• Journal of Oral Medicine and Pain
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• 제34권3호
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• pp.261-276
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• 2009

Sreptomyces라는 세균에서 추출한 lactacystin은 선택적인 proteasome 억제제로서 많은 연구에서 사용되어져 왔다. Proteasome 억제제는 최근의 많은 연구를 통해서 암세포증식의 억제에 대한 효과가 증명되었으며, 특히 다른 항암제와 병용처리 시, 상호작용에 의한 상승효과가 있다고 알려져 있다. 현재 proteasome 억제제는 새로운 강력한 항암제로서 분류되어 있다. 본 연구는 사람혀편평세포암종세포(SCC25 cells)에서 lactacystin의 세포독성과 성장억제 효과, 그리고 세포자멸사의 유도에 대한 분자생물학적 기전을 밝히기 위해 실험을 시행하였다. SCC25 세포, 사람정상각화세포 (HaCaT cells) 그리고 사람치은섬유모세포(HGF-1 cells)의 생존율 측정은 MTT법을 시행하였고, SCC25 세포의 성장억제를 확인하기 위해서는 clonogenic assay를 사용하였다. lactcystin이 SCC25 세포에서 세포자멸사가 유도되는지를 확인하기 위해서 hoechst 염색법, hemacolor 염색법 그리고 TUNEL법을 시행하였다. 그리고 SCC25 세포에 lactacystin을 적용한 후, Western blot 분석, 세포면역화학염색, 공초점레이저주사현미경 검경, FACScan flow cytometry, 사립체막 전위변화, proteasome 활성도 측정 등을 시행하였다. Lactacystin으로 처리된 SCC25 세포는 시간 및 용량 의존적인 세포생존율의 감소, 용량의존적인 세포성장억제 그리고 세포자멸사에 의한 세포죽음을 보였다. 흥미롭게도 lactacytin은 정상세포인 HaCat 세포와 HGF-1 세포에서는 세포독성을 전혀 보이지 않았다. 그리고 lactacystin이 적용된 SCC25세포에서 핵 응축, DNA의 조각남, 사립체막전위와 proteasome 활성도의 감소, DNA 양의 감소, cytochrome c의 사립체에서의 세포질로의 유리, AIF와 DFF40 (CAD)의 핵으로의 이동, Bax의 증가, caspase-7, caspase-3, PARP, lamin A/C 그리고 DFF45 (ICAD)의 활성화 혹은 파괴와 같은 아주 다양한 세포자멸사 증거를 보였다. Flow cytometry 분석에서는 CDK 억제제인 $p21^{WAF1/CIP1}$와 $p27^{KIP1}$의 발현 증가와 관계있는 것으로 추정되어 지는 G1 세포주기 정지를 보였다. 이러한 결과는 lactacytin이 SCC25 세포에서 G1 세포주기정지와 proteasome, 사립체 및 caspase 경로의 연속반응을 통한 세포자멸사를 유도함을 명확하게 증명하고 있다. 이와 같은 세포주기 정지와 세포자멸사 유도능은 lactacytin이 사람혀편평상피세포암종의 새로운 치료전략으로서의 가능성을 제공한다고 생각한다.

• Bulletin of the Korean Chemical Society
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• 제29권1호
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• pp.89-93
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• 2008

The key step in a strategy for the synthesis of (+)-lactacystin involving photocyclization reaction of a cyclopenta-fused pyridinium salt has been probed by using a model substrate. Observations made in this effort led to the discovery of a highly unusual cascade process that leads to stereoselective formation of an interesting tricyclic carbamate. The results of this study are presented and discussed in the context of a (+)-lactacystin synthetic approach.

• International Journal of Oral Biology
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• 제33권1호
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• pp.25-31
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• 2008

Inhibition of proteasome activity may reduce many types of cancer, so it's pathway is effective in cancer as well as in clinical fields. Here the author has carried out experiment targeting on the elevation of apoptosis in oral cancer cells by combination of proteasome inhibitor, lactacystin, and DNA replication inhibitor, etoposide. The growth of KB cells was measured by MTT methods and apoptosis was analyzed by DNA fragmentation and Hochest nucleus staining. The proteasome activity was analyzed by fluorescent tagged peptide and cellular protein expression was detected by Western hybridization. Though lactacystin and etoposide inhibited KB cell growth alone, but low combined doses inhibited cell growth more strongly and induced apoptosis. The proteasome activity was also seriously inhibited by the combination of both chemicals. Tumor suppressor proteins and apoptosis inducing proteins were highly increased under the combination of both chemicals. From above studies we can conclude that proteasome inhibitors may be used for the treatment of oral cancer and proteasome inhibitors with DNA replication inhibitors may be effective in clinical trials of oral cancer.

• 생명과학회지
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• 제26권2호
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• pp.226-233
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• 2016

혈관평활근세포의 세포자멸사는 죽상경화증을 비롯한 여러 혈관질환에서 일어나며, 죽상판의 불안정화에 중요한 역할을 한다. Oxysterol은 혈관평활근세포의 세포자멸사를 야기하는데, 죽상경화 병변에는 비효소적으로 생성되는 주된 oxysterol인 7-ketocholesterol (7KC)이 대량 존재한다고 알려져 있다. 그러나 7KC에 의한 혈관평활근세포의 세포자멸사에 관하여 밝혀진 자세한 기전은 아직 미흡하다. 본 연구는 7KC가 혈관평활근세포의 세포자멸사를 일으키는 기전을 구명하고자 하였다. Sprague-Dawley계 숫쥐의 대동맥 절편으로부터 배양한 혈관평활근세포에 7KC를 처리하여 혈관평활근세포의 생존력의 변동과 세포자멸사를 각각 methylthiazole tetrazolium bromide 분석법 및 trypan blue 분석법 그리고 유세포 분석법, 면역 형광 측정법, 면역침전법 및 웨스턴블럿 등으로 측정하였다. 7KC는 혈관평활근세포의 생존력을 시간- 및 농도-의존적으로 감소시켰고, 혈관평활근세포내에 지질과산화 최종산물인 4-hydroxynonenal (HNE) 생성을 증가시켰으며, HNE 단독 처리 또한 혈관평활근세포의 생존력을 농도-의존적으로 감소시켰다. 7KC 또는 HNE에 의하여 감소되었던 혈관평활근세포의 생존력은 HNE 생성 억제제인 2,4-dinitrophenyl hydrazine 전처치에 의하여 회복되었다. 더욱이 세포생존 매개인자로 잘 알려져 있는 Akt의 발현이 7KC와 HNE에 의하여 농도-의존적으로 감소되었고, 2,4-dinitrophenyl hydrazine 또는 N-acetylcysteine 전처치에 의하여 회복되었다. 단백질분해효소복합체 억제제인 lactacystin은 7KC에 의한 세포자멸사와 Akt 감소는 억제하였지만 7KC에 의한 HNE 생성은 억제하지 못하였다. HNE에 결합된 Akt의 양은 7KC와 HNE에 의하여 현저히 증가하였으며 단백질분해효소복합체 억제제인 lactacystin 전처치 시에도 유의하게 증가하였다. 이상의 결과로 보아 죽상경화 병변에서 7KC는 혈관평활근세포내 HNE 생성을 증가시키고, 이 HNE에 결합된 Akt는 단백질분해효소복합체에 의하여 분해되는 것으로 보이며, 이와 같은 기전에 의하여 죽상판의 불안정화가 촉진되는 것으로 생각된다.

• Biomolecules & Therapeutics
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• 제21권2호
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• pp.107-113
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• 2013

Plasminogen activator inhibitor-1 (PAI-1) is a member of serine protease inhibitor family, which regulates the activity of tissue plasminogen activator (tPA). In CNS, tPA/PAI-1 activity is involved in the regulation of a variety of cellular processes such as neuronal development, synaptic plasticity and cell survival. To gain a more insights into the regulatory mechanism modulating tPA/PAI-1 activity in brain, we investigated the effects of proteasome inhibitors on tPA/PAI-1 expression and activity in rat primary astrocytes, the major cell type expressing both tPA and PAI-1. We found that submicromolar concentration of MG132, a cell permeable peptide-aldehyde inhibitor of ubiquitin proteasome pathway selectively upregulates PAI-1 expression. Upregulation of PAI-1 mRNA as well as increased PAI-1 promoter reporter activity suggested that MG132 transcriptionally increased PAI-1 expression. The induction of PAI-1 downregulated tPA activity in rat primary astrocytes. Another proteasome inhibitor lactacystin similarly increased the expression of PAI-1 in rat primary astrocytes. MG132 activated MAPK pathways as well as PI3K/Akt pathways. Inhibitors of these signaling pathways reduced MG132-mediated upregulation of PAI-1 in varying degrees and most prominent effects were observed with SB203580, a p38 MAPK pathway inhibitor. The regulation of tPA/PAI-1 activity by proteasome inhibitor in rat primary astrocytes may underlie the observed CNS effects of MG132 such as neuroprotection.

• 생명과학회지
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• 제16권4호
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• pp.598-604
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• 2006

$Ca^{2+}$-농도 의존적으로 활성화되는 neutral protease calpain에 의한 단백질 분해는 세포의 성장을 조절하는데 중요한 단백질들의 역할에 매우 중요한 역할을 한다. Cyclin의 분해는 세포주기의 진행을 위한 필연적인 과정이다. D-type cyclins는 외부자극이나 신호에 의하여 세포주기의 G1 초기에 합성이 된 후 cyclin-dependent kinases (cdk4 및 cdk6)와의 결합하여 세포주기 S기 진입을 촉진하는 역할을 한다. 본 연구에서는 MDA-MB-231 인체 유방암세포에서 cyclin D3 단백질이 calpain protease에 의하여 전사 후 수준에서 조절 받고 있음을 제시하였다. 본 실험의 조건에서 lovastatin과 actinomycin D가 처리된 MDA-MB-231 세포에서 cyclin D3 단백질의 발현이 완전히 사라졌지만, calpain inhibitor인 LLnL의 처리에 의하여 정상 수준으로 회복되었음을 알 수 있었다. 그러나 26S proteasome의 선택적 억제제인 lactacystin, the lysosome 억제제인 ammonium chloride 및 chloroquine, serine protease 억제제인 PMSF는 동일 조건에서 lovastatin과 actinomycin D 처리에 의한 cyclin D3의 발현저하를 억제하지는 못하였다. In vitro 조건에서 순수 분리된 calpain은 cyclin D3 단백질을 $Ca^{2+}$ 농도 의존적으로 분해하였으며, cyclin D3 단백질의 half-life는 LLnL 처리에 의하여 매우 유의적으로 증가되었다. 이러한 결과는 cyclin D3 단백질이 $Ca^{2+}$에 의해 활성화 되는 protease calpain에 의해 조절됨을 보여준다.

• Journal of Life Science
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• 제10권1호
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• pp.57-63
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• 2000

${\beta}$-catenin, which plays a critical role in both the cytoskeleton and in transcriptional regulation in variousadherent cell types, undergoes degradation during adherent cell apoptosis. Although ${\beta}$-catenin has been reported to be present in Jurkat T-acute lymphoblastic leukemia cells, the regulation of ${\beta}$-catenin in hematologic malignancies have not been examined. The data presented here demonstrate that treatment of the T cell leukemia Jurkat iwht the apoptosis inducer anti-Fas induced proteolytic cleavage of ${\beta}$-catenin. ${\beta}$-catenin was cleaved at both the N- and C-terminus after anti-Fas treatment. Cleavage of intact ${\beta}$-catenin was completely inhibited by caspase selective protease inhibitors. These data demonstrate that ${\beta}$ -catenin proteolysis is triggered by the cross-linking of the Fas receptor on Jurkat cells and subsequent activation of caspase protease. There was a clear accumulatio of the large proteolytic fragment in Jurkat cells treated with lactacystin of ALLM. These are potent inhibitors of proteasome and calpain. these results suggest that both the proteasome and clapain may recognize the large ${\beta}$-catenin fragment as a substrate fot further degradation and that these pathewasy may act downstream of scapase in response to Fas receptor activation. Therefore, we suggest that ${\beta}$-catenin may play a role in promoting Jurkat survival.

• Tuberculosis and Respiratory Diseases
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• 제70권2호
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• pp.113-124
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• 2011

Background: Macrophages are one of the most important inflammatory cells in innate immunity. PU.1 is a macrophage-specific transcription factor. Ubiquitins are the ultimate regulator of eukaryotic transcription. The ubiquitination process for PU.1 is unknown. This study investigated the lipopolysaccharide (LPS)-induced activation of PU.1 and its relation to ubiquitins in the macrophages. Methods: Raw264.7 cells, the primary cultured alveolar, pulmonary, and bone marrow derived macrophages were used. The Raw264.7 cells were treated with MG-132, $NH_4Cl$, lactacytin and LPS. Nitric oxide and prostaglandin D2 and E2 were measured. Immunoprecipitation and Western blots were used to check ubiquitination of PU.1. Results: The PU.1 ubiquitination increased after LPS ($1{\mu}g$/mL) treatment for 4 hours on Raw264.7 cells. The ubiquitination of PU.1 by LPS was increased by MG-132 or $NH_4Cl$ pretreatment. Two hours of LPS treatment on macrophages, PU.1 activation was not induced nor increased with the inhibition of proteasomes and/or lysosomes. The ubiquitination of PU.1 was increased in LPS-treated Raw264.7 cells at 12- and at 24 hours. LPS-treated cells increased nitric oxide production, which was diminished by MG-132 or $NH_4Cl$. LPS increased the production of $PGE_2$ in the alveolar and peritoneal macrophages of wild type mice; however, $PGE_2$ was blocked or diminished in Rac2 null mice. Pretreatment of lactacystin increased $PGE_2$, however it decreased the $PGD_2$ level in the macrophages derived from the bone marrow of B57/BL6 mice. Conclusion: LPS treatment in the macrophages ubiquitinates PU.1. Ubiquitination of PU.1 may be involved in synthesis of nitric oxide and prostaglandins.

• 대한의생명과학회지
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• 제20권4호
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• pp.250-255
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• 2014

Mycobacterium tuberculosis (MTB) resides and replicates inside macrophages. In our previous report, we reported that CD8+ T cell-mediated immune responses specific for the peptide derived from MTB RNA polymerase beta-subunit ($RpoB_{127-135}$) could be induced in TB patients expressing HLA-$A^*0201$ subtype. In order to examine whether $RpoB_{127-135}$ specific CD8+ T cells can recognize MTB infected macrophages in vitro, CD8+ T cell lines specific for $RpoB_{127-135}$ peptide were generated from peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) of healthy HLA-$A^*0201$ subjects by in vitro immunization technique. In this study, we observed $RpoB_{127-135}$ specific CD8+ T cells could recognize and destroy macrophages infected with MTB for 2 to 4 days. $RpoB_{127-135}$ specific CD8+ T cell immune response was inducible from PBMC of healthy subjects expressing HLA-$A^*0206$ subtype, one of HLA-A2 supertype members. Next, we investigated the HLA-I processing mechanism of $RpoB_{127-135}$ peptide in MTB infected macrophages. As a result, the presentation of the MTB derived epitope peptide, $RpoB_{127-135}$, to CD8+ T cells was not inhibited by the treatment with brefeldin-A (ER-Golgi transport inhibitor) or lactacystin (proteasome inhibitor), which blocks the classical HLA-I processing pathway. However, $RpoB_{127-135}$ specific CD8+ T cell activity was blocked either by the blocking agent for the endocytosis (cytochalasin D) or by the blocking antibody (W6/32) for HLA-I molecules. Therefore, the $RpoB_{127-135}$ peptide may be processed by accessing the alternate HLA-I processing pathway. Understanding the processing and presentation mechanisms of the MTB derived proteins will help to improve the efficacy of vaccines and the efficiency of therapeutic agents for TB.

• 생명과학회지
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• 제25권1호
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• pp.1-7
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• 2015

칼슘 의존적으로 활성화되는 neutral protease calpain에 의한 단백질 분해는 세포의 성장을 조절하는데 중요한 단백질들의 역할에 매우 중요한 역할을 한다. Cyclin의 분해는 세포주기의 진행을 위한 필연적인 과정이다. D-type cyclins는 외부자극이나 신호에 의하여 세포주기의 G1 초기에 합성이 된 후 cyclin-dependent kinases (cdk4 및 cdk6)와의 결합하여 세포주기 S기 진입을 촉진하는 역할을 한다. 본 연구에서는 cyclin D3 단백질이 calpain protease에 의하여 번역 후 수준에서 조절 받고 있음을 제시하였다. 본 실험의 조건에서 lovastatin과 actinomycin D가 처리된 PC-3-M 전립선 암세포에서 cyclin D3 단백질의 발현이 완전히 사라졌지만, calpain inhibitor인 LLnL의 처리에 의하여 정상 수준으로 회복되었음을 알 수 있었다. 그러나 26S proteasome의 선택적 억제제인 lactacystin, lysosome 억제제인 ammonium chloride 및 chloroquine, serine protease 억제제인 PMSF는 동일 조건에서 lovastatin과 actinomycin D 처리에 의한 cyclin D3 단백질의 발현저하를 억제하지는 못하였다. In vitro 조건에서 순수 분리된 calpain은 cyclin D3 단백질을 칼슘 농도 의존적으로 분해하였으며, cyclin D3 단백질의 반감기는 LLnL 처리에 의하여 매우 유의적으로 증가되었다. 또한 calpain 저해인자인 calpastatin의 과발현은 PC-3-M 세포에서 뿐만 아니라 NIH 3T3 섬유아세포에서도 cyclin D3 단백질의 반감기 및 안전성을 증대시켰다. 이러한 결과는 cyclin D3 단백질이 칼슘에 의해 활성화 되는 protease calpain에 의해 조절됨을 보여주는 것이다.