• 미생물학회지
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• 제49권2호
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• pp.112-117
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• 2013

Wheat streak mosaic virus (WSMV)는 Potyviridae 과 Tritimovirus 속으로 분류되는 식물병원성 바이러스로 밀과 옥수수 종자 등에 많은 피해를 주고 있다. 본 연구에서는 관리급 식물검역 종자전염바이러스인 WSMV를 신속하고 정확하게 진단하기 위한 2단계 PCR 시스템을 개발하였으며, 실험실 오염의 여부를 확인 할 수 있는 새로운 양성 대조구를 제작하였다. 본 연구에서 개발된 PCR 시스템으로 일본에서 수입한 스위트콘 종자와 미국에서 수입한 밀 종자의 검역과정에서 WSMV-JSweet-corn2868, WSMVUwheat1944-1 및 WSMV-Uwheat1944-2를 검출하였다. 검출된 증폭 산물은 다른 WSMV의 isolates와 80.60-100.00%의 유사성을 보였다. WSMV는 계통수에서 4가지 genotype이 확인되며, 이번 연구에서 검출한 isolate WSMV-JSweet-corn2868 (JX845574)은 Clade B로 분류되었고, isolate WSMV-Uwheat1944-1 (KC754959)과 WSMV-Uwheat1944-2 (KC754960)는 Clade D로 분류되었다.

• 한국어병학회지
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• 제24권3호
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• pp.255-268
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• 2011

본 연구에서는 RT-nested PCR을 수행하여 부산 도심의 하천 중 동천에 존재하는 노로바이러스를 검출하고자 하였다. 기존에 보고되어진 노로바이러스의 capsid protein의 염기서열을 비교하여 노로바이러스 genogroup I,II (GI,II) 를 검출하기 위한 새로운 degenerated primer sets (PNK, KGIF/KGIR and KG2F/KG2R) 를 제작하였으며, 채수한 동천 시료를 초고속원심분리기를 통해 농축 후 물 속에 존재하는 노로바이러스의 검출을 시도하였다. 노로바이러스를 검출하기 위해 PCR primer를 비교한 결과 본 연구에서 제작한 capsid protein gene을 target으로 하는 primer set가 기존에 보고되어 있는 primer set보다 동일 시료에 대한 검출빈도가 우수하였다. 동천에 존재하는 노로바이러스의 오염 수준은 GI과 GII가 각각 76.47% (13/17), 70.59% (12/17) 로 나타났다. 그러나 기존에 알려진 primer와 본 연구에서 제작한 primer를 사용하였을 때 검출된 양성비율이 차이가 나지 않았다. 검출된 노로바이러스를 염기서열 비교를 통한 계통 발생학적 분석 결과, 동천에서 검출된 GI의 경우 1/2/4/5/9/10의 genotype이 GII의 경우 3/4/5/11/13의 genotype으로 분류되었다. 그리고 본 연구에서 검출된 major type 중 GII/4의 경우, 최근 아시아 각국에서 많은 문제를 일으키고 있는 major genotype으로 알려져 노로바이러스에 대한 위험성을 제고하게 하였다. 또한, 이러한 결과는 국내의 강, 호수, 하천 등이 비슷한 노로바이러스의 GI,II의 genotype으로 오염되어 있음을 암시하며 수계환경 중 미생물의 질을 개선하기 위한 지속적인 노로바이러스의 모니터링이 요구된다.

• 한국미생물·생명공학회지
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• 제32권3호
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• pp.256-264
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• 2004

본 연구는 벼의 세균병 중 치명적인 흰잎마름병을 유발하는 Xanthomonas oryzae pv. oryzae를 검출할 수 있는 프라이머를 개발하기 위해 실시하였다. X. o. pv. oryzae str. KACC10331의 hpaA유전자 염기서열로부터 흰잎마름병만을 특이적으로 검출할 수 있는 프라이머를 제작하여 중합효소연쇄반응에 사용하였다. 개발된 특이 프라이머는 X. o. pv. oryzae str. KACC10331과 X. campestris pv. vesicatoria, X. campestris pv. campestris, X. axonopodis pv. citri 그리고 X. axonopodis pv. glycines의 phaA유전자 염기서열의 상동성을 비교하여, 그 중 X. o. pv. oryzae만이 가지는 특이적인 부분을 바탕으로 각각 20-mer인 XOF와 XOR를 제작하였다. 제작된 프라이머를 이용하여 중합효소 연쇄반응을 실시한 결과 반응 후 생성된 단편의 크기는 534-bp였다. 반응 후 생성된 단편은 Southern hybridization을 통하여 Xanthomonas 균주들의 hpaA유전자 존재 여부 및 그 상동성을 비교분석하기 위해 사용하였다. 또한 제작된 프라이머를 이용하여 흰잎마름병에 감염된 벼 잎에서의 검출 여부를 확인하였고 X. o. pv. oryzae의 순수 균주 배양액을 중합효소연쇄반응에 이용하여 검출한계를 검정하였다. 본 연구에서 제작된 프라이머를 사용한 중합효소연쇄 반응 방법은 X. o. pv. oryzae의 검출 뿐만 아니라 흰잎마름병의 발생 예찰에 매우 유용할 것으로 판단 되었다.

• 한국식품위생안전성학회지
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• 제32권3호
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• pp.199-205
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• 2017

인수공통 감염증의 하나인 톡소포자충의 검출을 위해서는 대부분은 ELISA 법이 사용 되고 있으나, 충체가 사멸된 후에도 양성반응이 나타나는 등 사용에 제한이 있다. 반면 유전자 검출법은 현재 감염상태를 확인 할 수 있기 때문에 식중독 원인조사 등에 적합하다고 판단되어 이를 활용하여 본 연구를 진행하였다. 톡소포자충의 유전정보를 통해 529 repeat region의 염기서열을 얻고, 프라이머 및 TaqMan 프로브를 설계하여 real-time PCR을 이용한 검출법을 개발하였다. 검출한계(lower limit of detection) 및 적정곡선을 확인한 결과 10 genomic DNA copy가 검출한계로 확인되었고, 정량을 위한 곡선은 $10^1{\sim}10^6$ DNA copies까지 0.999의 $R^2$ 값을 나타내었다. 개발된 검출법의 증폭효율을 비교하기 위해 B1 gene 타겟 프라이머 세트와 타입별 검출한계를 비교한 결과, type 1, 2, 3 톡소포자충에서 같거나 더 나은 검출한계를 보였다. 또한 식품에서 주로 분리되는 식중독 세균 14종 및 원충 3종에 대해 특이도를 비교한 결과, 모두 음성으로 나타났다. 개발된 검출법을 식육검체에 적용하였을 때 type 1, 2, 3에서 모두 원활한 검출결과를 보여 증폭방해물질이 존재하지 않은 것으로 확인되었다. 본 연구를 통해 개발된 유전자검출법은 국내 유통 중인 식육에서 인수 공통감염 원충의 하나인 톡소포자충의 감염 여부를 확인하는 사전적 모니터링의 방법으로 활용될 예정이다.

• Asian Pacific Journal of Cancer Prevention
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• 제17권1호
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• pp.249-254
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• 2016

Molecular detection methods such as RT-PCR for detecting breast cancer-associated gene expression in the peripheral blood have the potential to modify breast cancer (BC) staging and therapy. In this regard, we evaluated the potential of erb-B2 molecular marker in BC detection and analyzed the expression of erb-B2 mRNA in the peripheral blood and fresh tissue samples of 50 pretreated female BC patients and 50 healthy females by reverse transcription-PCR (RT-PCR) method. We also assessed the correlation of erb-B2 mRNA marker positivity in peripheral blood and tumor tissue samples with clinical and pathological factors in BC patients in order to evaluate its prognostic value. It was shown that there is a significant difference between healthy females and BC patients with expression of the erb-B2 molecular marker (p<0.01). A significant difference between the expression of erb-B2 in the peripheral blood and tissue samples of BC patients (p<0.01) and the frequency of circulating erb-B2 mRNA expression in peripheral blood and in tissue was detected by RT-PCR. No correlation was found between erb-B2 mRNA expression in blood or tumor tissue samples and lymph node, tumor grade, tumor stage, tumor size, patient's age, ki67, estrogen receptor (ER), progesterone receptor (PGR), P53, and HER-2 status. However, in a small subset of 31 BC patients we found that expression of erb-B2 in peripheral blood or in both peripheral blood and tumor tissue was directly correlated with lympho-vascular invasion and perineural invasion as poor prognostic features. The highest rates of erb-B2 expression in peripheral blood or tumor tissue were in the ER and PR negative and HER-2 positive group. This study suggests that the application of the RT-PCR and immunohistochemical methods for erb-B2 molecular marker detection would provide a higher detection rate, especially in early stage BC.

• 한국수정란이식학회지
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• 제28권4호
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• pp.355-360
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• 2013

Precise, rapid and simple methods for species identification in animals are among the most important techniques in the livestock industry and research fields including meat classification. In this study, polymerase chain reaction (PCR) based molecular identification using inter species polymorphisms were examined by PCR-restriction fragment length polymorphism (RFLP) analysis for mitochondrial DNA (mtDNA) cytochrome b (CYTB) gene sequences among four mammalian livestock animals (cattle, horse, goat and pig). The results from PCR-RFLP analysis using the AluI restriction enzyme were also provided for the species-specific band patterns among CYTB gene sequences in these four species. The AluI-digestion for CYTB genes provided interesting migration patterns differentially displayed according to each species. Cattle and horse had one AluI-recognition site at different nucleotide positions and their AluI-digested fragments showed different band patterns on the gels. Pig had two AluI-recognition sites within the amplified CYTB sequences and produced three bands on the gels. Goat had no AluI-recognition site and was located at the same position as the uncut PCR product. The results showed the species-specific band patterns on a single gel among the four livestock animal species by AluI-RFLP. In addition, the results from blind tests for the meat samples collected from providers without any records showed the identical information on the species recorded by observing their phenotypes before slaughter. The application of this PCR-RFLP method can be useful and provide rapid, simple, and clear information regarding species identification for various tissue samples originating from tested livestock species.

• 생명과학회지
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• 제15권1호
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• pp.61-65
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• 2005

벼멸구(Nilapawata lugens Stal.)에 대한 저항성 마커 (R208)에서 확실한 차이를 보인 두 자포니카 품종(일품벼과 상해향혈나)을 대상으로 벼멸구 저항성 유전자(Os-Bil)와 내염성과의 관련성을 조사하였다. 이를 위해 두 품종에서 염처리에 의한 Os-Bil 발현량의 변화를 real-time PCR을 이용해 정량화 하였으며, 인디카 두 품종(Pokkali와 IR29)의 결과와 비교하였다. 일품벼는 50, 200 mM NaCl 처리에서 Os-Bil 유전자의 발현량이 농도 의존적으로 감소하였으며, 상해향혈나는 50mM에서만 약간 증가하고 200mM에서는 크게 감소하였다. 비교해서, 내염성인 Pokkali는 Os-Bil의 발현량이 100 mM의 NaCl 처리에 의해 약 2배 증가하였으나 감수성인 IR29는 같은 농도에서 발현량이 감소하였다. 이러한 결과들은 벼멸구 저항성 유전자(Os-Bil)가 적어도 인디카 품종들의 내염성 차이에 관여함을 의미하는 것으로 보인다.

• 한국식품위생안전성학회지
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• 제27권3호
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• pp.317-324
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• 2012

본 연구는 식품원료의 진위여부를 판별하기 위한 시험법으로 일반 프라이머를 이용한 DNA barcode 기법을 도입하였다. 동물성식품원료의 경우 미토콘드리아 DNA 중 cytochrome oxidase subunit I(COI) 부위 검출을 위하여 디자인된 프라이머(LCO1490/HCO2198 및 VF2/FISH R2)와 cytochrome b(cyt b) 부위 검출을 위하여 디자인된 프라이머(L14724/H15915)를 사용하였다. 상기 3 종류의 프라이머를 사용하여 가축류 6종(소, 돼지, 염소, 양, 말 및 사슴), 가금류 4종(닭, 오리, 칠면조 및 타조), 어류 7종(명태, 대구, 청대구, 청어, 송어, 다랑어 및 우럭)을 대상으로 PCR 후 전기영동하여 예상되는 PCR 산물의 생성 유무를 확인하였다. 가축류 6종에 대하여는 LCO1490/HCO2198, VF2/FISH R2 및 L14724/H15915 프라이머를 사용한 경우 COI 및 cyt b가 모두 검출되었으며, 가금류 4종은 LCO1490/HCO2198 및 VF2/FISH R2 프라이머를 사용한 경우만 COI이 검출되었다. 또한 어류 7종은 VF2/FISH R2 프라이머를 사용한 경우에만 COI 부위가 검출됨을 확인하였다. 식물의 경우 엽록체 DNA 부위를 이용하여 디자인된 3 종류의 프라이머(trnH/psbA, rpoB 1F/4R 및 rbcL 1F/724R)를 사용하였다. 각각의 프라이머를 이용하여 식물 5종(마늘, 양파, 무, 녹차 및 시금치)에 대하여 실험한 결과 3종류의 프라이머에서 PCR의 산물을 모두 확인하였으며 trnH/psbA 프라이머의 경우 식물 종마다 PCR 산물의 크기는 다르게 검출되었다. 본 연구에서는 17종의 식품원료별 일반 프라이머 및 PCR 조건을 확립하였으며, 생산된 PCR 산물을 대상으로 염기서열을 결정하고 유전자은행에 있는 염기서열과 DB 비교 분석을 통하여 식품에 사용된 원료의 진위여부 판별에 적용이 가능할 것으로 기대된다.

• The Plant Pathology Journal
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• 제31권2호
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• pp.123-131
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• 2015

Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus (Cms) multiplies very rapidly, passing through the vascular strands and into the stems and petioles of a diseased potato. Therefore, the rapid and specific detection of this pathogen is highly important for the effective control of the pathogen. Although several PCR assays have been developed for detection, they cannot afford specific detection of Cms. Therefore, in this study, a computational genome analysis was performed to compare the sequenced genomes of the C. michiganensis subspecies and to identify an appropriate gene for the development of a subspecies-specific PCR primer set (Cms89F/R). The specificity of the primer set based on the putative phage-related protein was evaluated using genomic DNA from seven isolates of Cms and 27 other reference strains. The Cms89F/R primer set was more specific and sensitive than the existing assays in detecting Cms in in vitro using Cms cells and its genomic DNA. This assay was also able to detect at least $1.47{\times}10^2copies/{\mu}l$ of cloned-amplified target DNA, 5 fg of DNA using genomic DNA or $10^{-6}$ dilution point of 0.12 at $OD_{600}$ units of cells per reaction using a calibrated cell suspension.

• 대한수의학회지
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• 제39권2호
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• pp.343-352
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• 1999

Vancomycin resistant enterococci (VRE) have emerged as an important nosocomial pathogen. Since 1989 the Center for Disease Control, United States, has reported a rapid increase in the incidence of enterococcal bacteremia and endocarditis infection by VRE. It was suggested that the use of avoparcin was associated with the appearance of VRE in animal husbandry. To date, several detection methods have been used based on conventional methods of culture and gene detection. However, these methods have some limitations such as time-consuming, laborious and additional differential needs. Therefore, In this study a multiplex PCR method was established to detect and differentiate resistance types of enterococci which specifically amplify the four van genes encoding vancomycin resistance elements. Using the method, we investigated the incidence rates and types of VRE from farms using or not using avoparcin. A total of 1091 animal fecal samples were collected from 70 pig and 32 poultry farms. A total of 425 of enterococci were isolated from samples. Of the 425 isolates, 11 of the them showed a pattern of high-level vancomycin resistance (MIC : $64{\sim}256{\mu}g/ml$) which was associated with the presence of the vanA or vanB gene. Fifty-seven isolates showed a pattern of low-level vancomycin resistance (MIC : $3{\sim}8{\mu}g/ml$) associated with the vanC-1 or vanC-2 gene. Interestingly, all isolates with high-level vancomycin resistance were from farms that have never used avoparcin. Moreover, the high-level VRE isolation rate in Korea (2.58%) was much lower than that of other countries (50% in England, 7% in Belgium) where avoparcin have been used. In conclusion, the multiplex PCR method established in this study could be applied for detection of VRE.