• Tuberculosis and Respiratory Diseases
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• 제50권2호
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• pp.213-221
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• 2001

연구배경 : 임상에서 흉부 엑스선상 폐결핵이 의심되나 객담 도말에서 음성이거나 객담배출을 못하는 환자에서 신속한 진단을 위해 기관지세척액에서 상품화된 Roche사의 Amplcor M. tuberculosis kit와 IS6110 in-house PCR의 유용성을 알아보고자 하였다. 방 법 : 객담 항산균도말에서 음성인 환자 혹은 결핵과 감별진단이 필요한 환자를 대상으로 기관지내시경을 시행하여 기관지세척액에서 항산균 도말, 결핵균배양, IS6110 PCR검사법, Roche사의 Amplicor PCR를 동시에 시행하였다. 결 과 : 기관지 세척액을 통한 항산균도말에서 활동성 결핵환자 19명 중 3명이 진단되어 민감도 15.8% 이었고 배양검사는 19명 중에 16명으로 84.2% 이었다. 기관지세척액을 이용한 IS6110 PCR의 경우 19명 중 14명이 양성으로 민감도는 87.2% 이었다. Amplicor M. tuberculosis kit는 19명에서 18명이 양생으로 민감도는 94.7% 이고 특이도는 97.9% 이었고 3명은 PCR과 임상양상으로 진단이 가능하였다. 위양생은 IS6110 PCR은 6명 이었고 Amplicor PCR은 1명이었다. 개별 검사법의 양성 예측도는 기관지 세척액 도말과 배양검사는 각각 100% 이었고 IS6110 PCR은 70%, Amplicor PCR은 94.7% 이었다. PCR검사법의 음성예측도와 정확도는 IS6110 PCR은 89.1%, 83.3% 이고 Amplicor PCR은 97.9%, 96.9% 이었다. 결 론 : 객담도말 음성인 환자의 진단에서 기관지경세척액을 이용한 Amplicor PCR법은 IS6110 PCR에 비해 폐결핵 진단의 감수성이 높았고 위양성률도 낮아 결핵을 신속하게 진단할 수 었어 불필요한 치료지연을 피할 수 있었다. 상품화된 PCR 검사법은 임상에서 결핵의 진단율을 높이고 수시간내 결과를 빨리 확인할 수 있는 장점은 있으나 통상적인 검사로 활용하기 위해서는 향후 연구가 더 필요할 것이다.

• Journal of Microbiology and Biotechnology
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• 제25권5호
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• pp.745-752
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• 2015

Tuberculosis (TB) is the most common mycobacterial infection in developing countries, requiring a rapid, accurate, and well-differentiated detection/diagnosis. For the rapid detection and discrimination of Mycobacterium tuberculosis complex (MTC) from non-tuberculous mycobacteria (NTM), a novel, simple, and primer-combined single-step multiplex PCR using three primer pairs (6110F-6110R, 1081F-1081R, and 23SF-23SR; annealing on each of IS6110, IS1081, and 23S rDNA targets), hereafter referred to as a triplex PCR, has been developed and evaluated. The expected product for IS6110 is 416 bp, for IS1081 is 300 bp, and for 23S rDNA is 206 bp by single PCR, which was used to verify the specificity of primers and the identity of MTC using DNA extracted from the M. tuberculosis H37Rv reference strain (ATCC, USA) and other mycobacteria other than tuberculosis (MOTT) templates. The triplex PCR assay showed 100% specificity and 96% sensitivity; the limit of detection for mycobacteria was ~100 fg; and it failed to amplify any target from DNA of MOTT (50 samples tested). Of 307 blinded clinical samples, overall 205 positive M. tuberculosis samples were detected by single PCR, 142 by conventional culture, and 90 by AFB smear methods. Remarkably, the triplex PCR could subsequently detect 55 positive M. tuberculosis from 165 culture-negative and 115 from 217 AFB smear-negative samples. The triplex PCR, targeting three regions in the M. tuberculosis genome, has proved to be an efficient tool for increasing positive detection/discrimination of this bacterium from clinical samples.

• 대한의생명과학회지
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• 제10권2호
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• pp.163-169
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• 2004

Worldwide, tuberculosis remains one of the leading infectious diseases, accounting for nearly 3 million deaths and more than 8 million new cases annually. DNA typing of Mycobacterium tuberculosis is important for the control of tuberculosis, since it can be used to track transmission route of tuberculosis, source of internal laboratory contaminations, and to answer questions on the nature of tuberculosis infections such as reactivation or exogenous reinfection of disease. At present, IS6110-based RFLP is the choice of method for typing large numbers of clinical isolates of M. tuberculosis, since it has the highest resolution power. However, RFLP requires long time, high cost and qualified experts, so only reference level laboratories can use the RFLP technique. In order to have an optional molecular typing method suitable for the clinical settings, this study evaluated the use of one of PCR-based typing methods, IS6110-based outward PCR for typing clinical isolates of M. tuberculosis. In brief, the results from this study showed that IS6110-based RFLP is useful to discriminate diverse clinical isolates of M. tuberculosis as well as to identify clinical isolates that belong to the same family or cluster groups that have been previously classified by RFLP analysis. In addition, the banding profiles resulted from IS6110-based outward PCR seemed to represent genomic characteristics of M. tuberculosis, since strains belong to the K-family generated unique band that is not present in any other strains but present only in the genome of K-family strains. The IS6110-based outward PCR was also shown to be useful with DNAs isolated directly from liquid cultures indicating this method can be suitable for typing M. tuberculosis in clinical settings.

• Tuberculosis and Respiratory Diseases
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• 제44권6호
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• pp.1245-1255
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• 1997

연구배경 : 결핵균의 rpoB 유전자는 Rifampicim이 결합하여 약리작용을 나타내는 RNA polymerase의 $\beta$-subunit을 encoding하는 유전자이다. 최근 PCR-SSCP 등의 다양한 방법을 이용하여 rpoB 유전자의 돌연변이를 발견함으로써 결핵균 다제약제내성의 지표인 Rifampicin 내성을 조기에 진단할 수 있는 방법에 대한 여러 보고가 있다. 그러나 대부분 배양된 검체를 대상으로 하였고 객담등의 임상검체를 직접 대상으로 한 연구는 별로 없었다. 본 연구는 직접 임상검체를 대상으로 결균의 rpoB유전자 PCR-SSCP를 시행함으로써 rifampicin 내성을 신속히 진단할 수 있는지 알아보았다. 대상 및 방법 : 1996년 6월부터 8월까지 아산재단 서울중앙병원에서 항산성도말검사 양성인 75검체를 대상으로 하였다. 이종 결핵균의 IS6110분절을 이용한 중합효소 연쇄반웅이 양성이고 RFP 감수성검사 결과가 확인된 43검체를 대상으로 하였다. Bead beater법으로 DNA를 추출하여 heminested PCR을 시행하였고 MDE gel을 이용하여 SSCP를 시행하였다. 이 검체즐은 배양 즉시 대한결핵협회에 감수성검사를 의뢰하여 PCR-SSCP 결과와 rifampicin 감수성검사 결과를 비교하였다. 결 과 : 75검체중 55예(73%)에서 IS6110분절에 대한 PCR 양성이었다. 이중에서 RFP에 대한 강수성결과가 확인된 43예를 대상으로 하였다. 29예는 표준균주인 H37Rv와 동일한 전기영동상의 이동성을 보였고, 14예는 다른 이동성을 보여 주었다. 동일한 이동성을 보인 29예 모두 감수성검사상 RFP감수성으로 판명되었고, 다른 이동성을 보인 14예 모두 RFP 내성으로 판명되었다. 즉 기존의 전통적인 RFP 감수성검사 결과와 직접임상검체에서 rpoB 유전자를 이용한 PCR-SSCP분석은 100% 일치하였다. 결 론 : 임상검체에서 직접 rpoB 유전자의 heminested PCR을 이용한 SSCP 법은 Rifampicin내성을 신속히 진단할 수 있는 방법으로 기대된다.

• Tuberculosis and Respiratory Diseases
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• 제42권5호
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• pp.695-702
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• 1995

연구 배경: 결핵성 흉막삼출은 아직까지도 우리나라에서 가장 흔한 흉막삼출 원인으로 생각되고 있으나 기존의 검사로는 60% 정도의 확진만이 가능하다. 이에 보다 예민한 진단법의 개발이 요구되던 중 PCR의 발전으로 결핵성흉염의 진단에 도움을 줄 것으로 기대되었다. 여에 저자들은 PCR을 이용한 결핵성 흉막염 진단의 유용성을 알아보고자 하였다. 방법: 환자군으로 결핵성 흉막염으로 확진된 경우와 임상적으로 결핵성 흉막엽으로 의심이된 각각 7명의 선정하였고 대조군으로 결핵의 과거력이 없었던 7명의 악성종양 환자의 흉수를 각각 사용하여 PCR을 시행하였으며, PCR의 target은 IS6110 gene의 일부인 123bp DNA로 하였고 DNA추출은 Eisennach 방법(1991)을 변형하여 사용하였다. 결과: 1) PCR의 감수성검사에서 자외선 발광경하에서 50fg DNA에서 양성 임을 확인하였다. 2) 조직병리학적 및 미생물학적 방법으로 확진된 결핵성 흉막염 환자중 85.7%(6/7)에서 PCR양성을 나타내었고, 임상적으로 결핵성 흉막염이 의심된 환자중 71.5%(5/7)에서 PCR 양성을 나타내었다. 3) 대조군 7예는 모두 PCR 음성이었다. 결론: 이상의 결과로서 결핵성 흉막액의 진단에 있어서 IS6110을 이용한 PCR법은 고식적인 진단방법에 비하여 결핵균의 신속하고 정확한 진단을 가능하게 해주는 유용한 방법임을 알 수 있었으나 비용을 절감할 수 있고 오염을 줄일 수 있는 방법에 대한 연구가 더 필요하리라 생각된다.

• 보건세계
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• 제40권12호통권448호
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• pp.26-28
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• 1993

세포나 미생물의 특정 DNA 부위를 증폭하고자 할때 이용되는 PCR(polymerase chain reaction, 핵산중합효소 연쇄반응)은 1983년 미국 Cetus사의 Mullos에 의해 고안되었고, 그후 PCR에 의한 마이코 박테리아의 동정 및 검출이 특정 염기서열의 연구가 이루어지면서 활발히 시도되었으며, 아이젠하크 등은 IS6110을 이용하여 본격적으로 PCR이 결핵균 검출에 유용한 도구로 사용될 수 있다는 가능성을 제시하였다. PCR에 의한 DNA증폭은 단시간 내에 이루어진다는 장점 때문에 유전병 및 미생물의 진단에 이용될 뿐 아니라 법의학 분야 및 장기이식에 따른 조직접합 시험에도 이용될 것으로 예상된다. 이에 따라 국내에서도 결핵연구원에서 최초로 일반 임상검사에 적용함으로써 현재 많은 호평을 받고 있는 PCR에 대하여 알아본다

• 한국동물위생학회지
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• 제30권3호
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• pp.393-406
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• 2007

Bovine tuberculosis is an important zoonosis worldwide. Mycobacterium bovis, the causative agent of this disease in cattle, is also a pathogen for humans and several economically important animals. The cases of tuberculosis are reported in two cow found at slaughter house located in Gwangju city. Histopathologically, in the lymph nodes, granulomas consisted of large areas of necrosis surrounded by variable thick bands of cellular infiltrate containing macrophages, Langhans-type multinucleated giant cells and lymphocytes. Lesions in the lung followed the same developmental pattern as did lesions in the lymph nodes with some exceptions. With the acid-fast staining, numerous mycobacteria were revealed in the lung and lymph nodes. M bovis was confirmed as a causative agent in these cattle using bacterial isolation and PCR and restriction fragment length polymorphism method based on a unique 12.7 kb fragment insertion sequence from the Mycobacterium tuberculosis genome and the pncA polymorphism, The insertion element IS6110 and IS1081 were present M bovis isolated from lungs and lymph nodes of cattle using PCR assay. These cases are interesting and important in public health aspect that M bovis-infected cattle were found during a routine post-mortem inspection at slaughter house.

• 한국동물위생학회지
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• 제25권2호
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• pp.135-140
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• 2002

The purpose of this study was to detect Mycobacterium bovis in cattle(serum, milk, lung, lymph node) by PCR. Nineteen samples from 7 skin test-positive cattle were analyzed. The amplified band of IS6110 by PCR was detected from 2 samples in lung and Iymph node. But the sensitivities of the present methods for detecting M bovis in milk and serum are deficient. Because the PCR sensitivity has been shown to be hindered by the method used to isolate the nucleic acid target. PCR-based methods have the potential to be faster, more accurate, and the most efficient means of detecting M bovis. The detection of M bovis by PCR will contribute to the more efficient detection and control of tuberculosis.

• Tuberculosis and Respiratory Diseases
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• 제39권6호
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• pp.517-525
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• 1992

연구배경 : 1985년 Saiki등에 의해, 특정한 DNA를 연속적으로 복제할 수 있는 방법인 polymerase chain reaction (PCR)이 개발된 이래, PCR은 검체내에 극미량으로 존재하고 있는 병원체의 진단에 큰 도움을 줄 것으로 기대되었다. 결핵균의 진단방법중, 도말염색 방법은 감수성이 낮아서 문제가 되고 있으며, 배양은 감수성은 높으나 기간이 오래 걸려서 임상적으로 도움을 주지 못하는 경우가 많다. 이에 저자들은 Mycobacterium tuberculosis의 특이 단백질인 65 kD mycobacterial antigen을 encoding하는 2520 base pair DNA중, 383 base pair DNA를 이용한 PCR과 IS6110 fragment의 일부인 123 base pair DNA를 이용한 PCR을 시행하여, 이의 감수성과 특이도를 알아보고 폐결핵 환자의 객담을 검체로한 결핵의 조기진단 방법을 개발하고자 하였다. 방법 : M. tuberculosis (H37Rv, H37Ra), M. avium, M. intracellulare, M. scrofulaceum 균주와 환자의 객담에서 DNA를 추출하여, 383 base pair DNA 양끝의 20 base pair DNA primer (TB-1, -2)와 IS6110 fragment 일부의 DNA 양끝의 20 base pair DNA primer (Sal I-1, -2) 로 PCR을 시행하였으며, 전기 영동후 자외선 발광으로 확인하였다. 결과 : 1) Ethidium bromide 염색후 발광경하에서, Mycobacterium tuberculosis (H37Rv, H37Ra)와 Mycobacterium bovis는 TB-1, -2 primer와 Sal I-1, -2 primer를 이용한 PCR에서 모두 양성을 보였고 Mycobacter intracellulare와 Mycobacterium scrofulaceum은 TB-1, -2 primer를 이용한 PCR에서만 양성을 보였다. 2) Southern Blot 분석에는 두쌍의 primer 모두에서 Mycobacterium tuberculosis (H37Rv, H37Ra)와 Mycobactgerium bovis만이 양성을 나타내었으며 Mycobacterium intracellulare 와 Mycobacterium scrofulaceum은 음성을 나타내었다. 3) Mycobacterium tuberculosis (H37Rv)를 순차적으로 희석하여 시행한 PCR에서 두쌍의 primer 모두에서 Mycobacterium 균 1개체에 해 당되는 1 fg DNA까지 양성을 나타내었다. 4) 임상적으로 진단받은 결핵환자의 시행한, Sal I-1, -2 primer를 이용한 PCR에서 도말 검경 양성군의 객담 29예중 28예인 96.6%에서 양성을 나타내었으며, 도말 정경 음성-배양 양성군에서는 5예중 4예(80.0%), 그리고 도말 검경 음성-배양 음성군에서는 26예중 6예(23.1%)가 양성을 나타내었고 음성 대조군 검체 16예에서 2예(12.5%)에서 양성을 나타내였다. 결론 : 이상의 결과로, PCR은 객담에서의 결핵균의 진단에 있어, 배양과 견줄 수 있는 특이도와 예민도를 보이고 있어, 특정한 경우 진단에 도움을 줄 수 있을 것으로 기대되며, 추후 방법의 개선을 위한 연구가 계속 필요할 것으로 사료된다.

• Tuberculosis and Respiratory Diseases
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• 제40권5호
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• pp.509-518
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• 1993

연구배경 : 결핵성 흉막 삼출은 아직까지도 우리나라에서 가장 흔한 흉막 삼출의 원인으로 생각되고 있으나, 조직학적 진단 방법을 포함한 기존의 진단 방법으로도 약 70%에서만 확진이 가능하다. 특히 고연령층이나 면역이 억제된 환자등에서 기존의 진단 방법으로 진단되지 않고, 여러가지 시험 치료에 반응하지 않는 흉막 삼출의 경우에는 임상적으로 어려움을 겪게 되며, 보다 예민한 진단 방법의 개발을 위해 여러 분야의 노력이 있어 왔다. PCR은 어느 특정한 DNA를 연속적으로 복제할 수 있어 검체내에 극미량으로 존재하고 있는 병원체의 진단에 이용되고 있으며, 결핵성 흉막염의 진단에도 도움을 줄것으로 기대되었다. 이에 저자들은 PCR을 이용한 결핵성 흉막염 진단의 유용성을 평가해 보고자 본 연구를 시행하였다. 방법 : 양성 및 음성 대조군으로 배양된 결핵균주및 비결핵성 Mycobacterium 균주를 사용하였고 연구 대상은 흉막 삼출 환자 53명이었다. 이중 결핵성 흉막염이 확진된 환자가 20명, 결핵성 흉막 삼출이 배제된 환자가 20명, 결핵이 확진되지 않았으나 임상적으로 결핵으로 의심하여 항결핵제제를 투여한 후 호전된 환자가 10명이었고, 항결핵제제 투여후에도 호전되지 않았으며 반복적인 진단 과정에서 결핵이 배제된 환자가 3명이었다. 대상 환자는 흉막 생검및 흉수의 ADA 활성도를 포함한 기존의 진단 방법과 PCR을 시행하였다. PCR의 target은 Mycobacterium tuberculosis의 특이성을 갖으며 한 개체내에 여러번 반복하여 존재한다고 알려져 있는 DNA인, IS6110 gene의 일부인 123 base pair DNA로 하였고, 그 결과를 기존의 진단 결과와 비교하였다. 결과: 1) 배양한 결핵균 및 비결핵성 Mycobacterium을 이용한 PCR의 강수성은 DNA 1 fg까지였고, Mycobacterium tuberculosis와 Mycobacterium bovis에만 특이적이었다. 2) 확진된 흉막액을 이용한 PCR의 감수성은 80.0%(16/20)였고, 특이성은 95.0%(19/20)였다. 3) 결핵이 확진되지 않았으나 임상적으로 결핵으로 의심하여 항결핵제제를 투여한 후 호전된 환자중 60.0%에서 PCR 양성을 나타내었다. 4) 결핵이 확진되지 않았으나 임상적으로 결핵으로 의심하여 항결핵제제를 투여한 환자중 호전되지 않고 추후 결핵이 배제된 환자 3명 모두에서 PCR 음성을 나타내었다. 5) 흉막액의 ADA 활성도는 확진된 결핵성 흉막염 환자군과 임상적으로 결핵이 의심되어 항결핵제 투여후 호전된 군이 여타군보다 유의하게 높았고, PCR 결과와 좋은 상관관계를 보였다. 결론 : PCR은 결핵성 흉막염의 진단에 매우 예민하고 특이적이었으며, ADA와의 좋은 상관 관계를 보였다. 따라서 PCR을 이용한 진단 방법을 추가함으로써 결핵성 흉막염의 진단에 도움을 줄 수 있을 것으로 사료되었다.