생물반응기를 이용한 섬오갈피 부정근 배양시에 jasmonic acid를 농도별 (0, 0.01, 0.05, 0.1, 0.2, 0.4 mg/L)로 처리하여 부정근의 생장과 eleutheroside류 생산과의 관계를 조사하였다. Jasmonic acid 처리농도별 부정근의 생장은 무처리구에서 2.9 g Dry Weight/L로 가장 높았으며 jasmonic acid 농도가 증가할수록 부정근 생장은 감소하였다. 그러나 eleutheroside B와 E의 함량은 jasmonic acid 농도가 높을수록 증가하여 eleutheroside B는 0.4 mg/L처리구에서 $49.0{\mu}g/g\;DW$, eleutheroside E는 0.2 mg/L처리구에서 $64.7{\mu}g/g\;DW$로 가장 생산량이 많았다. 반면에 eleutheroside $E_1$은 무처리구에 $19.0{\mu}g/g\;DW$로 가장 생산량이 많았다. 배지 lL당 eleutheroside류의 총생산량은 0.01 mg/L처리구에서 $259.9{\mu}g/L$를 생산하여 가장 우수하였다. 0.01 mg/L의 jasmonic acid 처리 후 12일간 eleutheroside류의 함량을 조사한 결과 eleutheroside B는 jasmonic acid처리 후 감소하였으나, eleutheroside E는 처리 후 10일째, eleutheroside $E_1$은 처리 후 4일째 가장 많은 생산량을 보여 주었다.
오가피의 주요 성분으로 알려져 있는 eleutheroside B와 E 그리고 식물의 세포벽을 구성하는 ${\beta}$-glucan 함량을 강원도(A. senticosus), 충남(A. senticosus), 제주도(A. koreanum) 산지별 오가피의 뿌리, 줄기, 잎, 열매 부위별로 각각 분석한 결과, 충남 오가피는 eleutheroside B가 검출되지 않는 것에 반해 특이적으로 높은 eleutheroside E를 함유하고 있었으며, 제주도 산지 오가피는 뿌리, 줄기, 잎, 열매모든 부위에서 eleutheroside B와 E가 함께 검출되는 것으로 확인되었다. 서로 다른 산지에서 재배되었지만 지역과 품종에 상관없이 줄기 부위에 가장 많은 eleutheroside B와 E가 함유되어 있었으며, ${\beta}$-glucan 또한 강원도(7.46%), 충남(3.41%), 제주도(5.05%) 산지 오가피 모두 줄기 부위에 가장 많았다. 오가피는 같은 품종이더라도 재배지역에 따라 eleutheroside B와 E 그리고 ${\beta}$-glucan 함량에 차이를 보여주었고 산지와 품종에 상관없이 줄기 부위에 가장 많이 함유되어 있었다. 따라서 본 연구결과를 기초로 오가피 소재 제품을 만들기 위해서는 제품의 목적에 따라 산지 및 부위의 선택이 필요할 것으로 사료되며, 산지에 따른 유효성분 차이에 있어서 탐라오가피는 제주도 특산식물로 오가피를 이용한 제품개발 시 지표성분을 표준화하는데 있어서 용이할 것으로 판단된다.
탐라오갈피 나무의 수확시기와 부위에 따른 eleutheroside 함량의 변화를 분석하였다. 9월에 수확한 탐라오갈피 나무의 부위별 eleutheroside B의 함량은 줄기에서 549.2 ppm으로 가장 높았고, 뿌리 및 잎에서는 각각 483.2 ppm, 255.9 ppm으로 잎에서 가장 낮은 함량을 나타내었다. eleutheroside E도 줄기에서 653.1 ppm으로 뿌리보다 높았으며, 잎에서는 검출되지 않아 잎에는 eleutheroside E가 거의 함유되어 있지 않았다. 나무의 수령이 많아질수록 eleutheroside B와 eleutheroside E함량이 모두 많아졌으며, eleutheroside B 함량은 5년생이 567.3 ppm으로 1년생보다 약 1.6배 많았다.
본 연구에서는 효소적 생물전환을 이용하여 오가피의 생리활성 물질인 eleutheroside B와 E의 추출 함량을 증대시키는 방안을 모색하였다. 효율적인 열수추출 공정을 위해 줄기분말에 질량대비 가수를 한 결과 14배 가수를 선정하였다. 이후 줄기 분말에 다양한 가수분해 효소를 이용하여 처리한 결과 유효성분의 용출량을 증가시키는 효소로 Novozyme 33095, Viscozyme L을 선정하였다. 효소처리 시간별로 유효성분의 용출량을 비교한 결과 eleutheroside B와 E의 용출량은 가시오가피 줄기에 Novozyme 33095로 3시간 처리하였을 경우 eleutheroside B의 용출량이 대조구 대비 약 13%가 증가하였고, eleutheroside E의 용출량은 대조구 대 비 약 26%로 가장 많이 증가하였다. 효소처리 후 토종오가피와 가시오가피의 줄기의 효과적인 열수추출 조건을 확인해 본 결과 토종오가피를 $121^{\circ}C$에서 15분 동안 추출하였을 때 eleutheroside B의 추출 함량은 기존 열수추출 공정대비 약 7%가 증가하였고, eleutheroside E의 추출 함량은 약 17%가 유의적으로 증가하였다. 가시오가피 줄기를 $121^{\circ}C$에서 15분 동안 추출하였을 때 eleutheroside B의 추출 함량은 기존 열수추출 공정대비 약 25%가 유의적으로 증가하였고, eleutheroside E의 추출 함량은 약 29%가 유의적으로 증가하였다.
생물반응기를 이용한 가시오갈피 부정근 배양시에 jasmonic acid를 농도별 (0, 0.01, 0.05, 0.1, 03, 0.5 mg/L)로 처리하여 부정근의 생장과 eleutheroside류 생산과의 관계를 조사하였다. Jasmonic acid 처리농도별 부정근의 생장은 무처리구에서 4.6 g Dry weight (DW)/L로 가장 높았으며 jasmonic acid 농도가 증가할수록 부정근 생장은 감소하였다. 그러나 eleutheroside B와 E의 함량은 jasmonic acid 농도가 높을수록 증가하여 0.5 mg/L 처리구에서 각각 $476.3{\mu}g/g\;DW$, $676.0{\mu}g/g\;DW$로 생산량이 가장 많았다. 반면에 eleutheroside $E_1$은 0.01 mg/L 처리구에서 $46.1{\mu}g/g\;DW$로 생산량이 가장 많았다. 배지 1L당 eleutheroside류의 총생산량은 0.01 mg/L 처리구에서 $2468.6{\mu}g/L$를 생산하여 가장 우수하였다. 0.1 mg/L의 jasmonic acid 처리 후 10일간 eleutheroside류의 함량을 조사한 결과 eleutheroside B는 jasmonic acid처리 후 6일째, eleutheroside E는 처리 후 8일째, eleutheroside $E_1$은 처리 후 4일째 각각 가장 많은 생산량을 보여 주었다.
생물반응기를 이용한 가시오갈피 부정근 배양시에 methyl jasmonate를 농도별 (0, 5, 10, 20, 40 및 80 ${\mu}M$)로 처리하여 부정근의 생장과 eleutheroside류 생산과의 관계를 조사하였다. Methyl jasmonate 처리농도별 부정근의 생장은 무처리구에서 5.4 g dry weight(DW)/L로 가장 높았으며 methyl jasmonate 농도가 증가할수록 부정근 생장은 감소하였다. 그러나 eleutheroside B의 함량은 methyl jasmonate 농도가 높을수록 증가하여 40 ${\mu}M$ 처리구에서 각각 359.9 ${\mu}g$/g DW로 생산량이 가장 많았다. 반면에 eleutheroside E와 $E_1$은 10 ${\mu}M$ 처리구에서 각각 798.1 ${\mu}g$/g DW, 19.7 ${\mu}g$/g DW로 생산량이 가장 많았다. 배지 1 L당 eleutheroside류의 총생산량은 10 ${\mu}M$ 처리구에서 3818.1 ${\mu}g$/L를 생산하여 가장 우수하였다. 20 ${\mu}M$의 methyl jasmonate 처리 후 15일간 eleutheroside류의 함량을 조사한 결과 eleutheroside B는 methyl jasmonate처리 후 12일째, eleutheroside E는 처리 후 3일째, eleutheroside $E_1$은 처리 후 9일째 각각 가장 많은 생산량을 보여 주었다.
Reversed-phase high performance liquid chromatographic method was applied for the determination of eleutheroside B and E in the various Acanthopanax species collected In Korea. The stationary phase used was Zorbax 300 SB $C_{18}$ and a mobile phase program was used, which started at 6% acetonitrile for 2 min, and then a linear gradient was operated for the next 18 min to 17% acetonitrile at a flow rate of 1.0 ml/min. The column effluent was monitored at UV 210 nm. Identification was carried out by comparing the retention time and the LC/MS spectrum of each peak corresponding to eleutheroside B and E from sample with those of standards. In general, the contents of eleutheroside B and 1 in stems were higher than those In roots. Acanthopanax species could be classified into two groups based upon the contents of eleutheroside B and E: one group contains no or very little eleutheroside B and another contains both eleutheroside B and E.
Objective : For the standardization and quality control of eleutheroside E in Eleutherococcus species, HPLC analysis was performed and eleutherosdie E content was compared in 23 kinds of Eleutherococcus species collected from Korea and China. Methods : The content of eleutheroside E in stem bark of Eleutherococcus species collected from Korea and China were analyzed by HPLC. 0.5% phosphoric acid and acetonitrile was used as mobile solvent. Validation of HPLC analysis method was confirmed by analyzing specificity, linearity, precision and accuracy following ICH guideline. Results : Content of eleutheroside E was determined to be 1.0-1.6% and 0.5-0.8% in Korean and Chinese E. senticosus, respectively. Content of eleutheroside E in E. sessiliflorus was 0.7-1.1% and 0.2-0.4% respectively in Korean and Chinese origin. All calibration curves showed good linear regression. The method showed good precision and accuracy with intra-day and inter-day variations of 0.880-3.442% (RSD) and 0.606-3.328% (RSD), respectively, and average recovery was of 0.141-1.363% (RSD), for the eleutheroside E analyzed. Conclusion : These results might be used to establish a criterion of eleutheroside E in Eleutherococcus species.
탐라오가피를 이용하여 건강기능식품 개발 시 원료의 표준화를 위한 eleutheroside B, E 및 ${\beta}$-glucan의 함량 및 분석법 검증을 실시하였다. 분석법 검증결과, HPLC를 이용한 분석방법에서 표준용액의 피크유지시간과 탐라오가피 뿌리 및 줄기 추출물의 피크유지시간이 일치하였으며 동일한 spectrum을 나타내는 것으로 특이성을 확인하였다. Eleutheroside B와 E의 검량선은 각각 0.9997, 0.9999로 1에 가까운 높은 직선성을 보여주어 분석에 적합함을 알 수 있었다. Eleutheroside B와 E의 검출한계는 각각 $0.050{\mu}g/mL$, $0.025{\mu}g/mL$이었고 정량한계는 $0.250{\mu}g/mL$로 eleutheroside B와 E가 동일한 값으로 설정되었다. Eleutheroside B의 함량은 탐라오가피 뿌리 및 줄기에서 각각 $525.7{\pm}16.8$, $525.1{\pm}21.1{\mu}g/g$으로 큰 차이가 없었으며 eleutheroside E의 함량은 뿌리 및 줄기에서 각각 $1,315.3{\pm}22.7$, $1,037.5{\pm}22.2{\mu}g/g$으로 뿌리에 더 많은 eleutheroside E가 함유되어 있었다. 정밀도(RSD) 측정 결과, eleutheroside B와 E는 일간 정밀도에서 각각 1.4~5.0, 1.1~2.5%의 정밀도를 보여주었으며 일내 정밀도에서는 각각 2.8~2.9, 0.4~1.1%로 일간 정밀도보다 높은 정밀성을 나타내었다. 또한 eleutheroside B는 100.66~110.04%, eleutheroside E는 94.26~111.62% 범위의 회수율을 보여주어 실험방법에 대한 정확성을 검증하였다. ${\beta}$-Glucan 분석법 검증 결과, 100.03%의 회수율을 보였으며 분석오차는 2.33%로 높은 정확도를 보여주었고, 일간(inter-day) 정밀도는 1.32~5.67%이었으며 일내(intra-day) 정밀도는 8.01~11.76%의 정밀성을 나타내었다. 탐라오가피 줄기, 잎 및 열매의 ${\beta}$-glucan 함량은 각각 $5.32{\pm}0.38$, $4.34{\pm}0.32$, $3.71{\pm}0.22%$(w/w)로 줄기에 가장 많은 ${\beta}$-glucan이 함유되어 있는 것으로 확인되었다. 본 연구 결과, 지표성분인 eleutheroside B와 E의 HPLC를 이용한 동시분석 방법과 ${\beta}$-glucan 분석방법이 적합한 분석방법임이 검증되었다.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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