• Journal of Microbiology and Biotechnology
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• 제20권12호
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• pp.1653-1663
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• 2010

The first gene (${\alpha}$-gal1) encoding an extracellular ${\alpha}$-Dgalactosidase from the thermophilic fungus Talaromyces emersonii was cloned and characterized. The ${\alpha}$-gal1 gene consisted of an open reading frame of 1,792 base pairs interrupted by six introns that encoded a mature protein of 452 amino acids, including a 24 amino acid secretory signal sequence. The translated protein had highest identity with other fungal ${\alpha}$-galactosidases belonging to glycosyl hydrolase family 27. The ${\alpha}$-gal1 gene was overexpressed as a secretory protein with an N-terminal histidine tag in the methylotrophic yeast Pichia pastoris. Recombinant ${\alpha}$-Gal1 was secreted into the culture medium as a monomeric glycoprotein with a maximal yield of 10.75 mg/l and purified to homogeneity using Hisbinding nickel-agarose affinity chromatography. The purified enzyme was maximally active at $70^{\circ}C$, pH 4.5, and lost no activity over 10 days at $50^{\circ}C$. ${\alpha}$-Gal1 followed Michaelis-Menten kinetics ($V_{max}\;of\;240.3{\mu}M/min/mg,\;K_m\;of\;0.294 mM$) and was inhibited competitively by galactose ($K_m{^{obs}}$ of 0.57 mM, $K_i$ of 2.77 mM). The recombinant T. emersonii ${\alpha}$-galactosidase displayed broad substrate preference, being active on both oligo- and polymeric substrates, yet had strict specificity for the ${\alpha}$-galactosidic linkage. Owing to its substrate preference and noteworthy stability, ${\alpha}$-Gal1 is of particular interest for possible biotechnological applications involving the processing of plant materials.

• 한국유기농업학회지
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• 제12권4호
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• pp.451-461
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• 2004

In an animals, identification system has been widely used by ear tag with dummy code and blood typing for parernity. Also, genotyping methods were using for useful mean of individual identification for live animals. In the case of genotyping estimation of gene in population of korean native chicken. In this study, we tested for development of genetic markers used it possible to determination of individual identification system. The candidate genetic markers were used already bow 10 of microstalite DNA sequence information in chromosome No. 1 and 14. Result of analysis for genotyping, the number of alleles of those microstatelites DNA was shown minimal 3 to 12 and the heterozygote expression frequency range was shown from 0.617 to 0.862. In our result, effective number of allele for each microsatellites DNA was shown 3~7, and the accuracy of individual identification was shown nearly 100%, when used with 6 genetic marker. This study was about genotyping method for identification used specific genetic marker form microsatellite DNA in the brand marketing of korean native chicken. Our results suggest that genotyping method used specific genetic marker from microsatellite DNA might be very useful for determination of individual identification.

• Journal of Applied Biological Chemistry
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• 제65권4호
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• pp.383-386
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• 2022

Thermotoga maritima cellulose B 유전자의 The open reading frame (ORF)은 825 bp이고, cellulase B는 분자량이 약 31,732 kDa인 274개의 아미노산으로 구성되어 있다 이 중 N-말단의 17개 아미노산은 signal peptide로 추정된다. Signal peptide를 제외한 ORF를 pRSET 대장균 발현벡터에 삽입하여 pRBTmCelB를 제조하였다. 6-His tag을 포함하는 TmCelB 융합단백질의 cellulose 분해활성과 생화학적 특성을 분석하기 위해 pRBTmCelB를 대장균 BL21에서 과다발현하였고 순수분리하였다. TmCelB 융합단백질은 cellulose 분해활성을 나타내었고 이 있는 것으로 분석되었다. TmCelB 융합단백질은 약 95 ℃ 부근에서 가장 높은 효소 활성을 나타내었고, 100 ℃에서 최대 활성을 80% 이상 유지하는 것을 확인하였다. 또한 TmCelB 융합단백질은 약 pH 4.5 부근에서 최대 활성을 나타내었고, pH 4.0-6.0 범위에서 최대 활성을 60% 이상 유지하였다. TmCelB 융합단백질은 100 ℃에서 180분 후에도 효소활성을 80% 이상 유지하였다.

• 생명과학회지
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• 제24권4호
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• pp.343-351
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• 2014

Phosphoinositide 3-kinase (PI3K)는 항산화 제어반응, 심근세포 성장, 및 세포 내 특수반응 뿐만 아니라 세포분화, 생장, 운동, 식균 및 내항작용, 세포 골격유지에 관여하는 등 세포 신호체계에서 핵심 역할을 하는 효소이다. PI3K는 세 그룹으로 나누어지며 type I PI3K는 leukocyte에서 우선적으로 발현되고 G-proteins의 ${\beta}{\gamma}$ subunits에 의해서 활성화 된다. 본 연구에서는 넙치(Paralichthys olivaceus)의 $PI3K{\gamma}$를 암호화하는 cDNA를 클로닝하였다. 넙치의 $PI3K{\gamma}$는 1,341 bp 염기로 구성되는 한 개의 ORF를 가지며 이 단백질은 447 아미노산으로 구성되어있다. $PI3K{\gamma}$는 zebrafish의 $PI3K{\gamma}$와 89.6%, mouse와는 84.7%, Norway rat와는 84%, human의 $PI3K{\gamma}$와는 74.9%가 아미노산 상동성을 나타내었다. $PI3K{\gamma}$유전자의 대장균에서 발현을 위하여 pET-44a(+)-PI3K 재조합 DNA를 구축하여 대장균에서 발현시킨 결과 49 kDa의 재조합 단백질이 과발현 됨을 확인 할 수 있었다. His-tag affinity chromatography를 이용하여 $PI3K{\gamma}$단백질을 순순 분리하였으며 wortmannin을 이용하여 $PI3K{\gamma}$의 활성을 분석하였다.

• 한국어류학회지
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• 제18권2호
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• pp.65-77
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• 2006

우리나라 주요 담수 어종인 미꾸라지(Misgurnus mizolepis)를 실험 모델로 이용하여 실험적으로 설정한 고온 노출($32^{\circ}C$)에 특이적으로 반응하는 유전자들을 cDNA microarray 분석을 통해 탐색하였다. 미꾸라지 간조직 expressed sequence tag (EST) 데이터베이스 분석을 통해 1,124개의 unigene들을 선발하여 제작한 cDNA microarray을 이용하여 $23^{\circ}C$ 및 $32^{\circ}C$에 4주간 노출된 실험어의 간(liver)조직의 전사 발현 양상을 3반복 분석하였다. 다양한 유전자군이 $32^{\circ}C$ 고온 노출에 전사 발현의 증감 또는 감소 양상을 보였으며 $23^{\circ}C$에 비해 $32^{\circ}C$군에서 2배 이상의 발현 증가를 보인 클론들은 총 93종류로서 에너지 대사, 단백질 대사, 면역/항산화 기능, 세포골격 및 구조, 물질수송 및 세포 신호전달등에 관여하는 단백질들을 암호화하는 유전자들이었고 최대 15배 이상의 전사발현이 관찰되었다. 반면 고온 노출군에서 유의적인 발현 감소(50% 이하)를 보인 유전자들(n=85) 역시 탐색되어 상기 단백질 분류군외에 vitellogenin 전구체들 및 리보좀 단백질류에서 특이적인 전사활성의 저하가 관찰되었고, vitellogenin 유전자에서 가장 많은 mRNA 수준의 감소가 관찰되었다.

• 한국패류학회지
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• 제25권3호
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• pp.223-230
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• 2009

Metallothioneins (MTs) play a key role in metallic homeostasis and detoxification in most living organisms. In an attempt to study the biological functions and significance of MT in a snail, we cloned and partially characterized the MT gene from the left-handed snail, Physa acutawhich has been regarded as a potential biomonitering species for fresh water. The complete cDNA sequence of PaMT cDNA was identified from the expressed sequence tag (EST) sequencing project of Physa acuta. The coding region of 180 bp gives 60 amino acid residues including the initiation methionine and termination codon. Clustering and phylogenic analysis of PaMT with other MT amino acid sequences show that it has some identities to Helix pomatia (60%), Arianta arbustorum (58%), Perna viridis (49%), Mytilus edulis (49%), Bathymodiolus azoricus (49%), Bathymodiolus azoricus (48%) and Bathymodiolus sp. FD-2002 (48%). Time dependent induction for PaMT from P. acuta exposed with cadmium (50 ppb) indicated that PaMT was induced at 4-8 hr after exposure. It remains to further develop PaMTas a potential biomarker for water contamination in fresh water.

• 생명과학회지
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• 제15권6호
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• pp.916-922
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• 2005

E3 ligase로 알려진 Parkin은 protein quality control에서 중요한 역할을 할 뿐만 아니라, 이런 quality control system의 이상으로 나타나는 퇴행성 뇌질환에도 밀접한 연관성이었다. 이와 같이 생체의 필수적인 업무를 담당하는 Parkin의 기능을 생화학적 측면에서 연구하기 위해서는 고 순도의 단백질을 다량 정제할 수 있는 시스템이 필요하나, 아직까지 Parkin의 발현 양상과 정제법에 관한 연구가 미흡한 상태이다. 본 연구에서는 pCEX system을 이용하여 Parkin을 대장균에서 overexpression시켜 단일 스텝으로 정제할 수 있는 방법을 정립하였다. 저온의 배양조건에서 0.01 mM의 IPTC로 발현을 유도한 결과 $90\%$ 이상의 순도를 가지는 완전한 크기의 Parkin을 정제할 수 있었다. 또한, 여러 tag을 갖는 Parkin plasmid를 제작하였을 뿐만 아니라, 이들을 HEK293 세포에 transfection하여 Parkin의 발현 양상을 비교 분석하였다. 그 결과 Parkin의 N-말단에 pretense에 민감한 절단 부위가 존재한다는 사실을 확인하였다. 본 연구에서 정립한 Parkin 정제법과 포유류 세포에서 Parkin의 발현 양상에 대한 결과는 Parkin의 기질을 탐색하고,그들이 Parkin의 효소 활성 및 기능에 미치는 영향을 조사하기 위한 다양한 연구에 활용할 수 있을 것이다.

• Nuclear Medicine and Molecular Imaging
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• 제43권5호
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• pp.487-494
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• 2009

목적: 작은 크기의 재조합 단일사슬 항체는 빠른 혈중 제거율과 종양의 항체 집적율이 증가되는 등의 장점을 가지고 있다. 반면에 항체의 작은 크기는 방사성 또는 형광물질의 표지를 위한 킬레이터 결합에 중요한 아미노산 그룹의 감소를 의미하기도 한다. 본 연구에서는 단일사슬 lym-1 염기서열 C-말단에 lysine 아미노산 태그를 삽입하여 형광 물질의 직접표지 및 그 표지수율 증가를 확인하고자 하였다. 대상 및 방법: 대장균 pET-22b (+) 벡터에 재조합 된 lysine 삽입 단일사슬 lym-1유전자는 대장균 BL21 (DE3)에 형질전환하여 발현하였다. 생산된 lysine lym-1 항체는 Ni-NTA 컬럽과 분자량 컬럼을 사용해 정제하였고. 단백질 전기 영동과 western blot을 통해 확인하였다. lysine lym-1 항체에 방사성 동위원소인 I-124, I-125, I-131 과 Tc-99m를 표지하여 그 수율을 확인하였으며 유세포계측기를 사용해 형광물질인 FITC가 직접표지된 라이신 lym-1 항체의 면역반응성을 사람의 버킷 림프종 세포주인 Raji 세포주에서 면역반응성을 확인하였다. 결과 Lysine도입 단일사슬 lym-1 항체는 두 과정의 정제를 통하여 획득하였으며 그 크기는 약 48 KDa이었고, 방사성동위원소인 I-124, I-125, I-131과 Tc-99m의 표지수율은 각각 >99%, >99%, >95%, >99%로 확인되었다. 유세포계측을 통한 lysine 도입 단일사슬 lym-1항체의 면역반응성은 기존의 단일사슬 lym-1항체와 유사함을 확인하였다. 결론: 재조합 lym-1 항체에 형광 물질을 직접 표지하기 위한 lysine 아미노산의 도입은 항체의 면역반응성 감소를 최소화 시키면서 직접표지 수율을 증가시킬 수 있는 유용한 방법임을 확인하였다.

• Journal of Plant Biotechnology
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• 제35권3호
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• pp.177-183
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• 2008

본 연구는 동진벼 유래의 Ac/Ds 삽입변이집단의 GUS 분석을 통하여 뿌리 및 미숙종자에서 강하게 GUS가 발현한 개체를 선발하여 FST(flanking sequence tag) 분석 한 결과 Ds 전이 인자가 3번 염색체 zinc finger RING-H2 관련 Oszinc626 유전자의 첫 번째 exon 부위에 single copy로 삽입되어 있었으며, 선발변이체는 뿌리 및 종자 발달이 정상인 동진벼에 비해 매우 낮은 것으로 나타났다. Oszinc626 유전자는 RING-H2 type(C3-H2-C3)으로 $Cys-X_2-Cys-X_{28}-Cys-X-His-X_2-His-X_2-Cys-X_{14}-Cys-X_2-Cys$ 배열이 C-terminus 가장 말단에 위치하며, 49 kDa의 분자량을 가지고 있다. 또한 Southern blot 분석에서 Oszinc626 유전자는 벼 게놈상에 single copy로 존재하였다. RT-PCR을 통한 돌연변이 유전자의 발현분석 결과 250 mM의 염과, $4^{\circ}C$ 저온등과 같은abiotic stress에 의해 발현이 증가함을 보였고, 호르몬처리에 있어서 ABA와 IAA의 식물호르몬을 처리했을 경우 24시간까지 계속해서 발현양이 증가하는 것을 보이는 반면, 2,4-D 처리의 경우 30분 후에 발현이 일시적으로 증가되었으나 이후 발현이 급속히 감소한 것을 보였다. 벼의 조직 별 발현 검정에서 미성숙한 종자, 뿌리 분열조직 및 신초 등 주로 생장점 부위에서 강하게 발현되는 것을 보임에 따라 Oszinc626 유전자의 경우 식물의 생장에 관여하는 주동 유전자의 하나로 판단된다.

• 생명과학회지
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• 제28권12호
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• pp.1416-1423
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• 2018

Biotin에 강한 결합 친화력($K_D=10^{-14}M$)과 함께 streptavidin의 tetramer 특징은 VHH 항체를 streptavidin에 융합시키게 하여 biotinylated horseradish peroxidase를 사용하는ELISA 와Western blot analysis 등의 면역분석법에서 VHH 항체의 항원결합력을 증가시키는데 응용 가능하다. 이를 응용하기 위해 우리는 Streptomyces avidinii 염색체 DNA로부터 PCR을 통해 streptavidin유전자를 증폭하고 이를 green fluorescent protein항원에 특이적으로 결합하는 8B9 VHH 항체유전자에 융합시켰다. 대장균에서 수용성 융합단백질로 발현시키기 위해 pUC119 플라스미드에 기초한 발현시스템을 사용하였다. 즉 lacZ promoter를 사용하여 IPTG에 의해 단백질발현을 유도하게 하였으며, 아미노말단에 pelB leader를 두어 발현된 단백질의 periplasmic space로 이동하게 하여 수용성 단백질형태의 분비를 촉진하였으며 카르복시말단에 6개의 polyhistidine tags를 두어 $Ni^+$-NTA-agarose column을 사용하여 발현된 단백질을 정제하였다. Streptavidin이 biotin에 강하게 결합함으로 대장균에 독성을 나타냄에도 불구하고 본 수용성 융합단백질은 성공적으로 발현되었다. SDS-PAGE에서 가열하는 경우 변성되어 30.6 kDa를, 가열하지 않는 경우에는 자연 상태의 122.4 kDa을 나타내었다. 이는 8B9 VHH항체에 융합된 streptavidin moiety에 의해 monomer subunit가 비공유결합으로 tetramerization됨을 제시해준다. 또한 본 융합단백질은 ELISA와 Westernblot analysis에서 보여진 것처럼 parental streptavidin과 유사한 biotin결합력과 green fluorescent protein항원 결합력을 모두 나타내었다. 결론적으로 streptavidin에 융합된 8B9 VHH 항체형태의 융합단백질은 대장균에서 수용성 tetramer로 성공적으로 발현 및 정제되었으며 biotin과 green fluorescent protein 항원에 동시에 결합함으로써 tetrameric and bifunctional VHH 항체제조의 가능성을 제시해주었다.