해양으로부터 한천분해능이 뛰어난 균주를 한국의 서해(전남, 여천)으로부터 분리하여 Cytophaga sp.인 것으로 동정되었으며, 이 균주를 Cytophaga sp. AYK301이라 명명하였다. 균체성장과 효소 생산성 향상을 위한 탄소원의 영향을 단당 및 복합당류를 이용하여 살펴본 결과 본 균주는 agar기질을 사용하여 배양하였을 때 효소생산량이 가장 높은 것으로 확인되었으며, agar를 0.0~0.6%(w/v) 농도별로 첨가하여 효소생산능의 최적조건을 살펴보았다. 그 결과 0.2%(w/v) agar에서 최대효소활성을 나타내었다. 질소원의 영향은 유기질소원과 무기질소원으로 나누어 실험을 행하였는데 beef extract 0.3% (w/v), $NH_4NO_3$ 0.05%(w/v)에서 각각 최고의 효소활성을 나타내었다. 또한, 초기 pH의 영향에서 pH 7.5에서 효소활성이 가장 높게 나타났고, NaCl 농도의 영향에서는 7%(w/v)에서 가장 높은 효소활성을 나타내었으며, 각종 금속이온에 대한 효소활성은 거의 영향이 없는 것으로 확인되었다. 따라서, 본 연구에서는 최적배양조건하에서 플라스크로 배양한 결과, 231 units/L를 생한하여 기본배지를 이용하였을 때보다 약 4배 정도 효소활성이 증가하였음을 확인하였다.
군부에서 분리한 한천 분해 균주의 최적 효소 생산 조건은 질소원으로 nutrient broth, yeast extract를 각각 0.3%, 0.2%였고, 탄소원으로는 agar 0.5%가 가장 적절한 조건이었다. NaCI 농도는 2.0 % %, pH 7.0, 온도는 $30{\pm}2^{\circ}C$, 의 조건에서 약 96시간 배양하는 것이 가장 적절한 효소 생산 조건이었다. 분리균주의 생리, 생화학 특성을 조사한 결과, 그랑 음성 간균으로 gold-yellow colony를 형성하는 균 으로 oxidase, catalase 생성의 호기성균이었다. 각종 유기산류, 아미노산류 및 당류의 이용성 시험에 서 citrate, lactate, salicine, histidine, glucose, melibiose, sucrose에 대해 양성을 나타내었고, chitin, casein, gelatin을 분해하고, indole 및 H2S 를 생성하지 않았다. 이상의 결과로부터 본 균주는 Cytophaga sp.로 동정되었다.
국내의 무지개송어, 금붕어, 은어양식장에서 아가미와 지느러미의 부식과 괴사를 나타내는 물고기로부터 균주를 분리하여 형태학적, 생화학적, 항원적시험 그리고 전기영동을 통하여 분리주와 미국과 일본에서 분리된 표준주(NCMB $2248^T$, EK 28)의 성상을 비교하였다. 즉, 형태학적으로 cytophaga agar에서 강한 점착성, rhizoid 그리고 노랗고 편평한 집락을 나타내었으며 flexirubin type pigment를 산생하고 동종과 이종에 대한 항원적 시험에서도 응집역가는 1024, 512를 나타냈다. 비록 분리주는 각기 다른 어종에서 분리되었음에도 불구하고 형태학적, 생화학적 그리고 혈청학적인 특성에 있어서 미국과 일본에서 분리된 표준주와 유사하였다. SDS-PAGE에 의한 세포외막단백질(outer membrane proteins, OMPs)의 분석에서도 표준주와 gel pattern이 일치하는 형태를 나타내었다. 이상의 결과를 미루어볼 때 국내 무지개송어, 금붕어 및 은어양식장에서 분리된 균주들은 Cytophaga columnaris로 분리 동정할 수 있었다.
지느러미 부식과 체색변화를 나타내는 틸라피아 병어로부터 분리한 병원균의 성상은 다음과 같다. 1. 병어로부터 분리한 병원균은 Flexibacter clumnaris로 동정되었다. 2. 분리한 병원균액으로 인위감염시켰을 때 전형적인 columnaris병 증상을 나타냈다. 3. 병원균은 kanamycin, tetracycline, amikacin 등에서 높은 감수성을 나타냈으나, sulfa제에서는 거의 감수성을 나타내지 않았다. 4. $2\%$ 이상 식염이나 $50\%$이상 해수를 함유한 cytophaga배지에서 병원균은 자라지 못했다. 5. 증류수 대신 $50\%$ 이상 해수를 함유한 Cytophaga배지에 병원균을 접종시킨 후 1시간만에 약 11에서 $10^6/ml$에서 $10^4ml$로 균수가 감소했는 데 반하여, $5\%$ 이상 식염을 함유한 cytophaga 배지에서는 접종 후 1시간만에 균수가 약 $10^5/ml$에서 10/ml 이하로 급격히 감소했다.
Agar degrading enzyme-agarase-was purified from the culture fluid of Cytophaga so/ ACLJ-18, by acetone precipitation, DEAE-Cellulose, Sephadex G-100 and CM-Sephadex C25 column chromatographies. The molecular weight of purified agarase was estimated to be 24,700 dalton by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis. The optimum pH and temperature for agarase activity were 7.0 and 40$^{\circ}C$, respectively. this agarase was stable in the pH range of 6.5 - 8.0 and 40$^{\circ}C$, and required 0.35M NaCl for optimum activity. And this agarase was inhibited by metal ions such as Ba2+, Cu2+, Co2+, Mn2+, Hg2+, Zn2+, and showed specificity on agar.
A newly designed Cytophaga-Flavobacteria-specific 16S rRNA gene primer pair was employed to investigate the CF community structure in the Bering Sea, revealing a previously unknown and unexpected high CF diversity in this high latitude cold sea. In total, 56 clones were sequenced and 50 unique CF 16 rRNA gene fragments were obtained, clustering into 16 CF subgroups, including nine cosmopolitan subgroups, five psychrophilic subgroups, and two putatively autochthonous subgroups. The majority of sequences (82%) were closely related to uncultured CF species and could not be classified into known CF genera, indicating the presence of a large number of so-far uncultivated CF species in the Bering Sea.
소양호에서 수온, 엽록소$\alpha$, pH 그리고 DOC의 농도가 세균군집에 미치는 영향을 파악하였다. 이 연구에서는 fluorescent in situ hybridization(FISH) 방법을 사용하기 1998년 4월부터 5월까지 세균군집구조를 조사하였고 이 시기 환경요인과 세균군집간의 상관성 분석을 실시하기 위해 수온, 엽록체$\alpha$, pH, DOC의 측정도 함께 수행하였다. 또한 환경요인과 세균군집간의 상관성 분석을 실시하기 위해 통계프로그램(SPSS)을 이용하였다. 그 결과 소양호에서 DOC, 엽록체$\alpha$, pH와 온도가 다중선형희귀직선상 설명가능정도가 약 43~58%정도로 나타났으며, 세균군집변화의 약 50%정도가 본 조사 이외의 환경요인에 영향을 받은 것으로 나타났다. $\alpha$-group은 DOC가 증가할수록 감소하여 DOC와 음의 상관관계를 보였고 , ${\gamma}$-group은 엽록소 $\alpha$농도와 음의 상관관계를 나타내었다. $\beta$-Cytophaga-Flavobacterium group 의 경우 수온과 뚜렷한 양의 상관성이 있는 것으로 나타났다. 또한 $\alpha$-group과 Cytophaga-Flavobacterium group은 pH와 양의 상관관계를 보였다. 이처럼 소양호의 세균군집은 계절에 따른 여러 가지 수 환경요인의 변화에 의해 다양하게 변화하였다.
An extracellular chitinase-producing bacterial strain induced by colloidal chitin was isolated from sea sand and was identified to be a member of the genus Cytophaga. The chitinase was purified successively by 30-60% ammonium sulfate fractionation, and DEAE-Bio gel A column, Octyl-Sepharose CL-4B column, and DEAE-Bio gel A column chromatographies. The enzyme had a molecular mass of 59.75 kDa, and the amino terminal amino acid sequence was ATPNAPVISW MPTDXXLQNXS. The enzyme acted better on colloidal chitin as a substrate than on chitosan. For colloidal chitin and chitosan (Degree of Acetylation, 15-25%), $K_{cat}$ values were 0.60U/mg and 0.08U/mg, respectively. HPLC analysis of the enzymatic reaction products showed that the chitinase produced mostly N-acetyl-D-glucosarnine and di-N-acetylchitobiose. The optimum temperature and pH for the enzyme were $50^{\circ}C$ and 4.0, respectively. N-Bromosuccinimide and $Hg^{2+}$ inhibited the chitinase activity as much as 90%, and $Sb^{3+}$, diethylpyrocarbonate, and $Ag^{+}$ inhibited it by 50-70%.
팔당호에서 fluorescent in situ hybridization(FISH) 방법을 이용하여 aggregates에 부착한 세균군집의 변화를 조사하였다. 조사대상은 Eubacteria에 속하는 세균과 Class Proteobacteria에 속하는 세균중 $\alpha$-, $\beta$-, $\gamma$ -group과 Cytophaga-Flavobacterium group이었고, 환경요인의 변화를 파악하고자 영양염류와 엽록소 a를 측정하였다. Aggregate와 물시료의 조사항목을 비교하면, TN의 경우 5~15배, TP는 81~140배, 엽록소 a는 49~66배로 aggregate가 높게 나타났으며, 총 세균수 역시 물시료에서 전체적으로 1.0~$2.0{\times}10^6$cells.$ml^{-1}$이었고, aggregates 부착세균에서 0.2~~$3.6{\times}10^8$cells.$ml^{-1}$의 범위로 물시료보다는 aggregates에 부착한 세균의 밀도가 200배 높았다. 또 수심별로는 5m trap 보다 20m trap에서 더 많은 수가 측정되었다. 총 세균수에 대한 세균군집구조의 비율은 부유세균의 경우 $\alpha$-group이 4.5~8.3%, $\beta$-group이 2.2~8.0%, ${\gamma}$-group이 2.1~7.4%, Cytophaga-Flavobacterium group이 2.1~6.1% 'Other'group은 0.1~2.5로 매우 낮았으나 aggregate에 부착한 세균의 군집구조는 $\alpha$-, $\beta$-, $\gamma$-group과 Cytophaga-Flavobacterium group이 아닌 'Other'group이 약 10.2~32.1%로 우점하는 경향을 보였다. 이처럼 팔당호에서 aggregates에 부착한 세균의 군집구조는 부유세균과 비교해볼 때 독특한 군집구조를 나타내었다.
겨울철 소양호에서 세균 군집 구조를 파악하고자 총세균수와 EUB338, ALF1b, BET4a, GAM42a와 CF probe 등 fluorescent rRNA targeted oligonucleotide probe 와 반응하는 세균 개체수를 수심별로 측정하였다. 총세균수는 $0.7{\times}10^6{\sim}1.1{\times}10^6cell{\cdot}ml^{-1}$이였으며, 5 m와 10 m 수층에서 높게 나타났다. 총세균수에 대한 Eubacteria의 비율은 34~90%이였으며, 5 m와 10 m에서 낮게 나타났다. Proteobacteria ${\alpha}$-group은 Eubacteria의 10.8-28.7%, ${\beta}$-group은 4.5-53.5%, ${\gamma}$-group은 4.9-35.5%, 그리고 Cytophaga-Flavobacterium group은 6.1-21.1%이였다. 0-5 m 수심에서는 ${\beta}$-group이 28.6-53.5%로 우점하고 있었으며, 10 m에서는 ${\gamma}$-group이 35.5%로 우점하였다. 30, 50 m 수심에서는 ${\alpha}$-group과 Cytophaga-Flavobacterium group이 우점하였다. 세균 군집 구조로 보면 0-2 m, 5-10 m 그리고 30-50 m의 3개층은 각각 독특한 특징을 나타내었다. 이 방법으로 호수 생태계에 대한 새로운 정보를 얻을 수 있었다.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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