Primary cultures of rat fetus brain exhibit phenotypes of neuron, oligodendrocyte, and astrocyte from "neurospheres". To understand the role of mitogen-activated protein kinase (MAPK) cascade and gap junctional intercellular communication (GJIC) in the differentiation of neurosphere-derived astrocyte, we investigated the effects of 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate (TPA) on the cultured astrocyte morphology.(omitted)
영아형 바텐병은 PPT1 결핍 및 기능장애로 인해 발병하며, 12,500명 당 1명의 발병률을 가진 신경 퇴행 질환이다. 전 세계적으로 수많은 연구가 진행 중 이지만, 아직 명확하게 밝혀진 발병원인 및 치료방법에 대해서는 알려지고 있지 않다. 본 연구에서는 뇌에서 풍부하게 발현되는 neurogranin의 발현수준이 WT과 EBD KO 쥐에서 어떤 변화를 보이는지 확인하기 위해 mRNA, 단백질, 배양된 neurospheres를 이용하여 실험을 수행하였다. real-time PCR을 통한 neurogranin의 발현수준 비교 결과 WT에서는 노화와 무관하게neurogranin mRNA 수준에 차이가 없었으나, EBD KO 쥐에서는 노화가 진행됨에 따라 neurogranin mRNA 발현수준이 감소하였으며, 뇌에서 추출된 단백질을 이용한 western blot 분석에서도 real-time PCR과 동일한 결과를 확인할 수 있었다. 또한 WT, EBD KO 쥐의 태아로 부터 neural stem cell 인 neurospheres를 배양하여 western blot 분석을 수행한 결과 PPT1 결핍에 의해 neurogranin의 정상적인 인산화에 문제가 발생함을 확인하였다. 이러한 결과들을 바탕으로 neurospheres에 산화스트레스 유발물질인 $H_2O_2$를 처리하였고, 24시간 경과 후 항산화제인 NAC을 처리하자 $H_2O_2$를 처리한 시료에서는 mock control인 인산화된 neurogranin에 비해 그 수준이 증가하였으며, $H_2O_2$ 처리 후 NAC을 투여한 시료의 인산화 수준은 mock control 보다는 높았지만 $H_2O_2$만을 처리한 시료 수준보다 neurogranin의 인산화 정도가 감소하는 결과를 확인하였다. 이러한 결과들을 통해 PPT1 결핍으로 인해 신경세포 내에 과다하게 인산화된 neurogranin이 존재하며, neurogranin 인산화 정도는 세포가 지닌 산화스트레스 정도에 의해 변화함을 알 수 있었다. 또한 항산화제를 사용하여 세포의 산화스트레스 수준을 감소시킬 경우 neurogranin의 기능을 정상적으로 회복시킬 수 있는 가능성을 확인하였다.
Qi, Ling;Ren, Kuang;Fang, Fang;Zhao, Dong-Hai;Yang, Ning-Jiang;Li, Yan
Asian Pacific Journal of Cancer Prevention
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제16권12호
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pp.4849-4852
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2015
Tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL) has been investigated as an effective agent to treat various cancers. Cancer stem cells are resistant to TRAIL treatment, but the mechanism of TRAIL resistance remains unknown. In this study, brain cancer stem cells were isolated by CD133 magnetic sorting, and the number of CD133 positive cells detected by flow cytometry. The self-renewing capacity of brain cancer stem cells was examined by a neurosphere formation assay, and the percentage of cell death after TRAIL treatment was examined by an MTS assay. Expression of DR5, FADD, caspase 8 and BCL2 proteins was detected by western blot. The amount of CD133 positive cells was enriched to 71% after CD133 magnetic sorting. Brain cancer stem cell neurosphere formation was significantly increased after TRAIL treatment. TRAIL treatment also reduced the amount of viable cells and this decrease was inhibited by a caspase 8 inhibitor or by the pan-caspase inhibitor z-VAD (P<0.05). Brain cancer stem cells expressed lower levels caspase 8 protein and higher levels of BCL2 protein when compared with CD133 negative cells (P<0.05). Our data suggest that TRAIL resistance is related to overexpression of BCL2 and low expression of caspase 8 which limit activation of caspase 8 in brain cancer stem cells.
Lee, Woo Sang;Kwon, Junhye;Yun, Dong Ho;Lee, Young Nam;Woo, Eun Young;Park, Myung-Jin;Lee, Jae-Seon;Han, Young-Hoon;Bae, In Hwa
Molecules and Cells
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제37권1호
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pp.17-23
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2014
We already had reported that Bcl-w promotes invasion or migration in gastric cancer cells and glioblastoma multiforme (GBM) by activating matrix metalloproteinase-2 (MMP-2) via specificity protein 1 (Sp1) or ${\beta}$-cateinin, respectively. High expression of Bcl-w also has been reported in GBM which is the most common malignant brain tumor and exhibits aggressive and invasive behavior. These reports propose that Bcl-w-induced signaling is strongly associated with aggressive characteristic of GBM. We demonstrated that Sp1 protein or mRNA expression is induced by Bcl-w using Western blotting or RT-PCR, respectively, and markedly elevated in high-grade glioma specimens compared with low-grade glioma tissues using tissue array. However, relationship between Bcl-w-related signaling and aggressive characteristic of GBM is poorly characterized. This study suggested that Bcl-w-induced Sp1 activation promoted expression of glioma stem-like cell markers, such as Musashi, Nanog, Oct4 and sox-2, as well as neurosphere formation and invasiveness, using western blotting, neurosphere formation assay, or invasion assay, culminating in their aggressive behavior. Therefore, Bcl-w-induced Sp1 activation is proposed as a putative marker for aggressiveness of GBM.
This study was to examine whether the in vitro differentiated neural cells derived from human embryonic stem (hES, MB03) cells can be survived and expressed tyrosin hydroxylase(TH) in grafted normal or PD rat brain. To differentiate in vitro into neural cells, embryoid bodies (EB: for 5 days, without mitogen) were formed from hES cells, neural progenitor cells(neurosphere, for 7-10 days, 20 ng/㎖ of bFGF added N2 medium) were produced from EB, and then finally neurospheres were differentiated into mature neuron cells in N2 medium(without bFGF) for 2 weeks. In normal rat brain, neural progenitor cells or mature neuron cells (1×10/sup 7/ cells/㎖) were grafted to the striatum of normal rats. After 2 weeks, when the survival of grafted hES cells was examined by immunohistochemical analysis, the neural progenitor cell group indicated higher BrdU, NeuN+, MAP2+ and GFAP+ than mature neuron cell group in grafted sites of normal rats. This result demonstrated that the in vivo differentiation of grafted hES cells be increased simultaneously in both of neuronal and glial cell type. Also, neural progenitor cell grafted normal rats expressed more TH pattern than mature neuron cells. Based on this data, as a preliminary test, when the neural progenitor cells were grafted into the striatum of 6-hydroxydopamine lesioned PD rats, we confirmed the cell survival (by double staining of Nissl and NeuN) and TH expression. This result suggested that in vitro differentiated neural progenitor cells derived from hES cells are more usable than mature neuron cells for the neural cell grafting in animal model and those grafted cells were survived and expressed TH in normal or PD rat brain.
Kwon, Jae-Kyung;Choi, Dong-Joo;Yang, Haijie;Ko, Dong Wan;Jou, Ilo;Park, Sang Myun;Joe, Eun-Hye
The Korean Journal of Physiology and Pharmacology
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제25권6호
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pp.565-574
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2021
Astrocytes are activated in response to brain damage. Here, we found that expression of Kir4.1, a major potassium channel in astrocytes, is increased in activated astrocytes in the injured brain together with upregulation of the neural stem cell markers, Sox2 and Nestin. Expression of Kir4.1 was also increased together with that of Nestin and Sox2 in neurospheres formed from dissociated P7 mouse brains. Using the Kir4.1 blocker BaCl2 to determine whether Kir4.1 is involved in acquisition of stemness, we found that inhibition of Kir4.1 activity caused a concentration-dependent increase in sphere size and Sox2 levels, but had little effect on Nestin levels. Moreover, induction of differentiation of cultured neural stem cells by withdrawing epidermal growth factor and fibroblast growth factor from the culture medium caused a sharp initial increase in Kir4.1 expression followed by a decrease, whereas Sox2 and Nestin levels continuously decreased. Inhibition of Kir4.1 had no effect on expression levels of Sox2 or Nestin, or the astrocyte and neuron markers glial fibrillary acidic protein and β-tubulin III, respectively. Taken together, these results indicate that Kir4.1 may control gain of stemness but not differentiation of stem cells.
Adult neurogenesis has been reported in the hypothalamus, subventricular zone and subgranular zone in the hippocamp. Recent studies indicated that new cells in the hypothalamus are affected by diet. We previously showed beneficial effects of safflower seed oil (SSO), a rich source of linoleic acid (LA; 74%), on proliferation and differentiation of neural stem cells (NSCs) in vitro. In this study, the effect of SSO on hypothalamic neurogenesis was investigated in vivo, in comparison to synthetic LA. Adult mice were treated with SSO (400 mg/kg) and pure synthetic LA (300 mg/kg), at similar concentrations of LA, for 8 weeks and then hypothalamic NSCs were cultured and subsequently used for Neurosphere-forming assay. In addition, serum levels of brain-derived neurotrophic factor (BNDF) were measured using enzyme-linked immunosorbent assay. Administration of SSO for 8 weeks in adult mice promoted the proliferation of NSCs isolated from SSO-treated mice. Immunofluorescence staining of the hypothalamus showed that the frequency of astrocytes (glial fibrillary acidic protein+ cells) are not affected by LA or SSO. However, the frequency of immature (doublecortin+ cells) and mature (neuronal nuclei+ cells) neurons significantly increased in LA- and SSO-treated mice, compared to vehicle. Furthermore, both LA and SSO caused a significant increase in the serum levels of BDNF. Importantly, SSO acted more potently than LA in all experiments. The presence of other fatty acids in SSO, such as oleic acid and palmitic acid, suggests that they could be responsible for SSO positive effect on hypothalamic proliferation and neurogenesis, compared to synthetic LA at similar concentrations.
Lin, Kaili;Liu, Bin;Lim, Sze-Lam;Fu, Xiuqiong;Sze, Stephen C.W.;Yung, Ken K.L.;Zhang, Shiqing
Journal of Ginseng Research
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제44권3호
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pp.475-482
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2020
Background: Active natural ingredients, especially small molecules, have recently received wide attention as modifiers used to treat neurodegenerative disease by promoting neurogenic regeneration of neural stem cell (NSC) in situ. 20(S)-protopanaxadiol (PPD), one of the bioactive ingredients in ginseng, possesses neuroprotective properties. However, the effect of PPD on NSC proliferation and differentiation and its mechanism of action are incompletely understood. Methods: In this study, we investigated the impact of PPD on NSC proliferation and neuronal lineage differentiation through activation of the Wnt/glycogen synthase kinase (GSK)-3β/β-catenin pathway. NSC migration and proliferation were investigated by neurosphere assay, Cell Counting Kit-8 assay, and EdU assay. NSC differentiation was analyzed by Western blot and immunofluorescence staining. Involvement of the Wnt/GSK3β/β-catenin pathway was examined by molecular simulation and Western blot and verified using gene transfection. Results: PPD significantly promoted neural migration and induced a significant increase in NSC proliferation in a time- and dose-dependent manner. Furthermore, a remarkable increase in anti-microtubule-associated protein 2 expression and decrease in nestin protein expression were induced by PPD. During the differentiation process, PPD targeted and stimulated the phosphorylation of GSK-3β at Ser9 and the active forms of β-catenin, resulting in activation of the Wnt/GSK-3β/β-catenin pathway. Transfection of NSCs with a constitutively active GSK-3β mutant at S9A significantly hampered the proliferation and neural differentiation mediated by PPD. Conclusion: PPD promotes NSC proliferation and neural differentiation in vitro via activation of the Wnt/GSK-3β/β-catenin pathway by targeting GSK-3β, potentially having great significance for the treatment of neurodegenerative diseases.
Gap junctional intercellular communication (GJIC) plays a key role during development, process of tissue differentiation, and in maintenance of adult tissue homeostasis. Neural stem cells leading to formation of cell clusters termed 'neurospheres', can differentiate into neurons, oligodendrocytes, and astrocytes. We investigated the expression levels and distribution of connexin43 (Cx43) and connexin32 (Cx32), abundant gap junctional protein in neural cells and in neurospheres isolated from rat fetus embryonic day (ED) 17. During differentiation of neurospheres, expression of Cx43 and 32 were increased time-dependently within 72 h, and then decreased at 7 day in western blot analysis. TPA-induced inhibition of GJIC was confirmed by decreased fluorescence by SL/DT assay, and induced hyperphosphorylation of Cx43 while no changes in Cx32 levels in western blot assay. Our results indicate that GJIC may be a crucial role in the differentiation of neuronal stem cell. And this GJIC can be inhibited by TPA through the hyperphosphorylation of Cx43.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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