• Molecules and Cells
• /
• 제24권2호
• /
• pp.276-282
• /
• 2007

Protein phosphorylation is one of the major mechanisms by which eukaryotic cells transduce extracellular signals into intracellular responses. Calcium/calmodulin ($Ca^{2+}/CaM$)-dependent protein phosphorylation has been implicated in various cellular processes, yet little is known about $Ca^{2+}/CaM$-dependent protein kinases (CaMKs) in plants. From an Arabidopsis expression library screen using a horseradish peroxidase-conjugated soybean calmodulin isoform (SCaM-1) as a probe, we isolated a full-length cDNA clone that encodes AtCK (Arabidopsis thaliana calcium/calmodulin-dependent protein kinase). The predicted structure of AtCK contains a serine/threonine protein kinase catalytic domain followed by a putative calmodulin-binding domain and a putative $Ca^{2+}$-binding domain. Recombinant AtCK was expressed in E. coli and bound to calmodulin in a $Ca^{2+}$-dependent manner. The ability of CaM to bind to AtCK was confirmed by gel mobility shift and competition assays. AtCK exhibited its highest levels of autophosphorylation in the presence of 3 mM $Mn^{2+}$. The phosphorylation of myelin basic protein (MBP) by AtCK was enhanced when AtCK was under the control of calcium-bound CaM, as previously observed for other $Ca^{2+}/CaM$-dependent protein kinases. In contrast to maize and tobacco CCaMKs (calcium and $Ca^{2+}/CaM$-dependent protein kinase), increasing the concentration of calmodulin to more than $3{\mu}M$ suppressed the phosphorylation activity of AtCK. Taken together our results indicate that AtCK is a novel Arabidopsis $Ca^{2+}/CaM$-dependent protein kinase which is presumably involved in CaM-mediated signaling.

• Journal of Microbiology and Biotechnology
• /
• 제26권11호
• /
• pp.1881-1890
• /
• 2016

Manganese superoxide dismutase (MnSOD) is a vital enzyme that protects cells from free radicals through eliminating superoxide radicals ($O^{2-}$). Hirudin, a kind of small active peptide molecule, is one of the strongest anticoagulants that can effectively cure thrombus diseases. In this study, we fused Hirudin to the C terminus of human MnSOD with the GGGGS linker to generate a novel dual-feature fusion protein, denoted as hMnSOD-Hirudin. The hMnSOD-Hirudin gene fragment was cloned into the pET15b (SmaI, CIAP) vector, forming a recombinant pET15b-hMnSOD-Hirudin plasmid, and then was transferred into Escherichia coli strain Rosetta-gami for expression. SDS-PAGE was used to detect the fusion protein, which was expected to be about 30 kDa upon IPTG induction. Furthermore, the hMnSOD-Hirudin protein was heavily detected as a soluble form in the supernatant. The purification rate observed after Ni NTA affinity chromatography was above 95%. The hMnSOD-Hirudin protein yield reached 67.25 mg per liter of bacterial culture. The identity of the purified protein was confirmed by western blotting. The hMnSOD-Hirudin protein activity assay evinced that the antioxidation activity of the hMnSOD-Hirudin protein obtained was $2,444.0{\pm}96.0U/mg$, and the anticoagulant activity of the hMnSOD-Hirudin protein was $599.0{\pm}35.0ATU/mg$. In addition, in vitro bioactivity assay showed that the hMnSOD-Hirudin protein had no or little cytotoxicity in H9c2, HK-2, and H9 (human $CD_4{^+}$, T cell) cell lines. Transwell migration assay and invasion assay showed that the hMnSOD-Hirudin protein could suppress human lung cancer 95-D cell metastasis and invasion in vitro.

• 생명과학회지
• /
• 제16권4호
• /
• pp.676-682
• /
• 2006

친환경형 미생물제제의 난용성 인산염 가용화능의 향상을 위하여 Staphylococcus sp. LJ2로부터 분리된 ldh gene을 Klebsiella sp. DA71-1에 도입하였고, 이를 DA71-1/pLYJ라고 명명하였다. 배지에 glucose를 3% 첨가했을 때 다른 탄소원을 첨가했을 때보다 DA71-1/pLYJ 균주의 난용성 인산염 가용화능이 월등히 우수하였다. 각기 다른 난용성 인산염 tri-calcium phosphate, hydroxyapatite, 그리고 aluminium phosphate에 대하여 그 가용화능이 DA71-1 균주보다 적게는 1.2배, 많게는 2.3배 이상 향상된 결과를 보였다. 그리고 DA71-1/pLYJ 균주는 DA71-1 균주에 비해 배양 온도에 비교적 관계없이 높은 인산가용화능을 나타낸 것이 특징적이었고, 배양초기 pH가 5.0일 때 그 능력이 가장 뛰어났다. 이러한 모든 결과들을 종합해볼 때 DA71-1/pLYJ 균주는 여러면에서 DA71-1 균주보다 난용성 인산염 가용화능이 월등히 뛰어나며 따라서 효율적이고 친환경적인 미생물제제의 개발에 큰 역할을 할 수 있는 발판을 마련했다 할 수 있다.

• KSBB Journal
• /
• 제21권2호
• /
• pp.90-95
• /
• 2006

라이코펜 생산성을 향상시키기 위하여 몇 가지 대장균 균주들을 대상으로 생산성 시험을 한 결과 MG1655 균주가 가장 우수하였다. 대장균 MG1655 균주의 염색체 DNA 내에 존재하는 특정 유전자의 기능이 상실되었을 때 라이코펜 생산성이 증가되는 변이체를 선발하기 위해 transposon 돌연변이를 수행하였으며, 5종의 우수 transposon 변이체를 얻었다. 특히, Tn4 변이체는 야생형 MG1655에 비해서 라이코펜 생산량은 6배, 균체 내 함량은 7배로 가장 높았다. Transposon 삽입에 의해 결손된 유전자를 파악하기 위해 inverse PCR을 통해 염기서열을 확인하였으며, 결손된 유전자는 rfaH, treB, B2436으로 규명되었다. 또한 특정 유전자 기능의 상실뿐만 아니라 기능의 강화나 변화 등에 의한 라이코펜 생산성이 증가된 변이체를 선발하기 위해 NTG 돌연변이를 수행하였으며, 4개의 우수한 NTG 변이체를 얻었다. 이들 중에 NTG4 변이체가 가장 높은 라이코펜 생산량을 보였다. 특히, NTG4 변이체는 발현유도물질인 arabinose의 소량(0.013mM) 첨가 시에 라이코펜 농도, 6 mg/L와 균체 내 함량 4 mg/g DCW로 최대의 라이코펜 생산성을 보였고, 이것은 야생형 MG1655에 비해서 각각 18배와 12배 높은 생산성이다.

• Journal of Microbiology and Biotechnology
• /
• 제22권12호
• /
• pp.1636-1643
• /
• 2012

Enzymatic pre-bleaching by modification of pulp fibers with xylanases is an attractive approach to reduce the consumption of toxic bleaching chemicals in the paper industry. In this study, an alkaliphilic endoxylanase gene was isolated from metagenomic DNA of a structurally stable thermophilic lignocellulose-degrading microbial consortium using amplification with conserved glycosyl hydrolase family 10 primers and subsequent genome walking. The full-length xylanase showed 78% sequence identity to an endo-${\beta}$-1,4-xylanase of Clostridium phytofermentans and was expressed in a mature form with an N-terminal His6 tag fusion in Escherichia coli. The recombinant xylanase Xyn3F was thermotolerant and alkaliphilic, working optimally at $65-70^{\circ}C$ with an optimal pH at 9-10 and retaining >80% activity at pH 9, $60^{\circ}C$ for 1 h. Xyn3F showed a $V_{max}$ of 2,327 IU/mg and $K_m$ of 3.5 mg/ml on birchwood xylan. Pre-bleaching of industrial eucalyptus pulp with no prior pH adjustment (pH 9) using Xyn3F at 50 IU/g dried pulp led to 4.5-5.1% increase in final pulp brightness and 90.4-102.4% increase in whiteness after a single-step hypochlorite bleaching over the untreated pulp, which allowed at least 20% decrease in hypochlorite consumption to achieve the same final bleaching indices. The alkaliphilic xylanase is promising for application in an environmentally friendly bleaching step of kraft and soda pulps with no requirement for pH adjustment, leading to improved economic feasibility of the process.

• 한국가금학회지
• /
• 제32권4호
• /
• pp.225-229
• /
• 2005

현재 가장 활발하게 진행되고 있는 형질전환 자 생산 연구방법은 배반엽단계 수정란에 농축한 virus를 주입하여 모자이크 형태의 $G_0$ 형질 전환체를 생산하고 이들을 이용하여 $G_1$ 형질전환 후대를 생산하는 방법이 가장 보편적으로 이용되고 있다. 상기의 연구방법은 완전한 형질 전환체를 획득하기 위해서는 수천수의 $G_1$을 생산하고 각각 유전분석을 수행하는 문제점을 가지고 있다. 이러한 문제점을 개선하고자 다음의 연구를 계획하고 수행하였다. 20nL의 농축된 GFP retrovirus를 1세포기 수정란에 주입하고, 주입한 유전자의 발현율과 수정란의 생존율을 배양 4일차 수정란에서 GFP의 발현과 배자의 생존 여부로 판정하였다. 연구결과는 배양 4일차 수정란의 생존율은 기존의 naked DNA 미세주입방법에 비해 다소 낮은 것으로 나타났으나 유의성은 없었다. 1세포기 수정란은 배반엽 단계 수정란과 달리 주입한virus의 유전자를 발현하지 않는 것으로 관찰되었다. 연구결과는 배반엽단계 수정란에 virus 미세주입 방법이 형질전환 닭 생산에 가장 효율적인 방법임 보여주고 있다.

• 한국식물병리학회:학술대회논문집
• /
• 한국식물병리학회 1994년도 Proceedings of International Symposium on BIOLOGICAL CONTROL OF PLANT DISEASES Korean Society of Plant Pathology
• /
• pp.11-26
• /
• 1994

Crown gall of stonefruit and nut trees is one of the very few plant diseases subject to efficient biological control. The disease is caused by the soil-inhabiting bacteria Agrobacterium tumefaciens and Agrobacterium rhizogenes and the original control organism was a non-pathogenic isolate of A. rhizogenes strain K84. Control is achieved by dipping planting material in a cell suspension of strain K84 which specifically inhibits pathogenic strains containing a nopaline Ti plasmid. Because the agrocin 84-encoding plasmid (pAgK84) is conjugative, it can be transmitted from the control strain to pathogenic strains which, as a result, become immune to agrocin 84 and cannot be controlled. To prevent this happening, the transfer genes on pAgK84 were located and then largely eliminated by recombinant DNA technology. The resulting construct, strain K1026, is transfer deficient but controls crown gall just as effectively as does strain K84. Field data from Spain confirm that pAgK84 can transfer to pathogenic recipients from strain K84 but not from strain K1026. The latter has been registered in Australia as a pesticide and is the first genetically engineered organism in the world to be released fro commercial use. It is recommended as a replacement for strain K84 to prevent a breakdown in the effectiveness of biological control of crown gall. Several reports indicate that both strains K84 and K1026 sometimes control crown gall pathogens that are resistant to agrocin 84. A possible reason for this is that both strains produce a second antibiotic called 434 which inhibits growth of nearly all isolates of A. rhizogenes, both pathogens and non-pathogens. Crown gall of grapevine is caused by another species, Agrobacterium vitis. It is resistant to agrocin 84 and cannot be controlled by strains K84 or K1026. It is different from other crown gall pathogens in several characteristics, including the fact that, although a rhizosphere coloniser, its also lives systemically in the vascular tissue of grapevine. Pathogen free propagating material can be obtained from tissue culture or, less surely, by heat therapy of dormant cuttings. A number of laboratories are searching for a biocontrol strain that will prevent, or at least delay, reinfection. A non-pathogenic A. vitis strain F/25 from South Africa looks very promising in this regard.

• Molecules and Cells
• /
• 제37권3호
• /
• pp.226-233
• /
• 2014

Excessive reactive oxygen species (ROS) generated from abnormal cellular process lead to various human diseases such as inflammation, ischemia, and Parkinson's disease (PD). Sensitive to apoptosis gene (SAG), a RING-FINGER protein, has anti-apoptotic activity and anti-oxidant activity. In this study, we investigate whether Tat-SAG, fused with a Tat domain, could protect SH-SY5Y neuroblastoma cells against 1-methyl-4-phenylpyridinium ($MPP^+$) and dopaminergic (DA) neurons in the substantia nigra (SN) against 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetra-hydropyridine (MPTP) toxicity. Western blot and immunohistochemical analysis showed that, unlike SAG, Tat-SAG transduced efficiently into SH-SY5Y cells and into the brain, respectively. Tat-SAG remarkably suppressed ROS generation, DNA damage, and the progression of apoptosis, caused by $MPP^+$ in SH-SY5Y cells. Also, immunohistochemical data using a tyrosine hydroxylase antibody and cresyl violet staining demonstrated that Tat-SAG obviously protected DA neurons in the SN against MPTP toxicity in a PD mouse model. Tat-SAG-treated mice showed significant enhanced motor activities, compared to SAG- or Tat-treated mice. Therefore, our results suggest that Tat-SAG has potential as a therapeutic agent against ROS-related diseases such as PD.

• 생명과학회지
• /
• 제12권1호
• /
• pp.96-105
• /
• 2002

식물 단백질의 영양가 향상을 위한 일환으로 필수아미노산의 조성이 풍부한 인공단백질을 암호화하는 인공유전자를 담배 식물체에서 발현을 시도하기 위하여, 식물에서 외래유전자의 발현에 널리 사용되는 Cauliflower mosaic virus (CaMV)의 35S promoter를 이중으로 중첩되도록 하고, (Lys-Glu-Trp)이 64번 반복되는 인공유전자 및 nopaline synthase (nos) terminator를 갖고있는 binary vector pART4-4를 구성하였다. 이 재조합 플라스미드는 Agrobacterium tumefaciens를 이용한 형질전환에 의해 Nicotiann tabacum (Var. Xanthi)으로 도입되었다. Kanamycin이 포함된 신초 유도 배지 및 뿌리 유도배지를 이용하여 정상적으로 재생된 담배 식물체로부터 도입된 인공유전자의 발현을 분석하였다. 추출한 genomic DNA를 EcoRI으로 자른 다음 Southern blot 분석에 의하면, 효소 절단 시 예상되는 1.1 kb에서 band를 형성하였으며 각각의 형질전환 식물체에 인공유전자가 1 또는 3 개씩 도입되어 있음을 확인하였다. Northern blot 분석에 의하면 약 1.2 kb 전사체가 비교적 안정하게 발현되었으며, 잎, 줄기, 뿌리로부터 RNA를 분리하여 promoter의 조직 특이성 발현을 분석한 결과, 잎에서 생성되는 RNA가 줄기나 뿌리 조직보다 안정하게 발현되었다. 형질전환 식물체에서 Western blot에 의한 단백질 분석 결과, 잎에서 추출한 단백질로부터 원하는 크기인 33 kDa의 인공단백질이 생성됨을 확인하였으며 발현 수준은 전체 세포 단백질의 0.1%로서 낮은 수준이었다.

• 한국육종학회지
• /
• 제49권3호
• /
• pp.180-189
• /
• 2017

현재까지 국내에서는 생명공학작물이 상업적인 재배가 되고 있지 않으나 생명공학작물의 환경 방출을 위해서는 환경위해성 평가가 필수적 수행되어야 한다. 본 연구에서는 해충저항성 Bt 벼(Agb0101)로부터 모품종인 낙동벼와 잡초성벼인 R55 및 인디카벼인 IR36 로의 화분 매개에 의한 유전자 이동성을 평가하였다. 낙동벼로부터 729,917 립의 종자를 얻었으며, 잡초성벼(R55)로부터는 230,635 립의 종자와 인디카벼(IR36)에서는 596,318 립의 종자를 수확하였다. 교잡개체는 3회의 제초제 살포를 수행하여 제초제 저항성 개체 선별과 Cry1Ac1 immunostrip 검정으로 확인하였으며, 해충저항성 Bt 벼(Agb0101)에 특이적인 프라이머를 이용한 분자생물학적 방법을 통해 유전자 이동성 여부를 최종적으로 검증하였다. 총 파종된 종자수에 대한 교잡율은 낙동벼에서는 0.0027%, R55는 0.0017%, IR36은 0.0005%로 나타났으며, 모든 교잡개체들은 해충저항성 Bt 벼(Agb0101)에 근접한 1.2m 내에서 발견되었다. 화분 매개에 의한 해충저항성 Bt 벼(Agb0101)의 유전자 이동 특성은 기존에 연구된 결과들과 유사한 경향으로 보였으며, 벼의 개화기간 중 온도와 강우량 등 기상 조건이 화분에 의한 교잡을 결정하는데 중요한 요인으로 작용하였다. 이에 재배 지역의 기상 환경과 개화시기 중복 여부 등을 유전자변형 벼에 의한 일반 재배품종 및 야생(잡초성)벼로의 유전자 이동에 따른 저감 기술 개발과 안전관리 기준 작성에서 주요 영향 인자들로 고려되어야 할 것이다.