The anti-inflammatory effect of alginate oligosaccharides on LPS-induced RAW 264.7 cells was investigated at different time points (0-60 h). The alginate oligosaccharides were produced by an alginate-degrading enzyme from Shewanella oneidensis PKA1008. The alginate oligosaccharides decreased the production of nitric oxide and proinflammatory cytokines [tumor necrosis factor-${\alpha}$, interleukin (IL)-$1{\beta}$, and IL-6] in a dose-dependent manner. The alginate oligosaccharides showed peak anti-inflammatory activity after 36 h of incubation; at that time point, reduced protein expression of NF-${\kappa}B$ p65, iNOS, and COX-2 was detected. Furthermore, the alginate oligosaccharide treatment reduced the formation of ear edema at 36 h compared to samples examined at 0 h when the oligosaccharides were administered at 50 and 250 mg/kg body weight, as well as dermal thickness and mast cell numbers in a histological analysis. These results suggest that alginate oligosaccharides are a promising anti-inflammatory agent.
DEAE sephacel anion chromatography 및 SP sepharose cation chromatography에 의해 Streptomyces violaceoruber 유래 alginate lyase의 정제를 수행하여 비활성 14.59 units/mL 정제배율 40.64배를 나타내었다. Tricine SDS-PAGE에 의한 단일밴드를 확인하였고, 분자량은 23.3 kDa으로 결정되었다. 정제효소에 의해 sodium alginate를 가수분해하여 1차 activated carbon column chromatography와 2차 bio gel P-2 gel filtration에 의해 당가수분해물을 분리 회수하여 TLC와 FACE를 통해 중합도를 확인하고 Timell's method에 의해 hetero type M/G-oligosaccharide 중합도 6, 8로 결정되었다. B. animalis, B. bifidum, B. breve, B. infantis, B. longum와 L. acidophilus, L. casei, L. reuteri에 생육활성에 대한 중합도 6, 8의 영향을 검토하기 위하여 modified-MRS media에 탄소원으로 중합도 6, 8를 대체하여 생육활성을 비교한 결과 B. longum에서는 D.P. 6 M/G-oligosaccharide를 탄소원으로 대체한 경우 표준 MRS배지와 비교하여 4.25배, D.P. 8에서 6.44배의 상대활성을 나타내어 가장 우수한 생육활성을 나타내었으며, B. bifidum의 경우에서도 D.P. 6에서 3.27배, D.P. 8에서 5.4배의 상대활성을 나타내었다. 이외에도 B. animalis, B. breve그리고 L. casei에 있어서도 D.P. 8의 경우 3배의 상대활성을 나타내었으나, L. reuteri에 대한 D.P. 8의 경우에서는 표준 MRS media와 비교하여 0.29배로 감소하였다. 결과적으로 D.P. 8의 올리고당이 D.P. 6의 올리고당보다 생육활성에 크게 기여하는 것으로 나타났다.
유기산을 이용한 알긴산의 분해 및 올리고당화 조건을 검색한 결과, 유기산 종류와 농도에 관계없이 $100^{\circ}C$ 이하의 온도 조건은 알긴산을 올리고당으로 분해하는데는 적절하지 못하였다. 반면, $110^{\circ}C$와 $120^{\circ}C$ 조건은 유기산 종류와 농도에 따라 다소의 차이는 있었으나 올리고당화할 수 있는 조건이었으며, 마이크로파 처리나 초음파 처리와 같은 물리적 가열 처리 방법은 알긴산 분해에 효과적인 방법이 아닌 것으로 확인되었다. 분해율의 측면에서 최적 분해 조건은 citrate나 malate로 $120^{\circ}C$에서 120분 가압가열처리하는 조건이었으나, TLC 상에서 $110^{\circ}C$에서는 $3\~4$개, $120^{\circ}C$ 처리 조건은 $7\~8$개의 올리고당 획분이 확인되었다. 이상의 결과로 미루어 보아 유기산을 이용한 알긴산 올리고당 생산은 $0.5\%$ citrate를 이용하여 $120^{\circ}C$에서 90분 동안 가압가열처리하는 것이 최적의 조건이었다.
6종류의 알긴산을 기질로하여 효소 반응을 시켜 알긴산 올리고당 제조를 시도한 결과, 실험에 사용한 효소의 경우 G-rich block에만 특이하게 작용하는 guluronate lyase 일종으로 G-block에 주로 작용하여 올리고당을 생성하는 것으로 확인되었다. 또한 4종류의 시판 알긴산중에서도 1종(Wako Co.)의 Na-alginate에 대해서 특이하게 6-7개의 올리고당 spot가 TLC에서 확인되었고, 그외 3종의 Na-alginate는 2-4개 정도의 올리고당 spot가 TLC에 나타났다. 6-7개의 spot가 확인된 Na-alginate(Wako Co.)를 기질로 대량 분해시킨 후 Sephadex G-25 및 Bio-gel p-2로 분획, 정제를 행하고 중합도를 측정하여 올리고당을 확인한 결과, 중합도가 각각 다른 4개의 올리고당을 확인할 수 있었다.
알긴산 올리고당은 생체에 다양한 생리활성효과를 나타내는 기능성 식품의 소재나 고부가가치 재료로서 활용 가능성이 높아 여러 응용 범위 내에서 사용될 수 있다. 알긴산은 해조류의 주요 구성성분으로 주로 갈조류에 많이 존재한다. 해조류로부터 다양하게 활용이 가능한 알긴산 올리고당을 제조하기 위해 Erwinia tasmaniensis 균주가 생성하는 효소를 이용하여 알긴산을 효소적으로 분해하고자 하였다. 따라서 본 연구에서는 E. tasmaniensis의 최적 배양조건과 균주가 생성해내는 알긴산 분해 효소의 성질 및 특성을 알아보았다. 실험 결과, 이 균주의 최적 배양을 위한 배지 내 알긴산의 최적 농도는 1.0%, 최적 시간은 36 h이었으며, 알긴산 분해 효소의 활성은 알긴산이 1.0% 포함된 배지에서 72 h동안 배양했을 때 가장 높았다. 이 효소의 최적 pH는 6.0, 최적 온도는 $20^{\circ}C$로 확인되었다. 또한 효소의 활성은 $20^{\circ}C$에서 60 min까지 지속됨을 확인했다.
To separate chitosanoligosaccharides easily by size exclusion, an coencapsulating technology of substrate and enzyme was developed. Chitosan and chitosanase were enveloped in this membrane and the product released to medium by size exclusion. The lower limit of the alginate concentration and the agitation speed were 0.5% and 40 rpm, respectively. Membrane thickness and capsules diameter were $10{\mu}m$ and approx. 3.0mm, 1.5mm, respectively. The molecular weight difference by concentration and cps of alginate were of little significance. And also, the molecular weight of distribution according to enzyme concentration was low concentration of enzyme produced high molecular weight of oligosaccharides. At 1.5mm size of capsule, product diffusion rate to outer part was higher than other capsules. The molecular weight distribution of the released oligosaccharides ranged from 1000 to 6000 Da.
This study investigated the characterization and functionality of Undaria pinnatifida root (UPT) extracts, degraded using a crude enzyme from Shewanella oneidensis PKA1008. To obtain the optimum degrading conditions, the UPT was mixed with alginate degrading enzymes from S. oneidensis PKA 1008 and was incubated at 30℃ for 0, 3, 6, 12, 24, and 48 h. The alginate degrading ability of these enzymes was then evaluated by measuring the reducing sugar, viscosity, pH and chromaticity. Enzymatic extract at 24 h revealed the highest alginate degrading ability and the lowest pH value. As the incubation time increased, the lightness (L ⁎) also decreased and was measured at its lowest value, 39.84, at 12 hours. The redness and yellowness increased gradually to 10.27 at 6 h and to 63.95 at 3 h, respectively. Moreover, the alginate oligosaccharides exhibited significant anti-inflammatory activity. These results indicate that a crude enzyme from S. oneidensis PKA 1008 can be used to enhance the polysaccharide degradation of UPT and the alginate oligosaccharides may also enhance the anti-inflammatory effect.
The research was purposed production of oligosaccharide from alginate hydrolysis the main composition in cell walls of sea weed. We was isolated 252 strains from sea water and mud flat, the highest alginate lyase activity was selected, and identified as Sanguibacter keddieii NC9 by 16S rDNA sequence analysis. In this study was select the sodium alginate concentration, pH, temperature for the production of alginate lyase activity. Alginate lyase activity was confirmed from plate assay with 10% cetylpyridinium chloride. The optimum culture conditions for the production of alginate lyase were sodium alginate 10 g/L, peptone 5 g/L, $40^{\circ}C$, pH 9 and 36 hours incubation time. Sanguibacter keddieii NC9, its alginate lyase would be useful for the production of bioenergy and biofunctional oligosaccharides from sea weed.
Calcium Alginate gel에 고정화된 Aureobasidium pullulans cell을 이용한 fructo-이igosaccharides 생산 반응메카니즘에 있어서 포도당, sucrose 및 fructo-oligosaccharides의 유효확산계수를 구하고, 반응메카니즘에 대한 수학적 모벨을 제안하였다. $770g/\ell$, $860g/\ell$ 의 고농도 당용액에서 이들의 유효확산계수는 $1.2-7.6\times10^{-7}\textrm{cm}^2$/s 범위로 매우 낮은 값을 보였고, 이 결과를 모댈식에서 적용하여 기질농도, bead 크기 및 첨가비율 등을 변화시키면서 실험적으로 검증해 본 결과 실험치와 모델식이 대체로 잘 일하였다.
To easily separate chitosanoligosaccharides by size exclusion, an coencapsulating technology of substrate and enzyme was developed. The membrane was composed of alginate and a divalent cation such as calcium. Chitosan and chitosanase were enveloped in this membrane and the product released to medium by size exclusion. The capsule was stabilized in a 2% acetic acid solution (pH 5.0) containing 0.145 M CaCO$_3$. The leakage of substrate caused by the agitation speed was controlled by increasing alginate and CaCO$_3$concentrations. The lower limit of the alginate concentration and the agitation speed were 0.5% and 49rpm, respectively. Membrane thickness and capsule diameter were 10$\mu\textrm{m}$ and 2.5mm, respectively. By TLC analysis, the composition of chitosanoligosaccharides were mainly 3-6 mers. The molecular weight distribution of the released oligosaccharides ranged from 262 to 3624 Da by GPC.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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