• Tuberculosis and Respiratory Diseases
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• 제61권3호
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• pp.239-247
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• 2006

연구배경: Mycobacteria 배양액 여과 단백질은 결핵에 대한 세포성 면역반응 및 진단 연구에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 새로운 결핵균 특이 유전자를 클로닝하여 약 14-kDa의 결핵균 재조합 단백질(TB-14)을 분리 정제 한 뒤 전혈 배양(whole blood culture)을 통해 재조합 단백질 항원의 자극에 따른 IFN-${\gamma}$ 분비 유도를 PPD와 비교 측정하여 TB-14 단백질이 결핵균에 대한 숙주의 세포성 면역반응 유도에 어떤 역할을 하는 지를 알아보고자 하였다. 방 법: M. avium 배양 여과액에서 항혈청과 강하게 반응하는 하나의 M. avium 특이 단백질을 확인하여 아미노산 서열을 규명한 뒤 이 단백질과 높은 상동성을 나타내는 M. tuberculosis 유전자를 클로닝하여 다량의 결핵균 재조합 단백질(TB-14)을 분리 정제하였다. 재조합 단백질 TB-14에 대한 세포성 면역 반응 유도를 알아보기 위해 결핵 환자(9명), PPD 양성 정상인(7명) 및 PPD 음성 정상인(7명)들로부터 얻은 전혈(whole blood)를 RPMI로 희석한 뒤 $10{\mu}g$의 PPD와 TB-14 단백질로 48 시간 동안 자극하여 상층액에 분비된 IFN-${\gamma}$ 농도를 ELISA로 측정하였다. 결 과: 1. M. avium LR114F 균주의 배양 여과액 내에서 M. intracellulare 항혈청에 강하게 반응하는 새로운 M. avium 특이 단백질을 규명하여 아미노산 서열을 확인하였다. 2. M. avium 특이 단백질과 상동성을 보이는 M. tuberculosis 특이 재조합 단백질인 TB-14은 148개의 아미노산으로 구성되어 있고 30개의 아미노산으로 이루어진 signal peptides를 가지며 M. avium과 78%의 상동성을 보였다. 3. PPD 양성인의 전혈 배양에서 TB-14 단백질 항원으로 자극된 군에서 PPD로 자극된 군보다 월등히 높은 IFN-${\gamma}$ 분비를 나타내었다. 반면 결핵환자에서는 질환의 양상이나 치료 정도에 따라 IFN-${\gamma}$의 분비 양상이 일정하지 않았다. 결 론: 새로운 결핵균 특이 재조합 단백질 TB-14는 결핵에 대한 인체 내 세포성 면역반응 유도에 중요한 역할을 할 수 있는 단백질이라 생각되며 특히 PPD 양성자에서 높은 IFN-${\gamma}$의 분비 양상을 보여 정상인과 결핵 감염자의 감별진단에도 활용될 수 있으리라 생각된다. 또한 TB-14 단백질에 대한 항혈청을 제작하여 환자의 가검물에 분비되는 결핵균 특이 단백질을 탐색하는 결핵의 진단 연구에도 활용될 수 있을 것으로 사료된다.

• 한국양식학회:학술대회논문집
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• 한국양식학회 2003년도 추계학술발표대회 논문요약집
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• pp.21-21
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• 2003

경골어류의 뇌하수체에서는 두 종류의 생식선자극호르몬 (FSH, LH)이 생산되며, 이 호르몬들은 공통적인 α 쇄와 특이적인 β 쇄를 가진다. 연어과 어종들에서, FSH는 난황형성과 정자형성의 역할을 하며, LH는 배우자의 최종성숙을 조절한다. 냉수성 고유어종인 열목어 (Brachymystax lenok)의 멸종을 방지하고 종묘생산을 원활히 하기 위하여 먼저 열목어의 GTHα, FSHβ 및 LHβ 쇄를 cloning하여 염기서열을 결정하였다. 열목어 GTHα, FSHβ 및 LHβ의 cDNA는 산천어의 해당 cDNA와 높은 상동성 (각각 84, 95, 98%)을 보였다. 다음으로 기능적인 생식선자극호르몬을 제작하기 위해서 2개의 쇄를 single-strand로 연결하여 진핵세포를 숙주로하는 시스템에서 생식선자극호르몬을 생산할 수 있는 구조체인 FSHβ-GTHα (235 amino acids) 와 LHβ-GTHα (240 amino acids)를 각각 재조합하였다. 또한 각각의 융합단백질 생산용 구조체의 3'-말단에는 단백질추출이 용이하도록 histidine×6 구조를 첨가하였다. 이상의 단일쇄 FSH와 LH 유전자재조합 산물을 포유동물 유래의 세포 (CHO-K1)에 liposome chemical을 사용하여 유전자도입 후 세포에서 분비되는 단백질을 모니터링하였다. 배지를 부분정제한 후 SDS-PACE로 조사한 결과, LH 재조합 유전자를 도입한 후 48-60 시간째에 약 25 kDa의 단백질로서 관찰되었다. 현재 FSH 재조합 유전자에 대해서도 조사중이며, 향후 이를 재료로 하여 기능형 생식선자극호르몬을 생산하고 추출하기 위한 연구가 계속적으로 수행 될 것이다.

• 한국산학기술학회:학술대회논문집
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• 한국산학기술학회 2007년도 춘계학술발표논문집
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• pp.270-272
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• 2007

본 연구는 서산 6쪽 마늘로부터 완전장 유전자 은행의 제작과 이를 통해서 확보된 1,000여개 재조합 클론에 대한 염기서열 결과를 web-based database를 통한 상동성 분석으로 부터 서산 마늘의 발현 유전자에 대한 생물정보학적 분석에 관해 것이며 본 연구로 부터 마늘의 대표적 생리활성 물질인 allicin의 생성에 관여하는 효소인 allinase의 cDNA를 클로닝 및 완전 염기서열을 해석하였으며 allinase 유전자의 genomic structure 에 대한 일부의 결과를 확보하였다. 또한 다양한 생물종에서 연구 되어지고 있는 생리활성 단백질인 lectin 유전자 cDNA를 클로닝하여 완전 염기서멸을 분석하고, 6xHis Tag올 통한 재조합 단백질을 대장균에서 E.coli에서 발현시켰다.

• 미생물학회지
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• 제49권1호
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• pp.1-7
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• 2013

유전자 재조합체는 상동염색체간의 예정된 DNA 가닥 전이와 교환이 이루어지는 상동염색체 재조합 과정에 의하여 생성된다. 이 재조합 경로는 DNA 이중 가닥 절단(double-strand breaks, DSBs)에 의해서 개시되며, 전이 과정의 중간단계에서 DNA의 구조적 변이 중간체인 단일 가닥 침투(single-end invasions, SEIs)와 이중 홀리데이 접합(double-Holliday junctions, dHJs)이 형성되어 교차성(crossover, CO) 혹은 비교차성(non-crossover, NCO) 결과물이 만들어진다. 본 연구는 이중 가닥 절단, 단일 가닥 침투, 이중 홀리데이 접합과 같은 재조합 중간체와 재조합 결과물의 구조분석에 초점을 두고, 이를 출아효모에서 인위적으로 이중 가닥 절단을 발생시킬 수 있는 HIS4LEU2 "hot spot" 을 이용한 물리적 분석방법으로 감수분열 재조합 중간체를 규명하였다. 물리적 분석을 위하여 동조화 된 세포에 감수분열을 유도한 후 hot spot 자리를 인식하는 제한효소를 처리하면, 재조합 중간체를 형성하고 있는 DNA 단편들을 Southern 분석법을 통해 탐지 및 정량 할 수 있다. 본 연구는 이 시스템으로 감수분열에서 이중가닥 절단으로부터 기인하는 단일 가닥 침투, 이중 홀리데이 접합 그리고 교차성/비교차성 재조합체로 전이되는 DNA의 구조 다형을 분석할 수 있음을 제시한다.

• 생명과학회지
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• 제20권12호
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• pp.1743-1749
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• 2010

Edwardsiella tarda는 그람 음성의 장내세균과의 주요 어병세균으로 어류에 edwardsiellosis를 유발하는 전신감염성 병원체이다. 최근 병원성 세균의 외막 단백질들은 세균성 감염에 있어서 숙주와 반응하여 면역반응을 유도하는 것으로 여겨져 연구가 되고 있다. 일본의 연구팀은 어류에서 에드워드병의 원인체인 E. tarda의 37 kDa 단백질이 넙치에서 높은 항원성을 제시하는 것을 보고하였다. 또한 그 연구자들은 37 kDa 단백질의 N-말단 아미노산 서열이 GAPDH와 대응하는 것을 밝혔다. 본 연구에서는 다른 세균에서 알려진 N-말단 서열을 기반으로 primer를 제작하여 이에 상응하는 E. tarda DNA를 증폭하고 클로닝하였다. 이 DNA단편의 염기서열은 예상한 바와 같이 세균의 GAPDH유전자인 gapA와 높은 상동성이 있고, E. tarda GAPDH (etGAPDH)의 아미노산 서열은 다른 장내세균의 GAPDH와 70% 이상의 상동성을 보이는 것을 확인하였다. E. tarda의 외막단백질에 특이적으로 반응하는 항체를 이용하여 E. tarda의 GAPDH가 외막에 존재한다는 것을 증명하였고, gapA의 염기서열을 바탕으로하여 재조합 GAPDH를 과발현 시켰다. 과발현된 재조합단백질 GAPDH는 GAPDH 특이적인 항체를 제조하는데 사용되었고, 또한 넙치에 면역시켜 단일 단백질 백신으로서의 활용도를 모색하였다. 비록 재조합 GAPDH가 면역된 넙치에서 GAPDH에 특이적인 항체가 증가하였음에도 불구하고, E. tarda로 공격실험을 하였을 때 면역된 넙치의 생존율이 12.5%로 측정되어 면역된 그룹과 면역되지 않은 그룹간에 큰 차이가 없는 것이 확인되었다.

• 미생물학회지
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• 제36권3호
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• pp.187-191
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• 2000

장티푸스는 Salmonella typhi 에 의해 유발되는 장감염성 질환으로 사람과 동물에 공통되는 질병이다. 본 연구에서는 기 보고된Salmonella typhi KNH100의 염색체 DNA로부 터 방향족 아미노산의 생합성에 관여하는 효소인 3-dehydroquinate hydratase(3- dehydroquinate)를 암호화하는 aroD 유전자를 포함하는 약 3.2 kb의 Sal I 절편을 pSAL62 이라 명명하였다. 클로닝된 재조합 plasmid인 pSAL61에는 ATG 개시코돈과 TGA 종결코돈 을 포함하는 759 염기로 구성된 aroD 유전자가 위치하고 있었다. 또한 S. typhi Ty2, Shigella dysenteriae, 그리고 Escherichia coli 등 다른 장내 세균의 aroD 유전자와 상동성을 비교하여 본 결과 각각 90%, 72.7% 그리고 73%의 상동성을 나타내었다.

• 한국미생물·생명공학회지
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• 제40권4호
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• pp.296-302
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• 2012

국내 사찰에서 제조된 된장으로부터 내열성 ${\alpha}$-amylase 생산균으로 분리된 YB-1234는 형태적 특성, 생화학적 성질 및 16S rRNA 유전자 염기서열에 근거하여 Bacillus licheniformis로 동정되었다. B. licheniformis YB-1234의 ${\alpha}$-amylase 유전자를 클로닝하여 그 염기서열을 결정하였으며 그로부터 유추된 ${\alpha}$-amylase의 아미노산 서열은 glycosyl hydrolase family 13에 속하는 B. licheniformis의 내열성 ${\alpha}$-amylases와 매우 높은 상동성을 보였다. ${\alpha}$-Aamylase 유전자를 함유한 재조합 대장균과 B. licheniformis에 의해 각각 생산된 ${\alpha}$-amylase는 pH 6.0에서 최대활성을 보였으나, 최적 반응온도는 약간의 차이가 있었다. 또한 B. licheniformis로부터 ${\alpha}$-amylase는 재조합 대장균에서 생산된 효소보다 열안정성이 매우 높았다. 이들 효소에 의한 maltotetraose와 maltohexaose의 주된 가수분해산물로는 glucose, maltose 및 maltotriose가 관찰되었다.

• 미생물학회지
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• 제50권4호
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• pp.327-333
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• 2014

산성 배지에서 성장하며 mannanase를 생산하는 균으로 분리된 Bacillus sp. YB-1401과 B. amyloliquefaciens YB-1402로부터 mannanase 유전자를 각각 클로닝하고 그 염기서열을 분석한 결과 2개 유전자는 동일하게 360 아미노산으로 구성된 단백질을 코드하며 1,080 뉴클레오티드로 구성되어 있다. 아미노산 잔기 배열의 유사성을 분석한 결과 이들 mannanases는 서로 4개의 잔기가 다르며 glycosyl hydrolase family 26에 속하는 mannanase와 상동성이 높았다. 재조합 대장균이 생산하는 YB-1402 유래의 His-tagged mannanase (HtMAN1402)가 YB-1401 유래의 His-tagged mannanase (HtMAN1401)에 비해 열안정성과 산성 pH에서 안정성이 높았다. 특히 HtMAN1402는 pH 3.0에서 4시간 방치 후에도 약 50% 이상의 잔존활성을 보여 사료첨가용 효소로 사용되기에 적합한 특성을 보였다. 또한 이들 효소는 $Ca^{2+}$ 이온에 의해 열안정성이 증가하는 것으로 확인되었다.

• 한국잠사곤충학회지
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• 제52권1호
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• pp.45-51
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• 2014

면역 유도된 천잠(Antheraea yamamai) 유충에서 cecropin-A 유전자를 분리하였고 이 유전자를 Ay-CecA로 명명하였다. 전체 Ay-CecA cDNA 크기는 419 bp로 64개의 아미노산 잔기를 인코딩하는 195 bp ORF로 구성되어 있다. 천잠 CecA 유전자는 22개 잔기의 signal peptide, 4개 잔기의 propeptide 및 항균활성을 갖는 37개 잔기로 구성된 성숙 단백질(mature protein) 영역으로 구성되고 예상 분자량은 4046.81 Da으로 산출되었다. 천잠 CecA의 아미노산 서열은 다른 나비목 곤충에서 분리된 cecropin와 매우 높은 상동성(62 ~ 78%)을 나타냈다. Ay-CecA 유전자의 C말단에 기존에 보고된 곤충의 cecropin에서와 동일하게 C말단 아미드화를 위한 glycine 잔기가 존재하고 있다. 이 펩타이드의 항균활성을 검정하기 위해서 대장균 발현 시스템을 이용하여 활성이 있는 재조합 Ay-CecA 발현에 성공하였다. 발현 기주인 대장균에 대한 재조합 CecA 독성 중화를 위해서 불용성 단백질인 ketosteroid isomerase(KSI) 유전자를 CecA 유전자와 융합하였다. 융합 CecA-KSI 단백질은 대부분 불용성 단백질로 발현되었다. 발현된 융합단백질은 Ni-NTA immobilized metal affinity chromatography(IMAC)에 의해서 정제하였으며 CNBr 반응을 통하여 재조합 CecA를 절단하여 용출하였다. 최종적으로 양이온 교환 chromatography 과정을 통하여 CecA를 순수 정제하였다. 정제된 재조합 Ay-CecA는 그람음성균인 E. cori ML 35, Klebsiella pneumonia 및 Pseudomonas aeruginosa에 대해 매우 높은 항균활성을 나타냈었다. 따라서 본 연구 결과, 높은 항균활성 지닌 CecA는 천잠의 면역 반응에서 중요한 역할을 담당할 것으로 사료된다.

• 생명과학회지
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• 제22권8호
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• pp.1024-1033
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• 2012

Kocuria gwangalliensis로부터 카로티노이드 생합성 경로의 첫 번째 단계 기질인 geranylgeranyl pyrophosphate (GGPP)를 생합성하는 GGPP synthase (CrtE)를 암호화하고 있는 crtE를 클로닝 하여 이를 KgGGPP로 명명하였다. 기존 세균에서 밝혀진 GGPP synthase의 아미노산 서열을 NCBI에서 검색하여 KgGGPP synthase의 아미노산 서열과 비교한 결과 Kocuria rhizophila와 59.6%의 상동성을 가지는 것을 확인하였다. crtE 유전자를 대장균에서 발현 시키기 위하여 pCcrtE 재조합 DNA를 구축하였고, 이를 대장균에서 발현시킨 결과 약 41 kDa의 재조합 단백질이 과발현 됨을 확인 할 수 있었으며, 이 단백질은 기존 세균에서 밝혀진 GGPP synthase와 유사한 분자량을 가지고 있다는 것을 알 수 있었다. CrtE 재조합 단백질의 활성을 분석하기 위하여 대장균 내에서 라이코펜의 생합성을 유도 하였다. 대장균의 경우 메발론산 경로를 통하여 FPP와 IPP를 생합성 하지만 crtE, crtB, crtI 유전자가 없기 때문에 라이코펜을 생합성 하지는 못한다. 대장균 내에서 라이코펜의 생합성을 위해서는 crtE, crtB, crtI 유전자의 발현이 필수적으로 요구되기 때문에 crtB, crtI 유전자의 경우는 P. haeundaensis에서 유래한 유전자를 이용하여 pRScrtBI 재조합 DNA를 구축하여 그 발현을 유도하였다. 상기 두 재조합 DNA를 대장균에서 공발현 시켰으며, HPLC 분석법을 이용하여 대장균 내에서 라이코펜의 생산 유무에 따른 KgGGPP synthase의 활성을 분석하였다.