내분비계 장애물질로 잘 알려진 bisphenol A (BPA)를 단일탄소원으로 이용하여 균체성장을 나타내는 미생물 87주를 공단주변의 토양, 폐수 혹은 활성슬러지로부터 분리하였다. 분리된 균주 중 균체성장이 우수한 균주 8중을 2차 분리하였으며, 이 중 BPA분해효율이 뛰어난 3종의 균주를 BPA분해미생물로 최종 선별하였다. 최종 선별된 3종의 균주를 16s rDNA의 부분적 염기서열 및 형태학적, 생리학적 특성조사를 통해 Serratia maycescens 1901, S, marcescens 1902 그리고 Pseudomanas putida 1401로 동정되었다. BPA분해능은 HPLC분석을 통해 배양액중의 잔존 BPA 농도로 측정하였으며, 최종 선별된 3종의 균주를 대상으로 BPA가 100 mg/1흑은 500 mg/l의 농도로 포함된 최소 무기염 배지(PAS) 및 비타민을 포함하는 PAS인 PAV 배지에서 배양하여 BPA 분해능을 조사한 결과 20-40%의 분해효율을 나타내었다. 이들 균주의 균체성장은 PAS 배지에서 보다 PAV배지에서 우수하였다. S. marcescens 1901은 저농도(100 mg/l) BPA에서 분해효율이 다른 2종의 균주보다 우수하였고, S. marcescens 1902와 P. putida 1401은 고농도(500 mg/l)에서 BPA분해효율이 높았다. 선별된 3균주의 순수배양과 흔합배양에 의한 BPA분해효율을 비교한 결과, 유의한 차이는 나타나지 않았다.
백색부후균인 느타리버섯 60균주로부터 목재를 분해하는 리그닌-셀룰로오스 분해효소 생산 능력이 우수한 균주를 선발하였다. 그 결과 1, 2차 스크리닝을 통해 실험한 모든 균주에서 리그닌-셀룰로오스 분해효소를 생산하는 것을 확인하였다. 그러나, 아비셀 함유 평판배지에서 선발된 6개 균주의 경우 2차 스크리닝 아비셀-효모추출물-펩톤 액체배지에서 셀룰로오스 분해효소 활성이 낮은 것을 확인하였다. 자일란 분해효소의 경우 자일란-효모추출물-펩톤 액체배지에서 No. 6, No. 38균주에서 xylanse 1.0 U/ml 이상, 1,4-${\beta}$-xylosidase 0.15 U/ml 이상 생산되었다. RBBR 함유 평판배지에서 선발된 13개 균주를 가지고 글루코오즈-효모-펩톤 배지 조건하에서 리그닌 분해 효소의 생산 실험을 한 결과 락케이즈가 먼저 최대 활성(0.8~2.0U/ml)을 나타낸 뒤 Mn-dependent peroxidase가 최대활성(0.5~1.5U/ml)를 나타내었다. 한편, 글루코오즈-효모-펩톤 배지 조건하에서 실험한 모든 균주에서 lignin peroxidase는 생산되지 않았다. 특히 본 연구자는 이러한 스크리닝 방법에 의해 Mn-dependent peroxidase와 laccase 생산 능력이 높은 No. 42균주를 선발하였다.
본 연구는 포름알데히드를 분해하는 균주를 하천의 진흙에서 6종 분리하고 그 중에서 포름알데히드의 분해능이 가장 우수한 균주인 H-5을 분리동정하여 Pseudomonas putida H-5라고 명명 하였다. Pseudomonas putida H-5의 최적 생장조건은 온도 $30^{\circ}C$, pH 7.0이었고, 포름알데히드는 0.02~0.04% 의 농도에서 가장 분해가 잘 되었고, 기질로는 glucose가 가장 우수하였다. Pseudomonas putida H-5에 의하여 포름알데히드는 메탄올과 개미산으로 분해되며 이는 균주의 생육에 아무런 영향을 미치지 않았다.
원유 분해세균에 의한 원유 분해능을 조사한 결과, Xanthomonas camperstris M12, Xanthomonas sp. M28, Acintobacter lwoffi G1, Klebsiella pneumoniae L25, 그리고 Pseudomonas maltophilia N246 등의 순서로 나타났다. Xanthomonas maltophilia M12, Xanthomonas sp. M28, 그리고 Pseudomonas maltophilia N246 균주 모두 pctane 분해시의 온도는 $30^{\circ}C$에서 최적이었으며, 최적 pH는 X.camperstris M12와 Xanthomonas sp. M28이 7.0-7.5 이었고, P.maltophilia N246이 7.5-9.0이었다. N246 균주의 최적 NaCl농도는 3.0-3.5 이었다. P.maltophilia N246와 X.campestris M12는 모두 플라스미드를 갖고 있음을 확인하였고, N246 균주로 부터 플라스미드를 제거하였을 경우 octane 분해능이 소실되었으므로 이 플라스미드 위에 octane 분해 유전자가 있음이 확인되었다. 이 균주이 OTC 플라스미드의 크기는 118kb이었다. 또한, N246 균주는 ampicillin 항생제에 내성을 나타내었다.
아닐린분해능이 있는 Flavimonas oryzihabitans과 4-chlorobiphenyl (4-CBP)를 분해하는 Pseudomonas sp.를 원형질체 융합하여 아닐린과 4-CBP를 모두 분해하는 융합균주를 개발하고, 융합체의 특성을 조사하였다. F. oryzibhavitans는 융합체 선별표지 위애 NTG처리하여 chloramphenicol 내성 ($Cm^r$)을 유발하였다. Lysozyme-EDTA에 의한 각 모균주의 원형질체 생성율은 약 99%이었고, 원형질체의 재생율은 5.0~6.6%이었다. 원형질체는 40% PEG 6000을 사용하였을 때 효과적으로 융합이 이루어졌으며 융합율은 $3.16{\times}10^{-4} $이었다. 융합균인 F22의 DNA양는 모균주에 비해 약 2배 정도 증가 하였으며, 생화학적 특성은 모균주의 특성이 혼합하여 나타났다. F22는 5 mM 아닐린 최소배지에서는 모균주와 성장능과 분해능이 거의 비슷하였고, 10 mM 아닐린 최소배지에서는 1.5배 빠른 성장속도를 나타내었으나, 4-CBP 분해능은 모균주보다 약간 낮게 나타났다.
방향족화합물들로 오염되어있는 토양 및 산업폐수를 포함한 각종 시료로부터 phenol에 분해활성이 높은 56균주를 순수분리 하였으며, 이들 분리 균주 중 균체생육과 phenol 분해활성이 가장 높은 균주인 GN13을 선별하였다. 분리균주 GN13은 형태학적, 생리학적 및 생화학적 특성을 조사한 결과 Neisseria 속 세균과 유사한 것으로 판명되어 최종적으로 Neisseria sp. GN13으로 명명하였다. 분리균주 Neisseria sp. GN13의 균체생육 및 phenol 분해를 위한 최적온도와 최적 pH는 각각 $32^{\circ}C$와 7.0였다. 유일 탄소원으로 phenol 1,000 mg/l를 포함하여 최적화된 배지를 사용한 jar-fermentor 배지에서 배양 30시간에 균체생육이 최대에 이르렀으며 배양 27시간째 거의 모든 phenol이 분해되었으며, catechol deoxygenase 활성측정에 의하여 Neisseria sp. GN13은 meta-와 ortho-pathway를 통하여 catechol 분해가 일어났다. Neisseria sp. GN13은 phenol 함유 인공폐수에서의 phenol 분해율은 배양 30시간 만에 97%의 phenol이 분해되는 것으로 나타났으며, 인공폐수에 대한 Neisseria sp. GN13과 활성슬러지 처리구에서의 TOC 제거효율은 각각 83%와 78%였다. 석유화학폐수에 대한 Neisseria sp. GN13의 COD 제거율은 활성슬러지만을 포함한 대조구보다 약 1.3배 높은 효율을 나타내었다. 이러한 결과로 미루어 분리균주 Neisseria sp. GN13은 phenol을 함유하고 있는 여러 폐수에 효과적으로 적용될 수 있을 것으로 생각된다.
토양으로부터 유기인계 살충제인 phosphamidon을 분해하는 세균들을 분리하고 Biolog system을 이용하여 동정하였다. 그람양성 세균들은 모두 Bacillus 속에 속하는 종들이었으며 그람음성 세균들은 토양에서 우점하지 않는 세균들이 많았다. 이들중 phosphamidon 함유배지에서 생장률이 높은 균주들을 선택하여 phophamidon 분해능을 조사한 결과 Capnocytophaga gingivalis 로 동정된 YD-17 균주가 가장 높은 생분해능을 나타내어 1000ppm의 phosphamidon 이 배양 21일 후 94%의 잔류량을 보였으며 이는 대조구에 비해 제거율이 52% 증가된 결과였다. 이 때 균주의 생장을 단백질량으로 측정하였는데 분해균주들이 고농도의 phosphamidon에 의해 저해되지 않고 지속적인 생장을 하여 phosphamidon을 탄소원으로 이용하는 생분해가 일어난 것을 확인할 수 있었다.
영양 성분을 함유하고 있는 유기성 폐기물은 미생물에 의해 처리되어, 유용한 물질로 전환될 수 있다. 이러한 생물학적 공정에서 미생물 세포와 효소는 원료 물질인 기질과 함께 중요하다. 대규모화 공정에서도 미생물 세포와 효소는 공정 최적화에서 필수적인 요소이다. 본 연구에서는 이러한 생물학적 공정의 효율성을 높이는 목적으로 다량의 아미노산과 단백질을 함유하고 있는 많은 종류의 부패가 진전된 유기성 폐기물과 발효 식품에서 단백질 분해효소를 생산하는 미생물을 분리하였다. 단백질 분해 효소의 활성, 온도와 산도등 활성 조건과 활성 정도를 확인하여 선택된 균주들을 동정하였다. 산업적으로 저온에서 단백질을 분해하는 효소는 유기성 폐기물을 저온에서 처리할 수 있다. 저온에서 처리가 가능하다는 것은 폐기물의 처리 온도를 낮은 상태로 유지할 수 있어 그 만큼의 열(steam)비용을 줄일 수 있다. 또한 이 단백질 분해효소를 이용하여 단백질을 분해 후 다량의 아미노산을 생산할 수 있으므로 아미노산 생산 공정에도 적용이 가능하다. 이렇게 유기 폐기물을 처리하여 다양한 용도로 사용할 수 있으므로, 폐기물의 가치를 높일 수 있다. 다양한 활성 조건에서 단백질 분해효소를 다량으로 생산하는 균주를 분리하여 동정하고, 균주 배양 조건, 효소 생산의 최적 조건에 대한 연구를 수행하였다.
석유화학 공업으로부터 생산되는 방향족 탄화수소 화합물질들은 여러 가지 산업과정에서 널리 활용되고 있으나, 자연계에 오염될 때에는 쉽게 분해되지 않는다는 점에서 환경 오염물질로 주목받고 있다. 방향족 탄화수소 물질의 미생물 분해는 산화반응에 의한 benzene고리의 개환으로부터 시작되기 때문에 이 개환 작용을 갖는 미생물의 분리와 함께 그 분해 기능을 연구하는 것은 매우 중요한 일이다. 본 연구에서는 여천 화학공업단지 폐수로부터 benzoate와 catechol 등의 방향족 탄화수소에 대하여 분해능이 우수한 균주를 분리하여 생화학적 특성과 세포 지방산 분석에 의하여 동정한 결과 Pseudomonas putida로 밝혀졌다. 따라서 이 균주를 Pseudomonas putida Z104라 명명한 후, benzoate와 catechol의 분해과정을 검토하였다. Pseudomonus putida Z104의 catechol분해능에 대하여 환경요소의 영향을 실험한 결과, 3$0^{\circ}C$와 pH 7.0 그리고 0.5mM의 농도에서 왕성한 세포의 생장과 catechol의 분해능을 보였으다. 그러므로 Z104 균주는 benzoate를 연속적으로 완전분해시키는 유전자를 모두 가지고 있다는 점에서 활용가치가 있는 균주라고 판단된다.
다환방향족 탄화수소는 주요한 독성환경오염물질풍의 하나이며 해양퇴적물에 축적이 된다. 다환방향족 탄화수소가 가지고 있는 위해성으로 인해 해양퇴적물내의 다환방향족 탄화수소 제거는 많은 관심사가 되어오고 있다. 본 연구에서는 다환방향족 탄화수소로 오염된 해양퇴적물의 생물정화를 위해 bioslurry reactor를 사용하기 위한 전단계로 ex situ bioremediation을 위한 최적 조건을 찾기 위해 멸균 유무의 퇴적물에서 균주접종과 혼합 cyclodextrin (M-CD)공급의 효과를 알아보았다. 비멸균상태의 퇴적물에서 분해균주의 접종여부에 상관없이 M-CD가 첨가된 실험구의 전자전달계활성이 증가되었고 멸균상태의 퇴적물에서는 분해균주가 접종되고 M-CD가 첨가된 실험구의 전자전달계활성이 증가되었다. 멸균상태의 퇴적물에서 M-CD와 함께 단일 균주가 접종되었을 때 퇴적물내의 다환방향족 탄화수소의 분해율이 9-20%로 나타났으며 동일한 조건에서 혼합균주가 접종되었을 때는 24-37%로 나타났다. 비멸균상태의 퇴적물에서 동일한 조건으로 실험하였을 때는 유의한 분해가 일어나지 않았으며 군집분석 결과 접종 균주도 감소하였다. 또한 M-CD 첨가 없이는 2일후 접종균주를 찾아볼 수 없었다. 결론적으로 퇴적물내의 다환방향족 탄화수소 제거를 위해 퇴적물내의 토착미생물과 포식자가 제거된 상태에서 적절한 탄소원과 함께 균주를 접종하는 것이 효과적인 것으로 나타났다.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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