최소 배지에 여러 아미노산과 대사 산물을 첨가하여 배양시킨 Serratia marcescens ATCC 25419 세포추출물에서여 biodegradative threonine dehydratase (BDTD), biosynthetic threonine dehydratase (BSTD)와 acetolactate syntase (ALS)의 비활성도를 조사하였다. S. marcescens BDTD와 ALS는 낮은 농도 (0.5-2 mM)의 cAMP에 의해 촉진적 조절을 받으며, 비교적 낮은 농도의 isoleucine (1-4 mM)에 의해서는 S. marcescens BSTD의 생합성이 증가되고 높은 농도의 isoleucine (10-30 mM)에서는 감소되고 비교적 낮은 농도의 valine (2-4 mM)에 의해서 S. marcescens ALS의 생합성이 증가되는 것으로 보아 S. marcescens ATCC 25419에서 branched chain 아미노산 생합성 과정의 조절 양상은 Escherichia coli K-12와는 달리, isoleucine의 생합성 과정은 BSTD에 의해 조절되고, valine의 생합성 과정은 ALS에 의해 조절되는 것으로 사료된다.
방선균은 필라멘트 형태를 띤 대표적인 그램 양성 세균으로서, 다양한 자연환경에 존재하는 대표적인 토양 미생물이다. 방성균이 항생제를 포함한 다양한 구조의 많은 유용 생리활성물질을 생성하며, 이들의 생합성 시기가 세포의 배양상태 및 생장속도와관련이 있다는것은 이미 주지의 사살이다. 비록 방선균은 액체 배양 시에는 정체기((stationary phase)나 낮은 생장속도하에서만 항생제를 생성하며, 고체 배양 시에는 aerial mycelia 로 형태적분화(morphological differentiation)를 시작함과 동시에 생합성을 시작한다고 알려져 있으나, 각 방선균 및 항생제의 종류에 따른 특징적인 조절 기작은 매우 다양한 것으로 알려져 있다. 따라서 특징적인 조절 기작은 매우 다양한것으로 알려져 있다. 따라서 본 총성레서는 항생제 생합성이 조절되는 기작을 지금까지 밝혀진 방선균의 여러 생리적 인자 및 생합성 조절 유전자를 중심으로 정리해 보고자 한다. 항생제 생합성에 관하여 다양한 생리적 인자와 조절 유전자의 특정 및 이들의 상호관계에 대한 종합적인 이해는, 방선균 유래 항생제 조절 기작의 체계적인 규명뿐만 아니라, 방선균을 이용한 유용 생리활성물질의 생산성 향상에도 응용될수 있다는 점에서 매우 중요하다.
국내에서 선멸된 Streptomyces sp. 809-11 균주의 항생물질 polyoxins의 생합성 능력을 향상시키기 위하여 주요 영양원에 따른 균체의 중식 및 polyoxins 의 생합성에 미치는 영향을 조사하였다. 본 실험결 과 가용성 전분만을 사용한 배지에서는 초기 대수척 성장기의 균체량은 증가하였으나 polyoxins의 생합 성량은 적게 나타났으며, 포도당만을 이용한 경우는 사상균사체의 형성을 증가시켜 polyoxins의 생합성 량을 증가시켰으나 초기 균체의 성장률은 매우 저조 하였다. 따라서 균체의 성장과 polyoxins의 생합성 향상 두 가지 측면을 모두 고려하여 볼 때 탄소원 으로 가용성 전분과 포도탕을 혼용하여 사용하는 것이 바람직한 것으로 나타났다. 질소원으로 사용한 $(NH_2)_4S0_4$는 비교적 고놓도인 151.4mM에서 최대 항생제 생합성량을 보여주었으며, 인산염으로 사용된 $K_2HPO_4$는 0.5mM 정도에서 최적의 poly oxms 생합성을 보여 주였다. 유가식배양을 도입하 여 초기에는 균체 성장을 위하여 전분과 포도탕이 함유된 배지에서 배양하였고, 탄소원의 고갈시점에 는 사상 균사체의 분화 촉진을 위하여 포도당을 공 급한 결과 polyoxins의 생합성량을 회분식 배양에 비하여 두 배 이상으로 증가시켰다.
본 논문에서는 항생제의 생합성 및 내성 유전자에 대한 연구가 산업적으로 이용될 수 있는 길을 제시하기 위하여 첫째로는 이들 유전자를 이용하여 기존 항생제의 생산성을 높일 수 있는 방법과 둘째로는 항생제 생합성 유전자들을 이용한 새로운 물질의 창출에 대한 연구를 중심으로 살펴보고자 한다.
PHA 생합성에 관련된 기초 연구도 미생물학, 생화학, 그리고 분자생물학 각도에서 활발히 수행되어, 신규 PHA 생합성 미생물의 탐색, 대사경로 및 조절 mechanism의 규명, 그리고 물성이 개량된 각종 PHA 공중합체의 개발 연구가 활발히 이루어졌다. 특히 최근에는 recombinant DNA 기술을 이용한 각종 미생물 유래의 PHA 생합성 관련 유전자의 분리와 그 기능에 관한 연구가 활발히 수행되고 있고, 1988년 A. eutrophus의 PHB 생합성 관련 세개의 효소를 coding하는 유전자가 독일의 Steinbchel등(5), 미국의 Dennis 등(6), 그리고 Sinskey등(7,8)에 의해 거의 동시에 cloning되었으며, 이를 이용한 대사 경로 및 조절 기작에 관한 연구가 본격화 되었다. 또한 최근에는 재조합 균주를 이용한 PHA의 생산에 관한 연구도 활발히 진행되고 있으며, 이와 같은 최근의 연구 성과는 몇 편의 총설(9-12)에 잘 요약되어 있다.
새로운 노화방지 물질로 개발한 3-APPA가 노화에 의해 야기되는 여러 변화들, 특히 세포 증식, 유전자 수준 및 단백질 수준에서의 collagen의 생합성 변화, 면역조직화학염색을 이용한 collagen 생합성의 변화등을 세포배양 및 동물실험을 통하여 측정하였다. MTT assay를 이용한 인체 피부 섬유아세포의 증식 실험에서 3-APPA는 무처치군에 비교해서 최고 2배의 섬유아세포 증식 효능을 나타내었으며, $^3$[H]-proline incorporation 방법을 이용한 단층세포 배양 및 3차원 dermal equivalent 섬유아세포 배양에서 무처치군 및 vitamin C 처리군에 비해 최고 1.5배의 collagen 생합성 증가를 나타내었다. 그러나 type I alpha-procollagen mRNA expression에는 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다. H&E 염색을 이용한 hairless mice의 피부에 대한 형태학적 변화 및 type I pM procollagen antibody를 이용한 면역조직화학염색에서, 3-APPA는 collagen 생합성을 증가시키는 것으로 나타났다. 이상의 결과에서 3-APPA는 섬유아세포 배양 및 hairless mouse를 이용한 실험에서 피부 섬유아세포 증식을 촉진시키며 collagen 생합성을 증가시켜 피부노화를 억제 할 수 있는 물질임을 밝혔다.
자색고구마의 캘러스 배양에서 광의 조사가 안토시아닌 생합성에 미치는 효과를 실험하였다. 잎조직으로부터 자색캘러스는 $0.5\;{\mu}M$ 2,4-D가 첨가된 MS배지, 광조건에서 유도되었다. 광의 세기에 따른 효과는 암 조건에 비교하여 광조건에서 안토시아닌 생합성이 $2{\sim}3$배에 이르는 것으로 나타났으며, 약광 (3000 lux)에서 안토시아닌 생합성량이 높게 나타났다. 이러한 광 조사에 의한 안토시아닌 생합성의 촉진효과는 LED를 이용하며 실험한 결과에서 청색광을 2시간 처리한 경우 3000 lux의 백색광을 처리한 대구조에 비교하여 1.4배의 안토시아닌 생합성 향상효과를 나타냈다.
Saccharomyces cerevisiae의 class I 키틴생합성 효소인 Chsl의 활성측정법을 적용하여 Aspergillus nidulans의 영양균사에서 class I 키틴생합성 효소인 ChsC의 활성측정을 시도하였다. 그 결과, A. nidulans의 class I 키틴생합성효소도 효모류의 경우와 마찬가지로 트립신 처리에 의하여 활성화되는 효소전구체형태(zymogenic form)로 존재함을 알 수 있었다. 그리고 A. nidulans 야생형의 class I 키틴 생합성 효소활성은 트립신 처리에 의하여 6배 가량 증가되었다. 반면, chsC 유전자가 파괴된 돌연변이주는 트립신 처리에 의하여 효소활성이 증가되지 아니하였을 뿐만 아니라, 효소활성의 수준도 트립신을 처리하지 아니한 야생형의 class I 키틴생합성 효소활성과 거의 동일한 수준이었다. 따라서, 트립신을 처리하여 측정한A. nidulans 야생형의 class I 키틴생합성 효소활성 값에서 트립신을 처리하지 아니한 야생형의 class I 키틴생합성 효소활성을 제외한 값이 A. nidulans 야생형의 ChsC 효소활성임을 알았다. 이러한 조건을 토대로 영양균사 생장과정 동안 ChsC의 효소활성을 측정한 결과, chsC 유전자의 발현양상과 유사하게 액체배양상태의 영양균사가 무성분화능을 획득하는 시기로 알려진 시간대에 효소의 활성이 증가하였다. 이러한 결과는 이미 보고된 바와 같이 chs 유전자가 A. nidulans의 영양균사 생장에 관여함을 시사하고 있다.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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