저분자 키토산과 저분자 알진산 나트륨을 삼산화황-피리딘 복합체와 황산화 반응시켜 황산화 키토산과 황산화 알진산 나트륨을 합성하였다. 황산화 반응에서 삼산화황-피리딘 복합체/다당류의 무게비율이 1:5일 때 황산화도가 각각 2.75와 2.53으로 가장 큰 값을 나타내었다. 합성한 황산화 키토산 및 황산화 알진산의 혈액에 대한 항응고 효과 및 활성트롬보 플라스틴 측정 시험을 행한 결과 분자량이 8.0${\times}$$10^3$ Da일 때 항응고 효과가 가장 우수하였고 황산화 키토산과 황산화 알진산 나트륨을 무게비율 1:1 로 혼합하였을 때 헤파린에 비하여 91% 정도로 항응고 활성이 가장 좋았다. 활성트롬보 플라스틴 측정시험에서도 황산화 키토산과 황산화 알진산 나트륨의 무게비율이 1:1일 경우에 항응고 활성이 헤파린에 비하여 84%로 가장 좋았다.
식품용 방부제로써의 가능성을 평가하기 위하여 염화나트륨, 아세트산, 젖산, 구연산이 포함된 배지를 사용하여 대장균 및 황색포도상구균에 대한 키토산의 항균성을 조사하였다. 키토산의 억제활성은 100 ppm의 키토산(분자량 3,000)이 포함된 배양배지에 염화나트륨을 첨가시킴으로써 미세하게 감소하였다. 반면, 아세트산, 젖산, 구연산 등은 세균의 성장에 대한 키토산의 억제활성을 증가시켰다. 이러한 결과는 염화나트륨, 아세트산, 젖산, 구연산과 같은 식품 첨가 성분이 키토산의 항균활성에 심각한 영향을 미칠 수 있다는 것을 보여준다.
본 연구에서 현미의 발아에 키토산을 활용함으로써 곰팡이 발생을 억제하고 기능성 생리활성 물질인 GABA의 생성을 증진시 킬 수 있음을 확인하였다. 100 ppm 키토산액에서 72시간 발아 는 현미파우더 그램당 1,035 nmole의 GABA를 보유하게 되어, 발아되지 않은 현미의 136 nmole, 불침종 발아 현미의 771 nmole, 100 ppm 젖산침종 발아 현미의 728 nmole GABA에 비하여 높은 것으로 조사었다. 발아에 의한 GABA 생성증진과 더불어 알라년의 생성증진 및 글루탐산, 아스파틱산, 세련의 함량 감소가 뚜렸하였다. 키토산처리에 의한 GABA의 생성 증진은 GABA 생성에 관여하는 글루탐산 탈탄산효소의 활성증진이 기여한 것 으로 조사되었다. 키토산액에서의 침종 발아는 물침종 발아나 젖산침종 발아에 비하여 곰팡의 발생빈도를 현저하게 낮추었다. 이들결과를 종합할 때 발아현미 제조시 키토산액을 사용하면 기 능성 물질인 GABA 함량이 증진되고 곰팡이등의 잡균의 오염을 줄힐 수 있어 양질의 발아현미를 얻을 수 있을 것으로 기대된다.
키토산을 10%-아세트산에 팽윤시킨 용액과 SD 를 인산염 완충용액에 녹인 용액을 흔합하여 키토산 매트릭스를 제조하였다. 키토산 매트릭스로부터 pH 7 7.4와 pH 1.2에서 약물방출 거통을 규명하고 지속적이고 조절된 약물방출형 제제로서의 사용 가능성 을 고찰하였다. 키토산 매트릭스내의 약물 함유량이 증가함에 따 라 약물 방출 시간이 늦어졌으며, pH 1.2에서보다 p pH 7.4에서 약물 방출 시간이 더 지연되었다. 그 이 유는 약물전달체가 엽기성 용액에서보다 산성 용액 에서 팽윤를 더 잘하기 때문이라고 생각된다. 약물 방출 속도에 있어서는 pH 7.4에서보다 pH 1.2에서 더 빨랐으며, 겉보기 방출속도상수(K)값도 역시 증가하였다. 결과적으로 본 실험에셔 약물전달체로 사 용된 키토산은 방출조절형 제제로서 그 가능성을 타진할 수 있었다.
새로운 Gly-His-Lys (약자로 GHK)가 결합된 키토산을 $N^{\alpha}-Fmoc$ 아미노산과 BOP 커플링 시약을 사용한 고상법에 의해 제조하였다. 이를 위해 키토산 마이크로 비드를 W/O 에멀젼 상분리법으로 평균 입자크기 70 마이크로미터로 얻었다. GHK 펩타이드는 순차적으로 고상법에 의해 키토산 마이크로비드 위에 커플링 하였다. 아미노산 분석을 실시한 결과 Gly, His, kys의 비율이 1.02:1.13:0.96의 비율로 나타나 이론치와 거의 일치함을 확인할 수 있었다. GHK 펩타이드가 결합된 마이크로비드의 세포증식 효과는 MTT 분석으로 측정하였다. 측정결과 GHK 펩타이드가 결합된 키토산 마이크로비드는 대조군인 펩타이드가 결합되지 않은 키토산 마이크로비드 자체에 비해 높은 세포증식 효과를 보였다.
본 연구에서 현미의 발아에 키토산을 활용함으로써 곰팡이 발생을 억제하고 기능성 생리활성 물질인 GABA의 생성을 증진시킬 수 있음을 확인하였다. 100 ppm 키토산액에서 72시간 발아는 현미파우더 그램당 1,035 nmole의 GABA를 보유하게 되어, 발아되지 않은 현미의 136 nmole, 물침종 발아 현미의 771 nmole, 100 ppm 젖산침종 발아 현미의 728 nmole GABA에 비하여 높은 것으로 조사었다. 발아에 의한 GABA 생성증진과 더불어 알라닌의 생성증진 및 글루탐산, 아스파틱산, 세린의 함량 감소가 뚜렸하였다. 키토산처리에 의한 GABA의 생성 증진은 GABA 생성에 관여하는 글루탐산 탈탄산효소의 활성증진이 기여한 것으로 조사되었다. 키토산액에서의 침종 발아는 물침종 발아나 젖산침종 발아에 비하여 곰팡의 발생빈도를 현저하게 낮추었다. 이들결과를 종합할 때 발아현미 제조시 키토산액을 사용하면 기능성 물질인 GABA 함량이 증진되고 곰팡이등의 잡균의 오염을 줄일 수 있어 양질의 발아현미를 얻을 수 있을 것으로 기대된다.
키토산으로부터 고중합도 키토산올리고당을 얻기 위해서, 해안가 갯벌토양 중에서 chitosan 분해활성이 강한 균주를 선발하였다. 선발된 균주를 Bergey's Manual of Systematic Bacteriology을 토대로 형태적, 생화학적 특성을 동정한 결과, 그람 양상, 간상 $(0.4-0.6{\times}1.6-2.2{\mu}m)$, catalase 양상, 운동성 양성이었으며 pH 4.5-11.0과 2% NaCl을 함유한 배지에서 성자하였고, $42^{\circ}C$ 이하에서 성장하였다. 이들 균주의 DNA를 PAPD PCR 분석하여 동정하였다. 이 결과를 종합하여, 가장 강한 내부가수분해를 보인 균주 P16을 Bacillus sp.로 잠정 분류하고 이를 최종적으로 Bacillus sp. P16으로 명명하였다. 이 균주의 배양 상등액은 키토산에 대해 강한 액화능을 보였으며, 키토산 용액의 점성을 신속히 감소시켰다. 이 균주가 생산하는 키토산분효소는 TLC, HPLC, viscometry 등의 분석결과를 보건대 중합도 2-7의 올리고당을 생산하는 endo-splitting type의 endochitosansane인 것으로 보였다.
Cellulase를 이용하여 키토산 올리고당을 제조하기 위한 최적조건을 반웅표면 분석법을 이용하여 설정하였다 키토산 분해능과 산업적 활용의 측면에서 유리한 Pen. funiculosum 유래의 cello-lase를 예비 실험을 통해 결정하였다. 이 효소의 적정 반응 조건에서 경시적 키토산 분해율을 측정한 결과, 반응 10시간까지는 대수적 증가를 보였으나, 10시간 이후로는 완만한 분해율을 나타내었다. 중심합성계획에 의해 총 26개의 실험을 행한뒤 반응표면분석법으로 설정한 키토산 분해 최적 조건은 기질 농도 $0.5\%$에 대해 효소 농도 143(U), 반응 온도 $49^{\circ}$, 반응 시간 13.2hr및 pH는 3.8이었다. 본 연구에서 설정된 최적의 조건에서 얻어진 키토산 분해물은 dimer와 trimer가 주된 올리고당이었고, 소량의 tetramer와 hexamer 그리고 monomer 등의 총 8종 정도의 올리고당이 검출되었다.
본 연구에서는 유전자 전달체로 응용하기 위하여 다양한 분자량의 고순도 수용성 키토산 올리고당을 한외여과막을 이용하여 분급화 하였다. 분급화한 고순도 수용성 키토산 올리고당의 평균분자량과 분포를 측정하였고, 매우 좁은 분포를 갖는 것을 확인하였다. 고순도 수용성 키토산 올리고당의 분자량은 한외여과막에 따라 1에서 10 kDa의 범위를 가진다는 것을 젤크로마토그래피 측정을 통하여 확인하였다. 분급화된 키토산의 구조는 $^1H$ NMR과 FTIR을 통하여 구조를 확인하였고, UV를 통하여 탈아세틸화도를 측정한 결과 90% 이상의 높은 탈아세틸화도를 갖는다. 본 연구를 통하여 제조된 고순도 키토산 올리고당은 세포독성이 없고 아주 좁은 분자량 분포와 높은 순도를 갖고 있음을 확인하였다.
본 연구에서는 소목(Caesalpinia sappan L.) 분말을 활용한 모발 염색의 최적 조건을 결정하였고, 키토산 처리가 소목 분말의 모발 염색성에 미치는 영향을 조사하였다. 소목 분말의 혼합비율, 염색시간 및 온도에 따른 염색성을 확인한 결과 소목 분말과 물의 비율을 1:3(w/w)로 하여 40℃에서 60분 동안 처리하는 것이 모발 염색에 가장 효과적인 것으로 나타났다. 또한 키토산의 분자량, 처리 농도와 처리 순서가 소목 분말의 염색성에 미치는 영향을 확인한 결과 저분자량(~30 kDa)의 키토산을 1%(w/w)의 농도로 소목 분말 처리에 앞서 전처리를 하는 것이 염색성 향상 및 유지에 가장 효과적이었다. 결론적으로 모발 염색에 있어서 저분자량의 키토산은 매염제로서 소목 분말의 염색 효율과 유지력 향상에 크게 도움이 되는 것으로 판단된다.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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