• 생명과학회지
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• 제2권1호
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• pp.26-34
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• 1992

유전자 재조합 균주의 발효에 있어서 플라스미드의 안정성과 발효공정의 최적화에 대해 개략적으로 서술하였다. 클론된 DNA의 발현은 플라스미드의 안정성을 크게 저해하며, 저하된 플라스미드의 안정성은 재조합 균주의 생산성을 많이 떨어뜨린다. 최적 발효 조건은 각각의 숙주-벡터 시스템, 사용한 배지, 생성물 등에 따라 크게 변한다. 동일한 숙주-벡터 시스템의 경우도, 사용하는 배지에 따라 온도, 희석률 또는 성장속도에 의존하는 정도가 달라지고 또 최적값도 다 변한다. 또한 발효조건의 최적화가 균체 내 플라스미드의 자기복제,mRNA로의 전사, 단백질로의 translation, 더 나아가 미생물 전체의 생리와 밀접하게 관련이 있다.

• 미생물학회지
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• 제46권4호
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• pp.383-388
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• 2010

알칼리성 단백질 분해효소 고생산 돌연변이 균주 Vibrio metschnikovii L12-23, N4-8, KS1으로부터 알칼리성 단백질 분해효소를 암호화하는 vapK (Vibrio alkaline protease K) 유전자들을 PCR에 의하여 분리한 다음 DNA shuffling, error-prone PCR 방법과 같은 분자진화 기술을 통해 고활성 단백질 분해효소를 생산하는 재조합 V. metschnikovii 균주를 제작하였다. DNA shuffling 방법을 통해 변형시킨 vapK-1 유전자와 이 유전자를 주형으로 error-prone PCR 기법을 통해 재 변형된 vapK-2 유전자를 cloning한 후 V. metschnikovii KS1 균주에 역도입하여 재조합 균주를 제조하였다. 재조합 균주들의 단백질 분해 능력을 조사한 결과 vapK-2 유전자가 2 copy 도입된 재조합 균주의 경우 야생형 균주인 V. metschnikovii RH530에 비해 43.6배 높은 단백질 분해활성을 보였으며 숙주인 V. metschnikovii KS1에 비해 약 3.9배 향상된 단백질 분해 활성을 확인할 수 있었다. 변형된 vapK-1과 vapK-2 유전자를 야생형 vapK 유전자의 염기서열을 비교 분석한 결과 단백질 분해 능력의 활성에 영향을 미치는 active site를 제외한 부분에서 변화가 일어났음을 확인 할 수 있었다. 변형된 유전자 vapK-1을 two copy를 포함한 재조합 플라스미드를 가진 V. metschnikovii KS1을 30 L fermentor로 배양 하였을 때 배양 후 35 시간에 18,000 PU/ml의 활성을 보였으며, 이는 향후 산업용 균주로서 사용될 수 있는 가능성을 제시하였다.

• 한국지하수토양환경학회지:지하수토양환경
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• 제11권5호
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• pp.43-50
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• 2006

Bioreporter 균주는 복잡한 환경매체의 특정 오염원 탐지를 위해 유용하게 사용되고 있다. 특히 발광 유전자 재조합 균주는 민감하고 배경에 의한 영향을 받지 않는 장점이 있다. 사용한 유전자 재조합 균주(Pseudomonas putida mt-2 KG1206)는 TOL 플라즈미드와 pUCD615 벡터에 $P_{m}\;promoter$가 삽입된 재조합 플라즈미드를 함유하고 있으며, 톨루엔 계열 및 중요 분해산물에 대해 분해와 함께 발광을 생산하는 특성을 갖고 있다. 본 연구에서는 균주 동결 및 동결건조 준비 및 적용과정에 필요한 다양한 조건들을 조사하여, 향후 환경매체에 적용하기 위한 최적 방법에 대한 프로토콜을 작성하였다. 조사한 최적 조건들은 다음과 같다. 동결보호시약(24% sucrose), 동결건조 시간(12시간), 균주 농도($OD_{600}=0.6$), 동결균주 활성회복($35^{\circ}C$에서 빠르게 해동), 동결건조 균주 활성회복(LB배지에 $3{\sim}6$시간 노출), 현장 운반 조건(활성 회복 후 $20^{\circ}C$ 정도의 실온). 본 연구 결과는 재조합 균주 환경 적용을 위해 필요한 균주 동결 및 동결 건조에 대한 중요한 자료들을 제시하고 있다.

• 대한환경공학회지
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• 제31권2호
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• pp.147-152
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• 2009

본 연구에서는 톨루엔 계열 화합물로 오염된 환경에 대해 고정화한 유전자 재조합 균주 KG1206의 적용 가능성에 대해 조사하였다. 재조합 균주 KG1206은 직접 유도제인 m-toluate, benzoate 뿐만 아니라 톨루엔, 자일렌 이성질체가 간접 유도제로서 발광 활성을 나타낸다. 연구에 의해 결정된 고정화 프로토콜의 최적 조건은 다음과 같다: 균주 농도(1 : 1 (v/v)), 오염원 용액(인산염 완충액), 발광 측정에 필요한 비드 수(4개), 5가지 오염원에 대한 최대 발광 활성은 일반적으로 m-toluate > p-xylene > 톨루엔 > o-xylene > m-xylene 순으로 나타났다. 생물발광과 오염원 감소는 HPLC로 확인하였으며, 고정 균주에 의해 초기 5 mM m-toluate는 5시간 배양 후 약 48%의 감소율을 나타내었으며 계속 분해되는 경향이 관찰되었다. 알긴산 균주 고정화에 대한 본 연구 결과는 톨루엔 계열 화합물을 함유한 석유계 탄화수소에 오염된 특정 환경을 생물학적 모니터링에 유용한 방법으로 사용할 수 있을 것이다.

• 한국미생물·생명공학회지
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• 제26권5호
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• pp.400-405
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• 1998

본 연구는 B. lactofermentum에서 ddh유전자의 증폭이 lysine 생성량에 미치는 영향을 조사하기 위하여, 먼저 E. coli-B. lactofermentum shuttle vector pEB1 및 pEB2를 제조하였으며, 제조된 shuttle vector에 ddh 유전자를 ligation하여 재조합 plasmid pRK1 및 pRK2를 구축하였다. B. lactofermentum에서 ddh 유전자를 증폭시키기 위하여 재조합 plasmld를 B. lactofermentum으로 도입하여 DDH 활성을 측정한 결과 대조균보다 7배 정도 증가하였다. 또한 lysine 생성량의 비교 분석에서는 재조합 plasmid를 함유한 균주의 경우 48시간 이후부터 control 균주보다 lysine 생성량이 증가하기 시작하여 72시간 때에는 최대치를 나타내었으며 그 이후는 오히려 감소하였다. 최대치를 나타낸 72시간 때의 lysine 생성량은 대조균주가 4.30∼4.38 g/l를 나타내었으며 pRK1 및 pRK2를 함유한 균주는 각각 5.34 g/l 및 5.07 g/l이었다. 이상의 결과로 미루어 볼 때 ddh유전자의 증폭에 의한 B. lactofermentum의 lysine 생성량은 대조균주에 비하여 18∼20% 정도 증가하였다.

• 한국미생물·생명공학회지
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• 제17권5호
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• pp.454-460
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• 1989

자연계로부터 분리한 Gram 음성세균과 함께 유전자 조작기법으로 kanamycin (Km)과 chloramphenicol (Cm)에 대한 내성유전자를 재조합한 균주들에서 그 내성유전자의 전이율을 conjugation 방법으로 몇 가지 상이한 수질환경에서 비교 연구하였다. 자연계로부터 분리한 DK1 균주와 재조합한 DKC601이나 DKH103을 donor로 하고 recipient 및 기타 조건을 같게 했을 때, donor가 가지고 있던 Km$^{${\gamma}$}$ 유전자의 전이율은 자연환경의 하천수에서 보다 실험실 환경의 멸균한 하폐수에서 더 높았고, 실험실 환경에서는 멸균한 하폐수보다 Luria-Bertani (LB) 액체배지에서 휠씬 높았다. 온도를 2$0^{\circ}C$와 3$0^{\circ}C$로 했을 때에는 어느 종류의 균주를 donor로 사용하더라도 전이율에는 큰 차이가 없었으나, 전이가 일어나는 시간은 3$0^{\circ}C$에서 조금 빨랐다. 하천수의 자연환경에서나 실험실이 멸균하폐수에서는 항생제내성유전자의 전이율은 두 가지 종류의 균주 사이에 차이가 거의 없거나 재조합된 균주에서 $10^{-1}$ 정도로 낮다. 그러나 실험실 환경의 LB액체배지에서는 전이가 일어나는데 필요한 반응시간이 재조합된 균주에서 더 길 뿐만 아니라, 전이율에 있어서도 $10^{-3}$ - $10^{-4}$ 정도 낮았다. 그리고 MT1 균주를 recipient로 하고 재조합된 균주인 DKC601과 DKH103을 donor 로 했을 경우에는 donor에 따라 전이율의 차이가 없었으나, DKC601을 donor로 하고 MT1과 MT2을 각각 recipient로 했을 경우에는 recipient에 따라 전이율이 $10^{1}$ - $10^{2}$ 정도 차이가 났다.

• KSBB Journal
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• 제15권2호
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• pp.174-180
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• 2000

본 연구에서는 다른 host cell 에 비하여 여러 가지 장점을 가지고 있는 Methylotrophic yeast 중 Pichia pastoris와 Hans-enula polymorpha의 fed batch 실험을 통하여 유전자 재조합 단백질 발현최적조건을 구하여 각 균주의 유전자 재조합 albumin 발현 최적화 연구를 수행하였다. 글리세롤이 두 균주의 promoter의 AOX 1과 MOX promoter repression에 미치는 영향을 확인한 바 H. polymorpha가 P. pastoris보다 promoter repression이 심함을 알 수 있었다. 두 균주의 promoter를 induction시키는 최적 메탄올 농도는 P. pastoris의 경우 메탄올 8g/L, H. polymorpha의 경우는 13 g/L임을 알 수 있었다. 또한 메탄올에 의한 induction시기는 두 균주 모두 O.D. 4 정도되는 exponential growth stage에서 메탄올을 첨가하는 경우가 초기 세포 성장단계에 메탄올을 첨가한 경우에 비해 약 20% 정도 높아짐을 확인하였다. 두 균주의 재조합 albumin 발현에 미치는 pH의 영향을 조사하였는데, p. pastoris의 경우 pH 5에서 가장 높은 albumin 생산성을 보여 약 300mg/L albumin을 발현하였고, H. polymorpha 의 경우 pH 5와 6에서 최대 약 180 mg/L의 albumin을 발현하였지만 pH 8에서는 이의 절반 수준에 그쳤다. 두 균주의 최적 fed-batch 방법을 확인하는 실험을 수행하였는데 P. pastoris의 경우의 최적 fed-batch 방법은 mixed feeding은 바람직하지 않고 글리세롤 배지를 공급하여 세포를 성장시킨 후 글리세롤 공급을 멈추고 바로 메탄올로 전환하는 방법을 효과적이며, H. polymorpha의 경우 비성장속도 제어를 통한 글리세롤 공급으로부터 메탄올 공급으로의 단계적 전환방법이 균주의 albumin 발현에 큰 영향을 준다는 것을 알 수 있었다. 이 방법을 통하여 두 균주의 고농도 배양 실험을 수행한 결과 P. pastoris의 경우는 O.D. 300에서 약 4.7g albumin/L를 발현하였다. 이와같은 결과를 바탕으로 산업체에서 methlotrophic yeast를 이용한 상업화를 계획함에 있어서 host로서의 균주를 선택할 수 있는 기본 자료를 제공함과 아울러 균주가 선택된 후에 그 균주를 이용한 재조합 단백질 최적화 방법을 제공하여 줄 것으로 생각된다.

• 약학회지
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• 제29권6호
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• pp.137-146
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• 1985

본고에서는 빌효산물을 개발하는 초기단계에서 발효학이 관여하여야 할 분야를 고찰함에 있어 종래방법에 비해 Rec.DNA기술에 의해 개발균주를 이용할 때 공통점과 아울러 차이점등을 살펴보기로 한다.

• 미생물학회지
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• 제28권3호
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• pp.192-198
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• 1990

플라스미드 pKM101과 이의 돌연변이제 pSLA의 mutator 유전자를 subcloning하여 재조합 플라스미드 pJB200과 pJB210을 선별하였고, umuC36- uvrA6-(TK 610) 균주에 도입하여 UV와 MMS에 대해서 보호효과와 돌연변이율에 미치는 영향을 조사하였다. 재조합된 플라스마드는 UV와 MMS에 대해서 nonmutability인 umu- 균주에서 완전히 돌연변이율을 회복시켰고 보호효과를 크게 증가시켰다. 이 사실은 muc 유전자가 cloning된 재조합 플라스미드가 돌연변이원의 처리에 의해 효과적인 발현을 하며, muc 유전자 만으로도 pKM101의 기능을 나타낸다는 것을 확인하였고, pSLA의 muc 유전자가 그 효과에 었어서 높은 영향을 미쳤다. 또한 pKM101의 muc gene을 포함한 pJB210 은 recA - (JC2926) 균주에서 돌연변이 유발능에 영향을 미치지 못한 것은 muc 유전자가 recA 유전자에 의존함을 알 수 있었다.

• 미생물학회지
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• 제52권2호
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• pp.220-225
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• 2016

쌀 전분을 원료로 효모를 직접 이용하여 항산화제 glutathione(GSH)이 풍부한 알코올 음료를 제조할 목적으로 GSH 함량과 당화능을 증진시키기 위하여 Saccharomyces cerevisiae의 ${\gamma}$-glutamylcysteine synthetase 유전자(GSH1), Debaryomyces occidentalis의 glucoamylase 유전자(GAM1), 그리고 ${\alpha}$-amylase 유전자(AMY)를 청주 효모 S. cerevisiae에서 공동 발현시켰다. 재조합 청주 효모의 세포외 GSH 함량은 원균주에 비해 1.5배 증가하였다. 2% (w/v) 쌀 전분이 함유된 배지에서 배양하였을 때 GAM1과 AMY 유전자 모두 발현하는 효모 균주의 glucoamylase에 의한 당화능은 GAM1유전자만 발현하는 균주와 비교하여 2배 증가하였다. 이 새로운 균주는 쌀 전분이 20%(w/v) 함유된 배지에서 7일간 발효를 통해 에탄올 11% (v/v)를 생산하였고, 전분 함유량의 90% 이상을 소비하였다.