Fu, Teng;Lee, Noh-Hyun;Shin, Jong-Hwan;Kim, Kyoung Su
The Plant Pathology Journal
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제38권4호
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pp.345-354
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2022
NADPH oxidase (Nox) complexes are known to play essential roles in differentiation and proliferation of many filamentous fungi. However, the functions of Noxs have not been elucidated in Colletotrichum species. Therefore, we set out to characterize the roles of Nox enzymes and their regulators in Colletotrichum scovillei, which causes serious anthracnose disease on pepper fruits in temperate and subtropical and temperate region. In this study, we generated targeted deletion mutants for CsNox1, CsNox2, CsNoxR, and CsNoxD via homologous recombination. All deletion mutants were normal in mycelial growth, conidiation, conidial germination, and appressorium formation, suggesting that CsNox1, CsNox2, CsNoxR, and CsNoxD are not involved in those developmental processes. Notably, conidia of 𝜟Csnox2 and 𝜟Csnoxr, other than 𝜟Csnox1 and 𝜟Csnoxd, failed to cause anthracnose on intact pepper fruits. However, they still caused normal disease on wounded pepper fruits, suggesting that Csnox2 and CsnoxR are essential for penetration-related morphogenesis in C. scovillei. Further observation proved that 𝜟Csnox2 and 𝜟Csnoxr were unable to form penetration peg, while they fully developed appressoria, revealing that defect of anthracnose development by 𝜟Csnox2 and 𝜟Csnoxr resulted from failure in penetration peg formation. Our results suggest that CsNox2 and CsNoxR are critical for appressorium-mediated penetration in C. scovillei-pepper fruit pathosystem, which provides insight into understanding roles of Nox genes in anthracnose disease development.
국내 사과산지 4개처에서 푸른곰팡이 병균 Penicillium expansum을 분리하여 각종 살균제에 대한 반응을 조사하였다. 일반적으로 균의 약제내성은 지역간에 차이가 적었으며 약제의 종류 및 농도에 의한 차이는 컸고 봄균주가 자랄 수 없는 고농도에서도 가을균주는 생장하였다. 균사생장에 대한 살균제의 $ED_{50}$ 및 $0.1{\mu}g\~41.7{\mu}g/ml$ 및 $100{\mu}g\~2,250{\mu}g/ml$로서 저장고 및 과수원에서 분리한 균의 억제효과가 높고 균의 내성이 낮았으며, captafol, captan, iprodione, mancozeb이 $2.6{\mu}g\~750{\mu}g/ml$ 및 $638{\mu}g\~40,500{\mu}g/ml$로서 약효 및 균의 내성이 중도였고, chlorothalonil folpet, oxidong, propineb, triademefon이 $27.8{\mu}g\~8,354{\mu}g/ml$ 및 $2,625{\mu}g\~150,357{\mu}g/ml$로서 효과가 낮고 균의 내성이 높았다. 포자형성 억제효과는 균사생장 억제효과와 같은 경향을 보였으며 포자발아 억제효과는 ployoxin 및 triademefon을 제외하고는 반대의 경향을 보였다.
본 시험은 오이 양액재배시 배양액내 규산칼륨($K_{2}SiO_{3}$) 처리에 의한 흰가루병 방제여부를 검토하기 위하여 규산 칼륨($K_{2}SiO_{3}$, $25{\sim}27%$의 $SiO_{2}$ Kanto)을 0.85 mM(50 $mg{\cdot}L-^{-1}$), 1.7 mM(100 $mg{\cdot}L-^{-1}$) 및 3.4 mM(200 $mg{\cdot}L-^{-1}$)의 농도로 배양액에 처리하고 1.7 mM, 8.5 mM, 17 mM 및 34 mM의 농도로 엽면살포하였다. 생육중기(정식 51일)에 규산 3.4 mM 배양액 처리구는 흰가루병 병반면적율이 2.3%로 0.95 mM 처리구의 38.3%에 비해 현저히 억제되었다. 그러나 1.7 mM과 3.4 mM 처리간에는 현저한 차이가 없었다. 배양액내 규산의 농도를 0.05 mM에서 4.10 mM까지 증가시켰을 때 잎당 병반수, 병반면적 및 발아관 길이는 규산의 농도 증가에 따라 감소하였다. 규산을 처리한 잎에서의 분생포자 발아율은 처리농도가 높아질수록 현저하게 감소하였으며, 저농도 처리구(1.40 mM 이하)에서는 $14.7%{\sim}20.3%$, 고농도처리구(1.85 mM 이상)에서는 $9.0%{\sim}12.4%$였다. 2% 물한천 배지에서의 농도시험에서는 발아율이 $1.1%{\sim}2.0%$로 일정한 경향을 나타내지 않았다. 규산칼륨을 17 mM의 농도로 희석하여 엽면살포한 결과 무처리에 비하여 흰가루병 발생이 현저히 억제되었으며, 방제효과 지속기간은 병원균 접종후 4일까지였다.
국내(國內) 주요(主要) 사과산지(産地) 4개처(個處)에서 저장중(貯藏中) 부패과(腐敗果) 및 수확전(收穫前) 과수원(果樹園) 이병과(罹病果)에서 Alternaria mali를 분리(分離)하여 각종(各種) 살균제(殺菌劑)를 가용(加用)한 PSA배지상(培地上)에 배양(培養)하여 균(菌)의 내성(耐性)을 조사(調査)한 결과(結果)는 다음과 같다. 지역별(地域別) 및 계절별(季節別) 균주간(菌株間)에는 약제내성(藥劑耐性) 차이(差異)가 적었으며, 살균제(殺菌劑)의 종류(種類) 및 농도(濃度)에 따른 차이(差異)는 컸다. Chlorothalonil 및 captafol의 균생육(菌生育)에 대(對)한 MIC 는 각각(各各) 100,238 및 $81,000{\mu}g/ml$ 이상(以上)으로서 효과(效果)가 가장 낮았으며 균(菌)의 내성(耐性)이 가장 높았다. lprodione 및 folpet의 MIC는 각각(各各) 3,825 및 $3,000{\mu}g/ml$ 이상(以上)으로 중도(中度)의 효과(效果)를 보였으며 균(菌)의 내성(耐性)도 중도(中度)였다. polyoxin의 MIC는 $900{\mu}g/ml$로서 효과(效果)가 높았으나 이는 권장농도(勸奬濃度)의 9배(倍)로서 균(菌)의 내성(耐性)이 약간(若干) 발생(發生)한 경향(傾向)을 보였다. polydong 및 oxidong 의 MIC 는 각각(各各) 500 및 $1,000{\mu}g/ml$ 이하(以下)로서 효과(效果)가 가장 높았으며 권장농도(勸奬濃度) 이하(以下)에서 균생육(菌生育)을 억제(抑制)하였으므로 현재(現在)로서는 농가(農家) 과수원(果樹園)에서 균(菌)의 내성(耐性)이 가장 낮았다. 공시(供試) 살균제(殺菌劑) 7종(種)에 대(對)한 사과 반점(斑點) 낙엽병균(落葉病菌)의 균사생장(菌絲生長), 포자형성(胞子形成) 및 포자발아(胞子發芽)는 같은 경향(傾向)의 반응(反應)을 보였다.
동충하초속균은 곤충기생균으로 충체내에 균핵을 형성하며 단일 또는 총생의 stroma에 자낭각을 형성하는 균이다. 채집된 동충하초균은 Cordyceps militaris, C. nutans, C. sphecocephala, Isaria japonica와 Torrubiella sp. 등 5종이었다. 채집된 동충하초의 분리를 위하여 동충하초의 자실체를 샤레 뚜껑에 tape로 고정시킨 후 water agar가 들은 샤레에 짝을 맞추어 놓으면 자낭포자가 떨어지며 3시간 후 발아한 포자를 PDA에 이식하여 분리하였다. C. nutans와 C. militaris의 균사생장이 가장 우수한 배지는 Hamada media이며 complete media와 감자한천배지에서도 균사생장이 좋은 것으로 나타났다. 탄소원으로는 Mannose와 C. militaris와 C. nutans가 균사생장이 양호하였고 질소원으로는 glutamic acid에서 C. militaris가 asparagine에서는 C. nutans가 균사생장이 양호하였다. Vitamine은 Thiamine-HCI, Biotine, Nicotinic acid 모두 C. militaris와 C. nutans의 균사생장에 비슷하였다. C. nutans의 분생포자를 접종하였을 때 배추흰나비 유충, 노린재, 멸강나방, 배추좀나방은 살충력이 높았고, 메뚜기는 50%, 잣나무넓적잎벌은 12%의 살충력이 있으나 진딧물과 오리나무잎벌에서는 살충력이 없었다. C. nutans는 노린재에서만 채집되나 다른 곤충에도 살충효과가 인정되었다. 쌀가루 5g, 밀가루 5g에 물을 100ml을 넣고 배양한 것이 균사생장과 자실체 형성은 잘 되었으나 형성된 자실체는 완전한 동충하초가 아니고 분생포자의 덩어리라는 것이 현미경에 의해 관찰되었다.
휴지상태에 있는 성숙한 도열병균 포자 1,000개를 관찰한 결과 각 세포에 단핵을 가지는 포자비율이 $95\%$로 단연 많았고 또 미숙회자인 1세포 1핵 포자로부터 출발하여 3세포 3핵인 성숙포자가 형성됨을 관찰할 수 있었다. 분열 중인 핵은 배열된 염색체로서 관찰할 수 있었으며, 염색체수는 n=3,4,5,6개로 나타났으나, n=5개가 가장 많았다. 핵이 발아관으로 이동하는 방법은 첫째로 휴지상태에 있던 핵이 분열하여 2핵이 되고 그 중 1핵이 발아관에 이동하고 1핵은 세포내에 머무는 것과$(43\%)$, 둘째 방법은 핵분열 없이 직접 세포내의 1핵이 발아관을 따라 이동하는 것들이 $(57\%)$ 있다. 또 부착기내의 핵을 염색하여 관찰한 결과 무핵의 부착기가 상당히 많았으나 핵질을 가진 500개의 부착기 중에 단핵이 476개로서 $95.2\%$였다(Chromosome 으로 관찰된 4부착기는 제외). 이상의 결과로서 도열병균은 전생활환을 통하여 단핵을 함유한다는 것을 인정할 수 있으며, 도열병균포자가 다세포일지라도 Homokaryon이라고 생각되므로 단포자분리균을 도열병에 관한 모든 시험에 공시하는 것은 합당하다고 할 수 있다.
Aspergillus niger와 Penicillium notatum간의 lipase 우수 생성 종간 형질전환체를 획득하고, 유전분석과 정제를 통하여 다음과 같은 결과를 얻었다. P. notatum의 영양요구물을 확인하여 본 결과 Tyrosine 요구성임을 알 수 있었다. 핵전이를 위한 원형질체 형성 및 재생 조건에서는 Novozym 234의 농도 1%, 삼투안정제는 0.6M KCl, 효소의 처리시간은 180분 그리고 최적 pH는 5.8로 나타났다. 핵전이에 의한 형질전환의 빈도는 $1.3{\times}10^{-4}{\sim}3.8{\times}10^{-4}$으로 비교적 낮은 편이었다. 유전적 안정성, conidia의 크기, DNA 함량의 측정 그리고 핵염색의 결과 형질전환체의 핵형은 aneuploid로 추정되었다. 형질전환체의 lipase 활성은 모균주와 비교하여 $1.2{\sim}1.7$배 증가하였다.
Aspergillus niger 와 Penicillium verruculosum F-3 균주의 돌연변이체 선발은 ultraviolet (UV) 단일처리와 UV 및 N-methyl-N'-nitrosoguanidine(MNNG) 이중처리에 의해 얻었다. 원형질체 형성을 위한 최적조건으로는 pH 5.8, 상투압안정제로는 0.6 M KCI이 최적이었으며, A-niger 와 P. verruculosum 의 재생율은 각각 54.6%, 49.8% 로 나타났다. 핵전이에 의한 형질전환율은 $7{\times}10^{5}~1{\times}10^{5}$ 이었고, 형질전환체의 유전적 안정성은 4.5%~66.5%, conidia 의 크기와 DNA 함량의 측정결과 각각 $2.6{\pm}0.7{\sim}6.5{\pm}0.5{\mu}m$, 5.7~31.3 ${\mu}g/10^{8}$ condia 를 나타내어 aneuploid 로 추측되었다. 모균주와 형질전환체들간의 유전적 안정성과 효소 활성도를 비교하여 선발되 5 균주의 전제 수용성단백질의 전기영동양상은 차이가 있었으며, 동위효소의 양상은 모균주와 유사하지만 CMCase 의 경우 2 균주(TAPW15706, TAPW157-7), $\beta$-glucosidase 의 경우 5균주 (TAPW157-1, TAPW157-4, TAPW 157-5, TAPW157-6, TAPW157-7)에서 band 의 세기가 증가하였음을 관찰할 수 있었다.
Aspergillus nidulans에는 유성분화를 능동조절하는 nsdD, nsdC 그리고 veA의 3 유전자가 알려져 있다. 이들 유전자의 돌연변이들은 각각을 서로 교배한 이핵체에 cleistothecia를 형성하지 못하기 때문에 이중돌연변이의 분리가 어려웠다. 본 연구에서는 ${\Delta}nsdD$ 돌연변이가 저산소 및 저온조건에서 성숙한 cleistothecia를 형성하는 것을 이용하여 ${\Delta}nsdD$와 ${\Delta}veA$ 및 ${\Delta}nsdD$와 ${\Delta}nsdC$의 이중돌연변이를 분리하였다. 이중돌연변이의 형질을 분석한 결과 nsdD 유전자는 veA 또는 nsdC와 독립적으로 정단성장에 관여하는 것으로 보였다. 색소생성형질은 veA나 nsdC가 nsdD에 대해 상위에 있는 것으로 나타났으며, lactose가 탄소원인 액체배지에서 무성포자를 생성하는 형질이 이중돌연변이에도 보임에 따라 이 형질은 nsdC의 고유한 특성으로 사료된다.
잎절편법을 이용하여 오이 흰가루병(Sphaerorheca fusca)에 대한 10개 품종의 저항성을 평가하였다 완전히 전개된 오이 잎에서 직경 10mm의 절편를 잘라내어 benzimidazole을 혼합한 한천배지에 올려놓고 포자현탁액을 10$\mu$l씩 절편에 점접종법으로 실험하였다. 흰가루병의 분생자경은 $25^{\circ}C$에서 가장 잘 형성되었다. 제1본엽의 disk를 이용하여 분생포자형성정도를 측정해 흰가루병에 대한 오이의 저항성을 평가한 결과와 하우스 포장에서의 발병도 결과간에 고도의 정의 상관을 보였다(r=0.99$^{**}$ ). 이 결과들을 통해 잎절편법을 이용하여 오이 식물체의 흰가루병(S. fusca)에 대한 저항성을 평가할 수 있었다.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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