리스테리아 증세로 의심되는 환자의 혈액으로부터 분리한 균은 저온에서의 운동성 시험, 용혈능 검정시험, 당 이용성, CAMP 시험의 결과 전형적인 L. monocytogenes의 특성을 보여 L. monocytogenes YM-7로 동정하고 명명하였다. L. monocytogenes YM-7의 세균학적 특성과 이 균이 생산하는 용혈독소의 이화학적 특성은 다음과 같다. L. monocytogenes YM-7 균주는 Gram양성 간균으로, 운동성 측정 결과 반고체 배지에서 우산 모양의 층이 생겼고, 최적증식조건은 $37^{\circ}C$, 식염 농도 $0^{\circ}C$, pH 8.0이었고, 이 균의 생육 가능범위는 $8-40^{\circ}C$, 식염 농도 $0.7\%$, pH 5.0-10.0였다. L. monocytogenes YM-7 균주가 생산하는 용혈독소는균 생육곡선의 정지기 부근에서 최대 활성을 나타내었다. 이 용혈독소는 비교적 열에 불안정하였으나, $37^{\circ}C$에서 180분 후에도 용혈활성이 남아 있었다. 그리고 용혈독소는 pH 6.0-8.0에서 안정하였으나 그 외의 pH 영역에서는 매우 불안정 하였다
전통된장으로부터 분리한 Bacillus subtilis DJI은 다른 Bacillus 속에 비해 균체 생육이 빠르게 진행되어 9시간 만에 생육이 최대값에 이른다. 그 이후 사멸기에 접어들면서 자기소화에 의해 급격한 세포파쇄가 이루어져 포자가 세포외로 방출됨과 동시에 다량의 단백분해효소가 세포 밖으로 방출된다. 이러한 B. subtilis DJI 특유의 생육특징을 이용하여 세균형 코지와 된장을 제조(DJI 된장)하였으며, 제조된장의 숙성 60일 이후 일반성분을 분석한 결과 아미노태 질소 507 mg%, 조단백 14.3%, 조지방 4.8%로 식품공전상의 된장규격에 만족하였다. 또한 단백질 구성아미노산과 유리아미노산의 함량을 분석한 결과 유리아미노산의 총 함량이 숙성 30일에는 299.255 mg%에서 60일 이후에는 547.784 mg%로 증가함을 확인할 수 있었다. DJI 된장과 6종의 가정식 된장의 혈전용해능을 비교한 결과 DJI 된장은 909.7 units/ml, 재래된장은 $363.3{\sim}618.6\;units/ml$로 나타내었다. DJI 된장은 관능적으로도 쿰쿰한 냄새가 거의 없고 구수한 된장향이 났으며, GC/MS를 통한 DJI 된장의 향기성분을 분석한 결과에서도 재래된장 특유의 쿰쿰한 냄새의 원인물질 (3-methyl-1-butanol, 1-octen-3-ol, butanoic acid)은 적은양 검출된 반면 재래된장 고유의 맛과 향의 원인물질 (benzaldehyde, 2-furancarboxaldehyde, hexadecanoic acid)은 일정량 이상 검출되었다. 현재 식품공전상 된장은 대두나 곡물에 종국을 섞어 제국하여 발효 숙성시키거나, 메주를 식염수에 담가 발효하여 여액분리 후 이를 가공한 것으로 정의하고 있다. 즉 현재까지 된장은 주로 곰팡이의 단백분해효소에 의한 발효, 숙성물이었으나 본 연구에서는 B. subtilis DJI의 특이한 생육특성에 의하여 이를 사용한 새로운 개념의 세균형 코지제조와 이를 활용하여 재래된장 고유의 구수한 풍미를 지닌 맛있는 된장제조가 2개월 안에 제조 가능함을 나타내었다.
본 연구는 마비성 독소 표준물질의 안정적인 공급을 위해 친환경적이고 경제성이 우수한 발광다이오드 광원의 파장을 이용하여, PST의 원인종 Alexandrium catenella와 A. pacificum의 독 함량을 증대시킬 수 있는 가능성을 살펴보았다. 파장별 광량과 생장속도의 관계를 보면, 반포화상수(Ks)는 두 종 모두 적색파장에서 가장 높게 나타났고, 청색파장에서 가장 낮았다. 빛 파장에 따른 독함량의 경우, 적색 파장이 A. catenalla은 최고 약 8배 그리고 A. pacificum은 약 3.4배 다른 파장보다 높았다. 그리고 광량에 대한 친화성을 나타내는 Ks와 독농도와 밀접한 관련이 있는 것으로 나타났다. 따라서 세포당 독농도 증가를 위한 배양법은 초기에 세포수량의 확보 및 빠른 생장속도를 유도하기 위해서 청색파장을, 대수생장기 후기에는 적색파장을 주사하여, 세포내 독함유량을 증가시킬 수 있는 2단계 배양법을 제시할 수 있을 것으로 생각된다.
경상남도 남해군 연안의 해수를 이용하여 신규의 한천분해 해양성세균을 분리하고 한천분해효소의 특징을 분석하였다. Marine agar 2216 배지에서 분리한 SH-1 균주는 16S rRNA 유전자 염기서열분석을 통해 Simiduia 속 세균과 99% 유사하여 Simiduia sp. SH-1으로 명명하였다. Simiduia sp. SH-1 균주가 생성하는 한천분해효소는 성장의존성 산물로 판단되었으며 정체기부터 효소활성이 감소되었다. 한천분해효소는 pH 7.0(20 mM Tris-HCl buffer), 30℃에서 최대활성(698.6 units/l)을 나타내었다. 효소의 활성은 30℃에서 최적이었고 이후 온도가 증가함에 따라 활성이 감소하였으며, 40℃와 50℃에서 각각 약 90%와 75%의 상대활성을 보였으나 내열성은 보이지 않았다. 최적 pH인 pH 7.0에 비해 pH 6.0에서는 오차범위 내에서 조금 낮은 활성을 보였으며 pH 5.0과 pH 8.0에서는 각각 80%와 75% 정도의 상대활성을 보였다. TLC 분석을 통하여 Simiduia sp. SH-1 균주가 생성하는 한천분해효소는 agarose를 분해하여 피부의 미백활성, 전분노화의 방지 및 세균성장의 억제 등의 유용한 효과를 가지는 기능성 한천올리고당인 neoagarotetraose와 neoagarobiose를 최종적으로 생성하는 β-agarase로 확인되었다. 따라서, Simiduia sp. SH-1 균주와 이 균주가 생산하는 β-agarase는 산업적 생산에 유용하게 활용될 수 있을 것으로 기대된다.
저온 발효된 김치에서 분리된 저온성 젖산균 5균주를 김치제조시에 스타터로 각각 단독 접종하고 $8^{\circ}C$의 저온에서 발효시키면서 본 균주들이 김치발효에 미치는 영향을 조사하였다. 스타터 비접종 김치는 담금 즉시에는 그램 음성균수가 $4.0{\times}10^6CFU/ml$이었고, 대장균군수가 $3.2{\times}10^4CFU/ml$이었으나, 젖산균수는 $1.6{\times}10^3CFU/ml$에 불과하였다. 스타터를 접종한 김치들에서는 발효초기부터 대장균군수 및 그램 음성균수가 급격히 감소하였으나, 스타터 비접종 김치에서는 발효 초기에 이들이 증가하다가 10일 이후에 급격히 감소하였다. 젖산균수가 정상치에 도달하는 데 스타터 비접종 김치는 10일이, Leuconostoc속의 김치들은 $4{\sim}6$일이, Lactobacillus속의 김치들은 2일이 각각 소요되었다. 적숙상태의 총산함량에 도달하는데 스타터 비접종 김치는 10일이, 스타터 접종 김치들은 모두 4일이 소요되었다. 그러나 본 젖산균들의 접종이 김치의 산패를 야기시키지는 않았다. Leu. dextranicum 김치는 6일이후에 조직이 현저하게 연화되었으나 나머지 김치들은 그렇지 않았다. Leu. dextranicum 김치를 제외하면 김치의 품질은 Leuconostoc속 김치들은 모두 스타터 비접종 김치와 비슷하였으나, Lactobacillus속의 김치들은 스타터 비접종 김치보다 나빴다.
본 실험은 포도와 미국자리공의 세포현탁배양계에서 세포생장과 athocyaninn 및 betacyanin 색소생성에 미치는 광의 영향을 조사하였다. 그 결과, 포도의 세포현탁배양계에서의 세포증식 패턴은 광의 효과가 미약하였으나, 미국자리공의 경우는 암배양에 비하여 광조사구에서 뚜렷한 세포증식 패턴을 나타내었다. 포도세포는 12일간의 배양기간중 한번의 생장 피크를 보여주는데 비하여 미국자리공의 배양세포는 두 번의 증식 피크를 보여 광이 세포의 생장 및 분열 주기를 촉진시킬 뿐만 아니라 색소의 축적도 촉진시키는 것으로 나타났으며, 미국자리공 배양세포는 배양 후 4일째에 액포화에 따른 색소의 축적이 확인되었다. 한편, 색소생성에 미치는 광의 영향은 포도 현탁배양계에서는 배양후 6일째부터 생성되기 시작하여 배양 후 10일 전후에 최고치를 보이는데 비하여, 미국자리공의 현탁배양계에서는 세포증식 패턴에 따라 배양 후 4일째와 8일째에 두 번의 피크를 보였다. 그러나 이들 두 가지 모두 암배양하에서는 거의 색소 생합성이 이루어지지 않고 광상태하에서만 색소의 축적을 볼 수 있었다. 한편, 포도 세포배양계에서는 배양 후 4일째에 처리한 광은 약간의 효과가 있었으나, 배양 후 7일째 12시간 이상의 광에 의하여 색소생성이 크게 촉진되는 것을 알 수 있었다. 미국자리공의 경우에는 배양 후 7일 째보다는 오히려 배양 후 4일째에 광이 더욱 효과적이었다. 이상의 사실은 이들 두 가지 색소의 생합성과정에는 광이 절대적으로 필수적이지만 광을 필요로 하는 시기 및 요구하는 광량 등이 서로 다르다는 것을 시사해 준다.
지방분해효소 활성이 가장 높은 균은 가을철에 집유한 B 지역의 원유로부터 분리한 Acinetobacter genomospecies 10(match %: 99.90)이었으며, 단백질분해효소 활성이 가장 높은 균은 봄철에 B 지역의 원유로부터 분리한 Serratia liquefaciens(match %: 99.39)였다. Acinetobacter genomospecies 10(match %:99.90)는 전형적인 생장곡선의 형태인 시그모이드 곡선의 형태를 나타냈으며, 배양시간별 조효소 활성은 배양시간이 증가할수록 지방분해효소 활성이 증가하다가 정지기 후반부에서부터 사멸기에 도달하기까지는 배양시간이 길수록 활성이 감소하였다. pH에 따른 지방분해효소 활성은 pH 8.5에서 가장 높았고 온도는 $45^{\circ}C$에서 가장 높은 활성을 나타내었다. Serratia liquefaciens(match %: 99.39)의 생장곡선은 전형적인 시그모이드 형태를 나타내었고, 단백질분해효소 활성은 배양 12시간 후에 가장 높았고, 18시간 후에는 다시 감소하는 양상을 나타냈다. 단백질 분해효소의 pH 영향은 2.5에서 활성이 가장 낮았고 pH 8.5에서 가장 높은 활성을 나타내었다. 또한 반응온도에 의한 효소활성은 $35^{\circ}C$에서 가장 높았다.
송이균의 환경조건에 따른 생장특성을 구명하고자 송이균을 고체매질을 이용하여 배양하였다. 고체매질에서의 송이균의 생장량은 에르고스테롤 함량을 분석하여 비교하였다. 송이균의 배양에 적합한 고체매질은 펄라이트와 마사토로 나타났으며 곡물 영양분으로는 보리가 우수하였다. 적정화된 고체배지에서 송이균의 생장은 송이균의 접종 후 2주부터 급격히 생장하였으며 8주 경에 최고의 생장량을 나타냈다. 송이균 배양에 적합한 수분함량은 30~70%였으며 부엽토 첨가(10%)가 생장에 더욱 양호하였다. 이러한 결과는 송이산지에서 토양유기물이 적절히 있고 토양수분이 높을 때에 송이균의 생장이 왕성할 것으로 추정할 수 있다. 고체배지에서 송이균사체를 접종 후 2주부터 급격히 생장하였으며 8주 경에 최고의 생장량을 나타냈다. 이러한 고체매질은 앞으로 송이 균사체의 생리연구에 이용될 수 있을 것이다.
식품으로서 안전하게 섭취하여 혈전증을 사전에 예방하거나 개선할 수 있도록 하기 위하여, 전통적 방법으로 제조한 청국장으로부터 미생물을 분리하여 혈전분해 효소활성이 우수한 미생물을 선발 동정한 결과, Bacillus amyloliquefaciens HC188이라 명명하였다. 선발미생물이 생산하는 혈전분해효소를 분리 및 정제한 결과, 50.7배의 정제도와 5.5%의 수율을 나타내었고, 혈전분해 효소단백질의 분자량은 22.3 kDa이었으며, N-terminal 아미노산 서열은 Ala-Gln-Ser-Val-Pro-Tyr-Gly-Val-Ser-Gln-Ile-Lys-Ala-Pro-Ala로 분석되었다. 효소의 최적반응 pH와 온도는 pH 8.0과 $40^{\circ}C$로 나타났으며, pH 6.0-8.0과 $20-40^{\circ}C$ 사이에서 효소가 비교적 안정하였다. 금속이온에 대한 영향은 2 mM과 5 mM 농도의 $CoCl_2$와 $CaCl_2$의 금속이온이 존재할 때 효소활성이 증가하였으며, inhibitor로서 EDTA와 PMSF에 의해 효소활성이 저해되므로 청국장에서 분리한 B. amyloliquefaciens HC188가 생성한 혈전분해 효소는 metallo-serine protease로 사료되었다.
락토페린은 철 결합 당단백질로서 항 미생물활성과 면역강화와 같은 생리활성 기능을 가지고 있다. 본 연구는 배양 세포 고 발현 SWPA2 promoter를 이용하여 인체락토페린(hLf)을 생산하는 형질전환 가시오갈피 배양세포주 개발에 관한 것이다. 형질전환에 이용된 벡터는 산화스트레스 유도성 SWPA2 promoter의 조절 하에서 hLf이 소포체로 targeting되도록 제작된 SWPA2pro::ER-hLf/pCAMBIA이다. hLf을 생산하는 각 형질전환 배양세포들은 PCR과 Southern분석을 통해 hLf 유전자가 가시오갈피 게놈내로 성공적으로 도입되었음을 확인하였으며, western blot과 ELISA를 통해 형질전환 가시오갈피 배양 세포주에서 hLf 단백질이 활성이 있음을 확인하였다. 형질전환 가시오갈피 배양세포에서 hLf 단백질의 함량은 세포배양이 진행될수록 증가하여 정지기 때 가장 높았으며 전체 수용성 단백질의 약 3%를 차지하였다. 따라서 본 연구에서 개발된 인체락토페린을 고생산하는 약용식물 가시오갈피 배양 세포주는 산업적으로 이용될 수 있을 것으로 기대된다.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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