 분리하였다. 분리된 모든 균주에 대하여 RNA-depolymerase 균의 crude enzyme 중에는 5'-AMP deaminase가 공존하고 있으므로 효소반응 중에 RNA 가 5'-mononucleotide로 분해 축적하는 동안에 5'-AMP의 adenine의 6위치에 붙은 $NH_2$기를 탈아미노하여 hypoxanthine으로 하기 때문에 5'-IMP 로 되는 것이라 생각된다. 분리 동정 된 Penicillium citreo-viride PO 2-11 strain과 Streptomyces aureus SOA 4-21 strain 이 생성한 5'-phosphodiesterase 로서 RNA를 효소 분해하여 5'-mononucleotide 의 정량한 결과는 Table 10과 같다. productivities를 1차 screening 하고 5'-phosphodiesterase productivities로서 2차 screening 하여 우수균주를 얻고 동정하였다. 우수균주의 5'-phosphodiesterase productivity에 대하여 배양상의 optimum condition을 검토하고 5'-phosphodiesterse activity에 미치는 여러 화합물의 영향과 효소반응의 최적 조건을 구명하였다. 우수균주가 생성한 5'-phosphodiesterase에 의하여 RNA 분해로 반응 최종 산물을 ion exchange column chromatography법으로 정량하고 최종 분해 산물엔 5'-mononucleotide를 paper chromatography, thinlayer chromatography, UV-absorption spectra, carbazole reaction 및 Schiff's reaction 등으로 동정한 결과는 다음과 같다. [1] 5'-phosphodiesterase productivity가 가장 우수한 두 균주를 선정하였고 이들은 토양에서 분리 되었으며 선정된 푸른 곰팡이는 Penicillium citreoviride PO 2-11로 동정되었고 방사선균은 Streptomyces aureus SOA 4-21로 동정되었다. [2] 분리 선정 된 Penicillium citreo-viride PO 2-11 strain은 배양상의 optimum condition 이 pH 5.0이고 temperature는 $30^{\circ}C$이었고 이 균이 생성한 5'-phosphodiesterase의 효소 반응상의 optimum condition 이 pH 4.2이고 temperature는 $60^{\circ}C$이었다. 그리고 5'-phosphodiesterase 생성에서 최적 탄소원은 sucrose이고 질소원은 $NH_4NO_3$이고 corn steep liquor나 혹은 yeast extract를 각각 0.01%씩 첨가한 구는 첨가하지 않은 control 구보다 20%의 5'-phosphodiesterase 생성 증가를 나타 내었다. 이 균이 생성한 5'-phosphodiestrase는 $Mg^{++},\;Ca^{++},\;Zn^{++},\;Mn^{++}$ 등 금속이온은 activator이고 EDTA, citrate, $Cu^{++},\;Co^{++}$ 등은 inhibitor 임을 알았다. 이 균이 생성한 5'-phosphodiesterase는 RNA를 분해하여 분해율 65.81%이었고 5'-AMP, 5'-GMP, 5'-UMP 및 5'-CMP를 생성하며 이때 축적되는 5'-mononucleotides중 5'-GMP 만이 정미성이 있음을 알았고 이균은 5'-AMP deamaminase가 없음을 확인하였다. 이 균의 효소에 의하여 RNA에서 정미성 5'-GMP 186.7 mg/RNA(g)를 생산할수 있음을 알았다. [3] 분리 선정된 Streptomyces aureus SOA 4-21 strain은 배양상의 optimum condition이 pH 7.0이고 temperature는 $28^{\circ}C$이었고 이 균이 생성한 5'-phosphodiesterase의 효소반응상의 optimum condition이 pH 7.3이고 temperature는 $50^{\circ}C$이었다. 그리고 5'-phosphodiesterase 생성에서 최적탄소원은 glucose이고 질소원은 asparagine이고 yeast extract 0.01%첨가구가 control 구보다 40%의 5'-phosphodiesterase 생성증가를 나타내었다. 이 균이 생성한 5'-phosphodiesterase는 $Ca^{++},\;Zn^{++},\;Mn^{++}$ 등 금속이온은 activator 이고 citrate, EDTA, $Cu^{++}$ 등은 inhibitor 임을 알았다. 또한 이 균은 5'-phosphodiesterase 뿐만 아니라 5'-AMP deaminase도 생성함을 확인하였다. 그러므로 RNA 분해율은 63.58% 이었고 RNA를 분해하여 5'-AMP, 5'-CMP, 5'-GMP 및 5'-UMP로 축적시키고 RNA가 효소 분해됨과 동시에 5'-AMP deaminase도 작용하며 생성된 5'-AMP 의 60% 상당을 5'-IMP로 전환시키는 특성이 있어서 정미성 5'-mononucleotide 생성이 전자의 균보다 두드러지게 증가함을 밝혔다. 이 균에 의하여 RNA에서 정미성 5'-IMP 171.8 mg/RNA(g) 및 5'-GMP 148.2 mg/RNA(g)생산할 수 있어 정미성 5'-mononucleotide 320mg/RNA(g)를 생산할 수 있음을 알았다.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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