소금생산을 위해 25% 이상의 함수를 저장해 놓는 염전의 해주로부터 호염성 세균 4균주를 분리하고 높은 염분농도에서도 ${\beta}$-glucosidase를 생성하는 HJS1과 HJS6 균주를 선발하였다. 이들 ${\beta}$-glucosidase 생성세균은 NaCl 1-10%에서 70-79U/mg의 최적 활성을 나타내었고, NaCl 3%에서 최대 활성을 나타내었으며 NaCl 0-20% 농도에서 최대 효소 활성대비 75%이상의 효소활성을 유지하는 내염성 ${\beta}$-glucosidase를 생성하는 것으로 확인되었다. 내염성 ${\beta}$-glucosidase 생성 HJS1과 HJS6 균주의 16S rRNA 유전자 염기서열을 검토한 결과, Roseivivax roseus $BH87090^T$ (FJ897782)와 99.8%의 상동성을 나타내었고 상기 균주들의 염기서열은 NCBI GenBank에 각각 AB971835와 AB971836로 등록하였다. 계통학적으로 근연종인 Roseivivax roseus $BH87090^T$와의 DNA-DNA 상동성을 비교 검토한 결과, 90.1-90.3%를 나타내었다. 이들 균주의 주요 균체지방산은 $C_{16:0}$, $C_{18:1}$${\omega}7c$, $C_{19:0}$ cyclo ${\omega}8c$ 그리고 11-methyl $C_{18:1}$${\omega}7c$를 함유하고 Quinone종은 Q-10로 근연종 Roseivivax roseus $BH87090^T$ 균주와 동일한 특징을 나타내어 Roseivivax roseus로 동정되었다. 반면, 비교 균주 Roseivivax roseus $BH87090^T$는 ${\beta}$-glucosidase 생성하지 않는 것으로 나타났다. 본 연구에서 분리된 Roseivivax roseus HJS1과 HJS6 균주는 내염성 ${\beta}$-glucosidase 효소 개발을 위한 유전자원으로 활용 가능하리라 사료된다.
본 연구의 목적은 기존의 단일 균주보다 두 종의 서로 다른 균주를 복합시켰을 때 두 균주간의 상호 보완적인 면을 이용하여 효소생산을 극대화하기 위함이며, 다음과 같은 결론을 얻었다. 실험에서 사용된 T viride와 FB01는 최적 PH와 온도가 비슷하여 혼합배양이 가능하였으며, 이들의 복합균주를 개발하는데 성공하였다. 즉 두 균주는 회분배양 하였을 때, 서로의성장속도에 차이가 있었기 때문에 두 균주의 생장균형을 유지하기 위해 접종시기를 조절할 필요가 있었다. 접종시기를 변화시킴으로서 두 균주간의 상호작용으로 인해 단일 균주일때보다 CMCase, $\beta$-glucosidase 및 avicelase의 활성이 우수했으며 또한 계대배양을 통한 두 균주의 활성유지에 관한 실험에서는 pH 조절을 통해 $\beta$-glucosidase 활성이 최고 3.2배까지증가함을 알 수 있었다. 따라서 배양액내에서 초기 pH의 영향은 생산된 cellulase complex의 다양한 구성요소의 상대적인 농도를 결정하는 실질적인 요인으로 판명된다. pH 4.5에서의 enzyme activity는 12.5 U/mL CMCase, 2.46 U/mL If-glucosidase, 0.93 U/mL avicelase였으며 개발당시의 복합균주활성인, 2.04 U/ml CMCase, 0.78U/ml $\beta$-glucosidase, 0.2 U/mL avicelase과 비교할 때 각각 6, 3.2, 4.7배의 높은 활성을 보였다. 복합균주의 탄소원으로 볏짚을 이용했을 때 복합균주에 의한 효소생산이 단일 균주인 T. virile나 FB01보다 훨씬 높게 나타났으며, 이때의 볏짚의 최적 농도는 5%(w/v)였다. 이러한 배양조건에서 복합균주를 장기적으로 계대배양하면서 효소의 생산성 향상과 복합균주의 안정성을 관찰할 필요가 있다고 사료된다.
본 연구는 콩, 메주, 된장에서의 isoflavones의 aglycones % 차이와 ${\beta}-glucosidase$의 활성을 살펴보기 위하여 수행되었다. Isoflavones 중 체내 이용률이 높은 aglycones %는 콩보다는 메주, 된장에서 높게 나타났다. 콩의 경우 유리 daidzein이 106 mg/kg, 총 dai-dzein은 406 mg/kg으로 aglycones 비율이 26.03%이었고 유리 genistein이 95 mg/kg, 총 genistein은 484 mg/kg으로 aglycones 비율이 19.49%이었으며 daidzein/genistein ratio는 0.85이었다. 메주는 유리 daidzein이 269 mg/kg, 총 daidzein은 433 mg/kg으로 aglycones 비율이 61.96%이었고 유리 genistein이 137 mg/kg, 총 genistein은 200 mg/kg으로 aglycones 비율이 68.52%이었으며 daidzein/genistein ratio는 2.16였다. 된장은 유리 daidzein이 578 mg/kg, 총 daidzein은 538 mg/kg으로 aglycones 비율이 107.68%이었고 유리 genistein이 455 mg/kg, 총 genistein은 538 mg/kg으로 aglycones 비율이 85.26%이었으며 daidzein/genistein ratio는 1.00이었다. ${\beta}-glucosidase$의 활성은 콩(5.65 units/mg protein), 메주(2.04 units/mg protein), 된장(0.69 units/mg protein)의 순이었다. pH변화에 따른 ${\beta}-glucosidase$ 활성 변화를 조사한 결과 콩은 pH 6.5, 메주와 된장은 pH 7.0에서 최대 활성을 나타냈다. 온도에 있어서는 $50^{\circ}C$에서 최대 활성을 보였다.
Sophorose에 의한 섬유소분해효소의 유도현상에 있어, Nisizawa등고 Strernbergdh Mandels가 연구보고한 상호 다른 결과들을 재규명하고, sophorose에 의한 섬유소분해효소 합성에 미치는 몇가지 요인들을 조사하고자 본 연구를 행하였다. Sophorose는 Trichoderma reesei QM914에서 CMCase와 ${\beta}-glucosidase$의 합성을 동시에 유도하며, CMCase는 pH 3.0~4.0의 완충용액을 갖는 유도배지에서, ${\beta}-glucosidase$는 pH 5.0~6.0의 K-citrate 완충용액을 갖는 유도배지에서 그 합성이 최대로 유도되었다. 또한, 세포내 ${\beta}-glucosidase$는 pH 6.5의 기질용액에 대하여, 세포의 ${\beta}-glucosidase$는 pH 5.0의 기질용액에 대하여, 각각 최대 활성도를 나타내었다. Methyl ${\beta} D glucosidase$ 는 ${\beta}-glucosidase$의 진정한 유도물질이 아닌 것으로 밝혀졌다. 포도당은 sophorose 에 의한 섬유소분해효소의 유도과정을 억제하며, 이 억제효과는 cAMP의 첨가에 의해서 영향을 받지 아니하였다.
Aspergillus nid$\mu$tans 의 분생포지에는 두 종류의 $\beta$.glucosidase, 즉 tightly-bound enzyme(TBE)과 loosely-bound enzyme(LBE)이 존재한다. 포자수와 효소활성도가 정비례함을 보아 이 효소의 존재을 확인할 수 있었으며, 배양조건 하에서 의 오랜기잔 방치에도 얼정 수준의 활성을 유치하는 높은 안정성을 보였다. 분생포자에 여러가지 물리.화학적 처리를 한 뒤에도 TBE의 환성도에는 큰 변화가 없었으며, TBE의 최적 pH 및 온도는 각각 6.0, $55^{\circ}C$였다.TBE의 열안정성은 균사체의 $\beta$-glucosidase보다 높았으며, $H^{2+}$이온에 대한 내성도 비교적 높은 수준을 보였다. LBE와 균사체 $\beta$-glucosidase의 전기영동 양상이 유사한 것으후 보아 율사체와 동일한 효소가 포자의 표면에 존재후L을 알 수있었다.
숙성기간이 다른 재래식 된장 12종과 개량식 된장 4종의 아이소플라본과 $\beta$-glucosidase 활성도를 비교하였다. 재래식 된장의 전체 아이소플라본 함량(TI)은 $370-723\;{\mu}g/g$이었고, 개량식 된장은 $179-537\;{\mu}g/g$으로 유의적으로 낮은 함량을 보였다. 된장의 주요 아이소플라본은 비배당체 형태였으며 재래식 된장의 경우 42.98-89.96%, 개량식 된장은 35.51-93.48%이었다. 아이소플라본 함량 분포에 대한 주성분 분석 결과 재래식 된장은 개량식 된장과 차별화가 가능하였다. 개량식 된장의 경우 $\beta$-glucoside 형태는 검출되지 않았는데 이는 과도한 열처리를 받았거나 발효에 관여한 미생물의 $\beta$-glucosidase 활성이 높았음을 의미한다. 된장시료에서 $\beta$-glucosidase 활성도는 날콩에 비해 낮았으며 재래식 및 개량식 된장간에 유의적인 차이 및 아이소플라본의 분포와의 상관관계는 명확하지 않았다.
Trichoderma reesei KCTC 6952는 고분자 섬유소인 cellulose를 분해하는데 관여하는 3종류의 효소로 구성된 cellulase system을 보유하고 있다. 그 중 ${\beta}$-glucosidase는 glucose를 함유한 glycoside 유도체들로부터 glucose를 효율적으로 유리할 수 있는 것으로 알려져 있다. 본 연구에서는 변형된 Mandels의 배지를 사용하여 T. reesei KCTC 6952를 배양하면서 배지로 분비된 ${\beta}$-glucosidase를 조효소액으로 회수하여 조효소액내의 ${\beta}$-glucosidase 활성을 측정하고, 또한 효소활성이 온도와 pH에 대하여 어느 정도 안정한 지를 조사하였다. 그 결과 배양 4일째에 ${\beta}$-glucosidase의 효소활성이 최고(1.33 unit/mL)에 도달하였으며, 조효소액내의 ${\beta}$-glucosidase의 최적 반응 조건은 pH 5과 $70^{\circ}C$에서 10분간 반응하는 것이었으며, 그리고 효소의 안정성을 실험한 결과에 의하면 pH 4-5의 범위에서, $50^{\circ}C$ 이하에서는 안정적이었다. 그러므로 결론적으로 본 연구를 위하여 선택된 ${\beta}$-glucosidase 조효소액은 비교적 높은 온도와 넓은 pH범위에서 촉매반응을 일으킬 수 있었다.
${\beta}$-Glucan 분획을 제거한 신령버섯 균사체 액체 배양액(${\beta}$-glucan-free HEAB)으로부터 새로운 형태의 ${\alpha}$-glucosidase 활성저해 소재를 개발하였다. ${\beta}$-Glucan-free HEAB를 용매분획하여 10 mg/ml 농도에서 ${\alpha}$-glucosidase 저해활성을 측정한 결과 EA분획이 가장 강한 활성(61.6% 저해)을 나타내었고, 경구혈당강하제인 acarbose (5 mg/ml; 39.5% 저해) 보다 강하였다. EA분획을 더 분획하여 ${\alpha}$-glucosidase 저해활성이 80.4%인 분획을 얻었다. 이 분획에는 ${\alpha}$-glucosidase 저해 활성을 갖는 daidzin 및 genistin과 같은 isoflavone과 isoflavone의 sugar conjugate된 물질이 함유되어 있었다. 따라서 ${\alpha}$-glucosidase 저해 활성을 나타내는 ${\beta}$-glucan-free HEAB나 EA분획물은 인체의 혈당을 조절할 수 있는 소재로 활용될 수 있을 것이다.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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