The Journal of Korean Obstetrics and Gynecology (대한한방부인과학회지)

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Yuklinzu Aqueous Extracts Ameliorate Experimental Climacterium Symptoms Induced by Ovariectomy in Mouse

난소적출로 유발된 갱년기장애 마우스 모델에서 육인주(毓麟珠) 열수 추출물의 증상 개선 효과

  • Yu-Jeong Choi (Dept. of Korean OB & GY, College of Korean Medicine, Daegu Haany University) ;
  • Dong-Chul Kim (Dept. of Korean OB & GY, College of Korean Medicine, Daegu Haany University)
  • 최유정 (대구한의대학교 한의과대학 한방부인과교실) ;
  • 김동철 (대구한의대학교 한의과대학 한방부인과교실)
  • Received : 2023.10.13
  • Accepted : 2023.11.24
  • Published : 2023.11.24
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Abstract

Objectives: The object of this study was to observe the complex anti-climacterium potentials of Yuklinzu aqueous extracts (YLZ), using bilateral ovariectomy (OVX) female ddY mice similar to women postmenopausal symptoms, as including cardiovascular diseases, obesity, hyperlipidemia, osteoporosis and hepatic steatosis. Methods: In order to evaluate anti-climacterium effects of YLZ, six groups of mice were used; sham control, OVX control, 17β-estradiol, YLZ 500, 250 and 125 mg/kg treated groups. Since 28 days after bilateral OVX surgery, YLZ were administered orally for 84 days, once a day. And then we evaluated anti-climacterium effects divided into five categories; estrogenic effects, anti-obesity, hypolipidemic effects, hepatoprotective effects and anti-osteoporotic effects. The results of YLZ were compared with 17β-estradiol 0.03 ㎍/head/day subcutaneous treated OVX mice. Results: As a result of OVX, obvious changes related to the estrogen-deficient menopausal symptoms - obesity, hyperlipidemia, hepatic steatosis and osteoporosis were displayed in mice. However, these menopausal symptoms induced by OVX were significantly inhibited by 84 days of consecutive treatment of 17β-estradiol, YLZ 500, 250 and 125 mg/kg, respectively. Especially, YLZ showed obvious dose-dependent inhibitory activities on the OVX-induced climacterium changes in mice, and YLZ 500 mg/kg showed comparable inhibitory effects against menopausal symptoms in comparison with those of 17β-estradiol 0.03 ㎍/head/day subcutaneous treatment. Conclusions: The results suggest that oral administration of YLZ 500, 250 and 125 mg/kg has obvious dose-dependent favorable anti-climacterium effects in OVX mice. Especially, YLZ 500 mg/kg showed comparable inhibitory effects against menopausal symptoms in comparison with those of 17β-estradiol 0.03 ㎍/head/day subcutaneous treatment.

Keywords

Ⅰ. 서론

갱년기장애란 여성의 생식 능력이 점차 소실되면서 동반되는 점진적인 에스트로겐 결핍에 의해 나타나는 다양한 증상을 의미한다1). 급성 에스트로겐 결핍 증상에 속하는 안면홍조, 식은땀 외에도 수면장애, 근육통, 질 건조감, 성교통, 배뇨장애 등 다양한 증상이 나타날 수 있으며 폐경 이후에는 골다공증 및 심혈관 질환 위험 또한 증가한다1).

폐경이 여성의 건강에 미치는 영향을 최소화하기 위해 한때 호르몬 대체요법이 권장되었으나, 장기간 적용 시 심혈관 질환 위험성이 오히려 증가하고 유방암, 혈전증 등 부작용 발생 가능성이 커지는 것으로 밝혀져 안전성에 대한 우려가 꾸준히 제기되고 있다2). 이에 많은 연구자들은 갱년기장애를 개선할 수 있는 여러 대체요법을 찾고 있으며 그중 대표적인 것으로 식물성 에스트로겐(phytoestrogen)의 일종으로서 폐경으로 인한 대사질환 관련 증상3) 및 골밀도 감소를 개선4)시킬 수 있는 것으로 알려진 isoflavone 등이 있다.

毓麟珠는 ≪景岳全書≫에 최초로 수록된 처방으로 腎虛로 인한 不姙, 月經不調, 經閉 등 부인과 영역에서 다양하게 활용되고 있다5). 현재까지 보고된 毓麟珠 관련 실험 연구로는 백서의 배란에 미치는 영향6), 소의 자궁내막·난포의 성숙·수정·배발생에 미치는 영향7), 난소적출 백서의 골다공증에 미치는 영향8) 등이 있다. 본 연구에서는 심혈관 질환, 비만, 고지혈증, 골다공증, 지방간 등 여성 갱년기 모델과 유사한 양측 난소적출(OVX) ddY 마우스를 이용하여 毓麟珠의 갱년기장애 개선 효과를 관찰하고자 하였다9-12).

갱년기장애 개선 효과를 평가하기 위해 에스트로겐 유사효과, 항비만 효과, 혈중 지질 저하 효과, 지방간에 대한 간 보호 효과, 골다공증 억제 효과 등 5가지 범주로 구분하였으며9,10), OVX를 시행한 마우스에 毓麟珠 열수 추출물(YLZ) 500, 250, 125 mg/kg 및 17β-estradiol 0.03 μg/head를 투여한 후 각 효과를 비교 분석하여 유의한 결과를 얻었기에 보고하는 바이다.

Ⅱ. 재료 및 방법

1. 실험동물 및 사육관리

6주령의 암컷 SPF/VAF ddY mice(Kiwa Laboratory Animal, Japan; 체중 범위 24~26 g) 100마리를 폴리카보네이트 케이지(온도 20~25℃, 습도 50~55%, 명암주기 12시간)에서 7일간 순응 과정을 거쳐 사용하였으며, 사료(Cat. No. 38057; Purinafeed, Korea)와 물은 자유롭게 공급하였다9,10)(Fig. 1).

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Fig. 1. Experimental design.

OVX 27일 후 측정한 체중 편차에 기초하여 각 그룹당 10마리씩 총 6그룹을 배정하였다(Table 1). 모든 동물은 실험 동물의 사용 및 복지에 관한 국가규정에 따라 처리하였으며 동물실험에 앞서 대구한의대학교 동물실험윤리위원회의 승인(Approval No. DHU2022-031)을 받아 진행하였다.

Table 1. Experimental Designs

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*OVX : Ovariectomy, †YLZ : Yuklinzu aqueous extracts

2. 약재 준비 및 투여

Rotary vacuum evaporator(N-1110, Eyela, Japan)와 Programmable freeze dryer(FDB-5503, Operon, Korea)를 이용하여 毓麟珠 열수 추출물(YLZ) 분말을 준비하였다. YLZ를 구성하는 약재는 총 12가지로 제천한방약초에서 구입 후 현미경을 통한 관능검사를 거쳐 선별한 것을 사용하였으며 1첩당 구성 및 용량은 Table 2와 같다. 5첩 분량인 280 g을 증류수 2,800 ml와 함께 60℃에서 4시간 동안 3회 가열한 후 Automated round flasked evaporator(N-1110, Eyela, Japan)로 증발시켜 완전히 동결건조하여 얻어진 총 51.58 g(수율 18.42%)의 YLZ를 -20℃에 냉동 보관하였다.

Table 2. Composition of YLZ

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OVX 후 28일부터 YLZ 500, 250, 125 mg/kg을 84일 동안 1일 1회 경구투여하였다9,10). YLZ가 복합한약제제의 열수 추출물임을 고려하여6-8) 최고, 중간, 최저 용량으로 각각 500, 250, 125 mg/kg이 선정되었으며, 적정량의 YLZ(50, 25, 12.5 mg/ml 농도)를 증류수에 직접 용해하여 체중(kg)당 10 ml씩 투여하였다.

대조 약물군은 17β-estradiol(Sigma-Aldrich, USA) 0.03 μg을 멸균 식염수 0.2 ml에 현탁하여 우측 등에 0.03 μg/head/day씩 피하투여하였다13-5). OVX 대조군과 모의 수술(sham operation)군은 증류수를 동일한 양과 기간만큼 경구투여하였다(Table 2, Fig. 1).

3. 양측 난소적출을 통한 폐경 유도

표준설치류흡입마취장치(Surgivet, USA)로 각 마우스를 70% N2O, 28.5% O2 및 2~3% isoflurane(Hana Pharm. Co., Korea) 혼합물로 마취하고, 설치류인공호흡기(Harvard Apparatus, UK)를 이용하여 70% N2O, 28.5% O2 및 1~1.5% isoflurane 혼합물로 마취 상태를 유지시켰다. 수술은 정해진 방식에 따라 다음과 같이 수행되었는데9-12,16), OVX 시행군은 백선을 절개하여 개복한 후 1-0 silk(Daebo Ind., Korea)로 결찰하였으며 절개 부위는 용해 가능한 3-0 catgut(B. Braun Melsungen AG, Germany)로 봉합하였다9,10). 두 번째 그룹인 모의 수술(sham operation)군은 백선을 절개하였으나 OVX는 시행하지 않았다9,10). 수술 부위 상처 관리에는 포비돈 요오드(BetadineTM, Korea Pharma, Korea)와 알러스프레이(Vetoquinol, France)를 사용하였다9,10).

4. 체중 측정

체중 변화는 자동전자저울(Precisa Instrument, Switzerland)을 이용하여 OVX 당일, 약물 투여 1일 전(OVX 27일 후), 약물 투여 개시일, 최종 희생일 포함 주 1회 측정하였다9,10). 모든 동물은 사료 섭취로 인한 체중 변화를 최소화하기 위해 OVX 시행 전, 최초 약물 투여 전, 최종 희생 전 18시간 동안 금식시켰다. 그리고 실험 시작 시 개체 차이에 의한 체중 변화를 최소화하기 위해 아래의 공식 [1]을 이용하여 증체량을 계산하였다9,10).

EQUATION [1]. Body Weight Gains(g) OVX recovery/induced periods(28 days) = Body weight at initial test substance treatment - body weight at the day of OVX surgery

After administration(84 days) = Body weight at sacrifice - body weight at start of administration

5. 사료 섭취량 측정

모든 마우스는 개별 케이지에 150 g의 사료를 할당받았고, 사료 공급 24시간 후 자동 전자저울로 남은 사료의 양을 측정하여 개별 사료 섭취량을 계산하였다. 사료 섭취량 측정은 총 6회(첫 번째 투여 후 1, 3, 7, 28, 56, 83일) 수행되었다9,10).

6. 골밀도 및 체지방 측정

연속 투여 84일째 각 마우스의 전신 및 우측 대퇴골의 평균 골밀도, 평균 체지방 및 복부 지방 밀도를 측정하였다. 골밀도는 dual-energy x-ray absorptionmetry (DEXA; InAlyzer, Medikors, Korea)를 이용하여 측정하였다.

7. 장기 중량의 변화

최종 희생일에 복강에서 간과 자궁 전체(질 포함)를 적출하여 주변 결합조직, 근육 등 잔해를 제거한 후, 축적된 복벽의 지방체를 수집하여 디지털카메라(FinePix S700, Fujifilm, Japan)로 촬영하였다9,10). 그 후 자동전자저울로 장기 중량을 g 단위로 측정하여 절대 습중량으로 간주하였다9,10). 개체별 체중 차이를 줄이기 위해 희생일 체중과 절대 습중량을 이용하여 상대 체중(체중 백분율)을 아래 공식 [2]에 따라 계산하였다9,10).

EQUATION [2]. Relative Organ Weights (% of body weight) = [(Absolute abdominal fat pad, uterus or liver weights / Body weight at sacrifice) × 100]

8. 뼈 중량 측정

양측 OVX 28일 후부터 84일간 연속 투여 후 종료일에 주변 결합조직과 근육 등 잔해를 제거하여 우측 대퇴골을 수집하였다9,10). 자동전자저울을 사용하여 g 단위로 측정한 뼈 중량을 절대 습중량(wet weight)으로, 고온건조오븐(LDO-080N, Daihan Labtech Co., Korea)에서 120℃로 8시간 동안 건조한 대퇴골의 중량을 건중량(dry weight)으로 간주하였다9,10). 이후 건조된 뼈를 용광로(LEF-1055-1, Daihan Labtech Co., Korea)에서 800℃, 6시간 동안 탄화시킨 후 측정된 값을 절대 회중량(ash weight)으로 간주하였다9,10). 개체별 체중 차이를 줄이기 위해 희생일 체중과 상대 습중량·건중량·회중량에 기초하여 아래 공식 [3]에 따라 상대 체중(%)을 계산하였다9,10).

EQUATION [3]. Relative Bone Weights (% of body weight) = [(Absolute bone weight / Body weight at sacrifice) × 100]

9. 뼈 강도 측정

뼈 강도는 컴퓨터시험장비(SV-H1000, Japan Instrumentation System Co., Japan)를 사용하여 건조된 우측 대퇴골 중간축의 파괴하중(Failure Load, FL)을 3점 굽힘 시험을 통해 뉴턴(N) 값으로 산출하였다9,10).

10. 혈청 생화학 검사

희생 시 대정맥에서 채취한 전혈 1 ml를 응고된 활성화혈청튜브와 원심 분리기(Labocene 1236 MGR, Gyrozen, Korea)를 이용하여 4℃ 미만의 온도에서 15,000 rpm으로 10분간 원심분리하여 혈청 샘플을 얻은 후, 자동혈액분석기(Dri-Chem NX500i; Fuji Medical System Co., Ltd., Japan)를 이용하여 혈청 아스파르테이트 아미노전이요소(aspartate aminotransferase, AST), 알라닌 아미노전이요소(alanine aminotransferase, ALT), 총 콜레스테롤(total cholesterol, TC), 저밀도지단백 콜레스테롤(low density lipoprotein cholesterol, LDL), 고밀도지 단백 콜레스테롤(high density lipoprotein cholesterol, HDL), 중성지방(triglyceride, TG)을 측정하였다. 또한 ELISA Kit(MyBioSource, USA)를 사용하여 혈청 osteocalcin(ng/ml), bALP(U/L), estradiol(pg/ml)을 측정하였다9,10). 모든 혈청 샘플은 분석 전까지 -150℃의 초저온냉장고(MDF1156, Sanyo, Japan)에 동결시켰다9,10).

11. 조직학적 분석(복부 지방체, 자궁, 간)

장기 중량 측정 후, 두껍게 침착된 복부 지방체와 좌측 자궁각 및 간 좌측엽을 채취하여 24시간 동안 10% 중성 포르말린에 고정하였다9,10). 그리고 automated tissue processor와 embedding center(Thermo Scientific, USA)를 이용하여 파라핀 포매 후 각 블록마다 자동화 마이크로톰(Leica Biosystems, Germany)으로 3~4 μm의 연속 절편을 제작하였다9,10). 이렇게 얻은 절편을 광학현미경(Nikon, Japan)으로 관찰하기 위해 HE(hematoxylin and eosin)로 염색하고, 분석이 수행되는 동안 그룹 분포를 맹검화하기 위해 카메라 시스템(Jenoptik Optical Systems GmbH, Germany) 및 컴퓨터 보조 자동화 이미지 분석기(IMT i-solution Inc., Canada)를 사용하였다9,10). 또한 간 일부분을 30% 자당 용액에서 탈수시킨 후 OR(oil red)로 지질을 염색하기 위해 저온유지장치(Leica Biosystems, Germany)로 절편화하였다9,10,17,18). 더욱 자세한 변화를 관찰하기 위해 복부 지방체의 총 두께(mm)를 측정하고, 컴퓨터 모니터의 제한된 시야에서 자동 이미지 분석 프로세스를 사용하여 복부 백색 지방세포의 평균 직경(μm)을 계산하였으며, 각 지방체 당 최소 10개씩 지방세포의 조직형태학적 분석을 시행하였다9,10,16-8). 또한 자동 이미지 분석기를 사용하여 자궁(전체, 점막, 상피) 두께(μm/uterus)와 자궁내막샘 비율(%/자궁점막)을 측정하고9,10), 지방간을 관찰하기 위해 OR 염색 후 간 실질 지방 변화 영역의 백분율(간 실질의 %/mm2)을 계산하였으며, HE 염색 후 자동화 이미지 분석 프로세스를 사용하여 간세포의 평균 직경(μm)을 계산하였다. 조직병리학자는 분석 시행 중 그룹 분포에 대해 알지 못했다9,10).

12. 조직학적 분석(좌측 대퇴골)

각 마우스의 좌측 대퇴골을 분리하여 10% 중성 포르말린에 고정한 후, 석회질 제거 용액(24.4% 포름산, 0.5N 수산화나트륨)으로 3일간 석회질을 제거하였다9,10,16). 이후 파라핀에 고정시켜 얇게(3~4 μm) 자른 후 SO(Safranin O)로 염색하여 조직학적 분석을 시행하였다. 또한 대퇴골 골단부 또는 피질골의 골흡수가 있는 부위에서 현미경하 자동화 영상 분석기를 이용하여 대퇴골간부 피질골 두께, 소주골 부피(TV/BV, TBV; %), 소주골 두께(Tbt; μm/trabecular bone), 골단 영역 당 소주골 수(Tbn; mean numbers of trabecular bone/epiphyseal regions), 길이(Tbl; μm/trabecular bone), 피질골 두께(Cbt; μm/mid-shaft cortical bone), 파골세포 수(Ocn; mean osteoclast cell numbers/epiphyseal regions) 및 비율(OS/BS; %)을 계산하였다9,10,12,17).

13. 통계 분석

SPSS for Windows(Release 18.0, SPSS Inc., USA)를 사용하여 통계 분석을 시행하였으며 모든 값은 ddY 마우스 10마리당 평균±표준편차(SD)로 표시되었다. 용량이 다른 그룹별 결과 비교를 위해 여러 차례 테스트가 수행되었으며, Levene test로 분산 동질성을 조사19)하여 유의한 편차를 나타내지 않는 경우 one-way ANOVA test에 이어 Tukey's HSD test로 분석하여 어떤 그룹을 비교했을 때 유의하게 다른지 확인하였다20,21). 등분산 검정에서 분산 동질성의 유의미한 편차가 관찰된 경우 Dunnett's T3(DT3)를 실행하여 어떤 그룹 간에 유의한 차이가 있는지 확인하였다20,21).

Ⅲ. 결과

1. 체중 및 증체량

OVX 후 4주 동안 모든 OVX 시행군의 체중이 모의 수술군에 비해 유의미하게(p<0.01) 증가하였다. 한편 17β-estradiol 피하투여군에서 최초 투여 후 42일째부터, YLZ 500 mg/kg, 250 mg/kg 및 125 mg/kg 경구투여군에서 각각 최초 투여 후 49일, 56일, 63일째부터 OVX 대조군 대비 체중 증가폭의 유의한(p<0.01 or p<0.05) 감소가 나타났다. 또한 이 실험에서 모든 약물 투여군은 OVX 대조군에 비해 84일 동안 체중 증가폭의 유의한(p<0.01) 감소를 보였다. 특히 YLZ 경구투여군은 OVX에 의한 체중 증가에 대해 용량 의존적인 억제 활성을 나타냈으며, YLZ 500 mg/kg 투여군의 경우 17β-estradiol 0.03 μg/head 피하투여군과 비슷한 결과를 보였다(Table 3, Fig. 2).

Table 3. Body Weight Gain

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*OVX : Ovariectomy, †YLZ : Yuklinzu aqueous extracts

Fig. 2. Body weight changes.

ED : Reference drug, 17β-estradiol 0.03 μg/head subcutaneous treatment; All animals were overnight fasted before OVX, first administration and sacrifice, respectively (†)

2. 사료 섭취량

OVX 대조군은 총 6회(최초 투여 후 1, 3, 7, 28, 56, 83일) 사료 섭취량 측정 시마다 모의 수술군에 비해 유의한(p<0.01) 증가세를 보였다. 반면 모든 약물 투여군은 최초 투여 후 56일부터 OVX 대조군 대비 사료 섭취량의 유의한(p<0.01 or p<0.05) 감소를 나타냈다. 특히 YLZ 경구투여군은 OVX에 의한 사료 섭취량 증가에 대해 용량 의존적인 억제 활성을 보였으며, YLZ 500 mg/kg 경구투여군의 경우 17β-estradiol 0.03 μg/head 피하투여군과 유사한 효과를 보였다(Table 4).

Table 4. Food Consumptions

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*OVX : Ovariectomy, †YLZ : Yuklinzu aqueous extracts

3. 복부 지방체 중량의 변화

복부 지방체의 현저한 침착이 OVX 대조군에서 관찰되었으며, 결과적으로 모의 수술군에 비해 OVX 대조군에서 복부 지방체 무게의 절대적·상대적 증가가 유의하게(p<0.01) 나타났다. 한편 모든 약물 투여군에서 OVX 대조군에 비해 복부 지방체 무게의 유의한(p<0.01) 감소가 관찰되었고, YLZ 경구투여군은 OVX로 유도된 복부 지방 침착 및 복부 지방체 무게 증가에 대해 용량 의존적인 억제 활성을 나타냈다. 특히 YLZ 500 mg/kg 경구투여군은 17β-estradiol 0.03 μg/head 피하 투여군과 유사한 결과를 보였다(Table 5, Fig. 3).

Table 5. Changes on the Abdominal Fat Pad, Uterus and Liver Weights in OVX Mice

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*OVX : Ovariectomy, †YLZ : Yuklinzu aqueous extracts​​​​​​​

Fig. 3. Representative abdominal fat pad gross image.

Scale bar=12 mm​​​​​​​

4. 자궁·간 중량의 변화

모의 수술군 대비 OVX 대조군에서 자궁의 절대·상대 습중량 및 간의 상대 습중량의 유의한(p<0.01) 감소가 나타났다. 한편 모든 약물 투여군에서 OVX 대조군 대비 자궁 무게 및 간의 상대 중량의 유의한(p<0.01) 증가가 관찰되었고, YLZ 경구 투여군은 OVX로 유도된 자궁의 위축성 변화 및 간의 상대 중량의 감소에 대해 용량 의존적인 억제 활성을 보였다. 특히 YLZ 500 mg/kg 경구투여군은 17β-estradiol 0.03 μg/head 피하투여군과 유사한 효과를 나타냈다(Table 5, Fig. 4).

Fig. 4. Representative uterus gross image.

Scale bar=13 mm

5. 뼈 중량

OVX 대조군에서 모의 수술군 대비 대퇴골의 상대 습중량, 절대 및 상대 건중량·회중량의 유의한(p<0.01) 감소가 관찰되었다. 한편 모든 약물 투여군에서 OVX 대조군 대비 대퇴골 상대 습중량과 절대 및 상대 건중량·회중량의 유의미한(p<0.01 or p<0.05) 증가가 입증되었다. 특히 YLZ 경구투여군은 OVX에 의해 유도된 대퇴골 습중량·건중량·회중량의 감소에 대해 용량 의존적인 억제 활성을 보였으며, YLZ 500 mg/kg 경구투여군의 경우 17β-estradiol 0.03 μg/head 피하투여군과 유사한 효과를 나타냈다(Table 6).

Table 6. Right Femur Weights

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*OVX : Ovariectomy, †YLZ : Yuklinzu aqueous extracts

6. 혈청 생화학 검사(AST, ALT, TC, LDL, HDL, TG)

OVX 대조군에서 모의 수술군 대비 혈청 AST, ALT, TC, LDL, TG 증가 및 혈청 HDL 감소가 유의미하게 관찰되었으며, OVX 대조군 대비 모든 약물 투여군에서 혈청 AST, ALT, TC, LDL, TG의 감소 및 혈청 HDL의 증가가 유의미하게(p<0.01) 나타났다. 특히 YLZ 경구투여군은 OVX로 유도된 혈청 AST, ALT, TC, LDL, TG 증가 및 혈청 HDL 감소에 대해 용량 의존적인 억제 활성을 나타내었으며, YLZ 500 mg/kg 경구투여군의 경우 17β-estradiol 0.03 μg/head 피하투여군과 유사한 효과를 보였다(Table 7).

Table 7. Serum Biochemistry - AST, ALT, TC, LDL, HDL and TG Levels

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*AST : aspartate aminotransferase, †ALT : alanine aminotransferase, ‡TC : total cholesterol, §LDL : low density lipoprotein, ∥HDL : high density lipoprotein, TG : triglyceride, **OVX : Ovariectomy, ††YLZ : Yuklinzu aqueous extracts

7. 혈청 생화학 검사(Estradiol, Osteocalcin, bALP)

OVX 대조군에서 모의 수술군 대비 혈청 estradiol, bALP 감소 및 osteocalcin 증가가 유의미하게 관찰되었으며, 모든 약물 투여군에서 OVX 대조군 대비 혈청 estradiol, bALP 증가 및 osteocalcin 감소가 유의미하게(p<0.01) 나타났다. 특히 YLZ 경구 투여군은 OVX로 유도된 혈청 estradiol, bALP 감소 및 osteocalcin 증가에 대해 용량 의존적인 억제 활성을 보였으며, YLZ 500 mg/kg 경구투여군의 경우 17β-estradiol 0.03 μg/head 피하투여군과 유사한 효과를 나타냈다(Fig. 5~7).

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Fig. 5. Serum estradiol levels.

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Fig. 6. Serum osteocalcin levels.

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Fig. 7. Serum bALP levels.​​​​​​​

8. 체지방 밀도, 골밀도, 뼈 강도(FL)에 대한 영향

OVX 대조군에서 전신·복부 체지방 밀도의 증가, 전신·대퇴골 평균 골밀도 및 대퇴골 중간축 강도의 감소가 유의미하게 관찰되었으며, 모든 약물 투여군에서 OVX 대조군 대비 전신·복부 체지방 밀도의 감소, 전신·대퇴골 평균 골밀도 및 대퇴골 강도의 증가가 유의하게(p<0.01) 나타났다. 특히 YLZ 투여군은 OVX로 유도된 체지방 밀도 증가, 골밀도 및 대퇴골 강도 감소에 대해 용량 의존적인 억제 활성을 보였으며, YLZ 500 mg/kg 경구 투여군은 17β-estradiol 0.03 μg/head 피하 투여군과 유사한 효과를 나타냈다(Table 8, Fig. 8).

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Fig. 8. Representative whole body DEXA image.

Table 8. Fat Density, Bone Mineral Density and Femur Strength

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*OVX : Ovariectomy, †YLZ : Yuklinzu aqueous extracts

9. 조직병리학적 분석(복부 지방체, 자궁, 간)

OVX 대조군에서 복부 지방체 두께 및 평균 지방세포 직경의 증가, 자궁(전체, 점막, 상피) 두께와 자궁내막샘 비율의 감소, 지질 침착에 의한 간세포의 지방성 변화 영역의 비율 및 평균 직경의 증가가 유의미하게(p<0.01) 관찰되었다. 한편 모든 약물 투여군은 OVX 대조군에서 관찰된 상기 변화에 대해 유의한(p<0.01) 개선 효과를 나타내었으며, YLZ 경구투여군은 OVX로 유도된 복부 지방체, 자궁, 간의 변화에 대해 용량 의존적인 억제 활성을 보였다. 특히 YLZ 500 mg/kg 경구투여군의 경우 17β-estradiol 0.03 μg/head 피하투여군과 유사한 효과를 보였다(Table 9, Fig. 9~11).

Fig. 9. Representative abdominal fat pads histological images.

All hematoxylin and eosin stain, Scale bars =120 μm

Fig. 10. Representative left uterus horn histological images.

L : Lumen, MU : Mucosa, ML : Muscular layer, UG : Uterine gland, All Hematoxylin and eosin stain, Scale bars=120 μm

Fig. 11. Representative liver left lateral lobe histological images.

CV : Central vein, PT : Portal Triad, Scale bars=120 μm​​​​​​​

Table 9. Histomorphometry - Abdominal Fat Pads, Uterus and Liver

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*OVX : Ovariectomy, †YLZ : Yuklinzu aqueous extracts, ‡Th : thickness, §DM : diameter, ∥Epi : epithelium, UG : uterine gland, **FC : fatty change

10. 조직병리학적 분석(대퇴골 골밀도 및 골흡수)

OVX 대조군은 모의 수술군 대비 대퇴골의 TV/BV, Tbn, Tbt, Tbl, Cbt 감소 및 Ocn, OS/BS 증가가 유의하게(p<0.01) 관찰되어 전형적인 골다공증성 조직 변화가 입증되었다. 반면 모든 약물 투여군은 골다공증 억제 효과를 보였으며, YLZ 경구투여군은 OVX로 유도된 골다공증에 대해 용량 의존적인 억제 활성을 나타냈다. 특히 YLZ 500 mg/kg 경구투여군은 17β-estradiol 0.03 μg/head 피하투여군과 유사한 결과를 보였다(Table 10, Fig. 12).

Table 10. Histomorphometry - Bone Mass and Resorption of Left Femur

BOGHBE_2023_v36n4_1_t0010.png 이미지

*OVX : Ovariectomy, †YLZ : Yuklinzu aqueous extracts, ‡Tbn : trabecular bone number, §Tbl : trabecular bone length, ∥Tbt : trabecular bone thickness, Cbt : cortical bone thickness, **Ocn : osteoclast cell number, ††OS/BS : osteoclast cell surface/bone surface (%)​​​​​​​

BOGHBE_2023_v36n4_1_f0012.png 이미지

Fig. 12. Representative left femur histological images.

Cb : cortical bone, Tb : trabecular bone, Bm : bone marrow, Gp : growth plate, All Safranin O stain, Scale bars=240μm​​​​​​​

Ⅳ. 고찰

갱년기란 노화로 인한 난소 기능의 쇠퇴로 여성의 생식 능력을 점차 상실해가는 시기를 의미하며, 이때 에스트로겐 감소에 의해 나타나는 다양한 증상을 통틀어 갱년기장애라고 한다1). 난소 부전이 여성의 건강에 미치는 영향을 최소화하기 위해 폐경 후 호르몬 대체요법이 권장되기도 하였으나, 장기간 적용 시 심혈관 질환, 유방암, 혈전증 등 부작용 발생 가능성이 지속적으로 보고되고 있다2). 이에 갱년기장애를 완화할 수 있는 대체요법에 관한 연구가 꾸준히 이루어지고 있는데 그중 대표적인 것으로 식물성 에스트로겐(phytoestrogen)이 있다22). phytoestrogen은 화학 구조 및 기능이 에스트로겐과 유사하여 생체 내에서 에스트로겐 모방체로 작용하며, 다양한 조직에서 ER-α, ER-β에 결합하여 약한 에스트로겐 유사효과를 발휘한다23,24). 특히 식물유래 isoflavone은 다양한 생물학적 활성을 가지고 있어 갱년기 대사 이상 및 골다공증 개선 효과를 나타낸다3,4).

毓麟珠는 ≪景岳全書≫에 최초로 수록된 처방으로 腎虛로 인한 不姙, 月經不調, 經閉 등 부인과 영역에서 다양하게 활용되고 있다5). 본 연구에서는 심혈관 질환, 비만, 고지혈증, 골다공증, 지방간 등 여성 갱년기 모델과 유사한 양측 난소적출(OVX) ddY 마우스를 대상으로 毓麟珠 열수 추출물(YLZ)을 투여하여 毓麟珠의 갱년기 장애 개선 효과 및 최적의 용량을 관찰하고자 하였다.

본 연구에서는 YLZ의 갱년기장애 개선 효과를 에스트로겐 유사효과, 항비만 효과, 혈중 지질 저하 효과, 지방간에 대한 간 보호 효과, 골다공증 억제 효과 등 5가지 범주로 구분하였으며9,10), OVX를 시행한 마우스에 YLZ(수율 18.42%) 500, 250, 125 mg/kg의 각기 다른 용량을 84일간 1일 1회 경구투여하여 17β-estradiol 0.03 μg/head/day 피하투여군과 각 효과를 비교 분석하였다.

YLZ의 항비만 및 에스트로겐 유사효과를 관찰하기 위해 체중, 사료 섭취량, 혈청 estradiol 수치, 체지방 및 복부 지방 밀도, 복부 지방체(총 두께 및 평균 지방세포 직경), 자궁(전체, 점막 및 상피 두께, 자궁샘 비율) 등 변화를 조사하였다. 또한, YLZ의 간 보호 효과를 관찰하기 위해 간 중량, 혈청 AST·ALT 평가 및 조직병리학적 검사(평균 지방세포 직경 및 지방간 비율)를 시행하였고, 혈중 지질 저하 효과를 파악하기 위해 혈청 TC, LDL, HDL, TG 변화를 관찰하였다. 마지막으로 YLZ의 골다공증 억제 효과를 알아내기 위해 대퇴골 평균 골밀도, 우측 대퇴골 습중량·건중량·회중량, 골 강도(FL), 혈청 Osteocalcin 및 bALP, 골 질량 및 구조, 좌측 대퇴골 골흡수에 대한 조직병리학적 분석을 시행하여 17β-estradiol 0.03 μg/head/day 피하 투여군의 실험 결과와 비교하였다13-5).

YLZ가 복합한약제제의 열수 추출물임을 고려하여 최고, 중간, 최저 투여량으로 각각 500, 250, 125 mg/kg이 선택되었다6-8). 17β-estradiol 투여량은 이전 연구를 참고하여 0.03 μg/head/day로 설정하였다13-5). YLZ 투여군은 OVX 28일 후부터 YLZ를 50, 25, 12.5 mg/ml의 농도로 각각 멸균 증류수에 직접 용해시켜 체중(kg) 당 10 ml의 용량(500, 250, 125 mg/kg)으로 1일 1회씩 84일간 경구투여했으며9,10), 17β-estradiol 투여군은 OVX 28일 후부터 17β-estradiol 0.03 μg을 멸균 식염수 0.2 ml에 섞어 1일 1회씩 84일간 등에 피하투여하였다13-5). OVX 대조군과 모의 수술군에는 동일한스트레스 조건을 제공하기 위해 한약제제 대신 증류수만 같은 양과 기간만큼 경구 투여하였다.

이 실험에서 OVX를 시행한 후 체중, 사료 섭취량, 복부 지방체 무게 및 혈청 AST·ALT·TC·LDL·TG·osteocalcin의 증가와 혈청 HDL·bALP·estradiol, 자궁·간·대퇴골 중량 및 대퇴골 골밀도·강도의 감소가 현저하게 나타났다(Table 4~9, Fig. 2~8). 또한 조직병리학적 분석 결과 OVX 대조군에서 모의 수술군에 비해 지방세포의 현저한 비대, 지방간, 자궁의 위축성 변화, 대퇴골 골밀도 감소, 골흡수 표지의 뚜렷한 증가가 관찰되었다. 이러한 결과는 폐경 후 발생하는 비만, 고지혈증, 지방간, 골다공증 등이 난소 기능 쇠퇴로 인한 에스트로겐 결핍에 의해 유발되었음을 시사한다. 한편 OVX 시행군에 17β-estradiol, YLZ 500, 250, 125 mg/kg를 각각 84일간 연속 투여한 결과 에스트로겐 결핍과 관련된 갱년기 증상이 유의하게 억제되었다. 특히 YLZ 투여군은 OVX로 유발된 갱년기 증상에 대해 명확한 용량 의존적 억제 활성을 보였으며 YLZ 500 mg/kg 경구투여군의 경우 17β-estradiol 0.03 μg/head 피하투여군과 유사한 효과를 나타냈다. 이로써 YLZ 500 mg/kg 경구투여가 OVX 마우스에 대해 17β-estradiol 0.03 μg/head 피하투여와 흡사한 갱년기장애 개선 효과가 있는 것으로 간주할 수 있다.

에스트라디올(E2)은 소화관 호르몬에 속하는 외인성 및 내인성 콜레시스토키닌(CCK)의 유효성을 증가시키며, 식욕을 제어하는 되먹임 기전에 관여하여 체중을 변화시킬 수 있는 것으로 알려져 있다25). 즉 E2 저하는 일시적 또는 지속적인 식욕 및 체중 증가를 일으켜 폐경 후 비만 유병률 상승의 원인이 된다26). 이전 연구에서 OVX 마우스의 에스트로겐 결핍은 사료 섭취량의 심각한 증가 및 복부 지방 축적을 초래하였으며27), 본 연구에서도 OVX는 현저한 사료 섭취량 증가와 그에 따른 지방세포 비대, 체중 증가 및 복부 지방 침착을 유도하였다. 한편 YLZ 투여군은 에스트로겐 결핍으로 유도된 비만에 대해 용량 의존적으로 억제 활성을 보였으며 특히 YLZ 500 mg/kg 경구투여군의 경우 17β-estradiol 0.03 μg/head 피하투여군과 유사한 결과를 나타내어 YLZ의 항비만 효과를 시사하였다. 또한 17β-estradiol 0.03 μg/head 피하투여군은 최초 투여 56일 후부터 OVX 대조군 대비 현저한 사료 섭취량 감소를 나타내어 이전 연구28)와 비슷한 결과를 보였으며 YLZ 투여군 또한 최초 투여 56일 후부터 OVX 대조군 대비 용량 의존적으로 사료 섭취량의 현저한 감소를 나타내었다. 비록 이 실험에서 에스트로겐성 사료 섭취에 의한 영향 등을 완전히 배제할 수 없으나 YLZ가 항비만 효과에 관여하고 있음을 확인할 수 있었다. 향후 본 실험을 통해 밝혀진 YLZ의 항비만 효과를 포함한 보다 상세한 연구가 필요할 것으로 사료된다.

에스트로겐은 여성 생식기뿐만 아니라 골격계 심혈관계 등 여러 기관의 조절 및 작용에 중요한 임무를 수행하므로 여성의 폐경에 의한 에스트로겐 결핍은 다양한 증상을 유발한다29). 본 연구에서도 OVX로 유도된 혈청 E2 감소가 자궁의 위축성 변화로 인한 자궁 무게의 현저한 감소를 일으키는 것을 확인할 수 있었다. 한편 모든 약물 투여군에서 자궁의 위축성 변화에 대한 억제 효과를 보였으며, YLZ의 경우 투여량이 증가할수록 효과가 뚜렷하였다. 본 연구 결과 OVX에 의한 자궁의 위축성 변화에 대해 YLZ 500 mg/kg 경구투여가 17β-estradiol 0.03 μg/head 피하투여와 견줄 만한 억제 효과가 있음을 알 수 있었으나, 더욱 상세한 기전은 향후 추가 연구가 필요할 것으로 사료된다.

에스트로겐 결핍은 혈중 지질 수준에 영향을 미쳐 죽상경화성 심혈관 질환 발병 위험을 증가시킨다30). 본 연구에서 OVX는 혈청 TC·LDL·TG 증가 및 HDL 감소를 유의미하게 유발하였는데, 이는 종전 연구31) 결과와 일치한다. 본 연구 결과 17β-estradiol 피하투여 시 OVX 대조군 대비 TC·LDL 수치가 유의하게 감소한 것 또한 이전 연구 결과와 일치한다27,32). OVX로 유도된 고지혈증은 YLZ 경구투여군에서 용량 의존적으로 유의한 억제 활성을 보였으며, YLZ 500 mg/kg 경구 투여군의 경우 17β-estradiol 0.03 μg/head 피하투여군과 유사한 효과를 나타냈다. E2의 혈청 지질 저하 효과는 콜레스테롤 합성에 관여하는 율속효소(rate-limiting enzyme)인 HMG-CoA의 활성을 억제함으로써 이루어지는데33), 본 연구 결과를 토대로 YLZ가 HMG-CoA 활성 억제를 유발하여 OVX로 유발된 고지혈증에 대한 개선 효과가 있다는 직접적인 증거로 간주할 수 있다.

OVX에 의한 에스트로겐 결핍은 비만, 고지혈증 외에 지방간 또한 초래할 수 있다34). 이전 연구를 통해 OVX를 시행한 설치류에서 간세포의 비대 및 지방성 변화와 함께 간 손상과 관련된 혈청 생화학적 지표인 AST·ALT의 상승이 동반되는 것으로 밝혀진바 있다34). 한편 본 연구에서 OVX에 의해 유도된 지방간이 YLZ 경구 투여군에서 용량 의존적으로 유의하게 억제되었으며, YLZ 500 mg/kg 경구투여군의 간 보호 효과는 17β-estradiol 0.03 μg/head 피하투여군과 비슷하다는 것을 알 수 있다.

골다공증은 알려진 대로 에스트로겐 결핍과 깊은 관련이 있으며, OVX 동물 모델은 뚜렷한 에스트로겐 결핍을 나타내어 기존 연구에서 골다공증 치료제 효과 평가를 위한 유용한 모델로 이용되어 왔다11,12). OVX 후 골다공증이 진행됨에 따라 혈청 osteocalsin 수치는 일반적으로 골 교체의 증가와 함께 상승하나 혈청 bALP 함량은 골형성 억제에 따라 급격하게 감소한다35). 또한 골밀도와 뼈 강도의 현저한 감소36) 및 섬유골·피질골의 조직학적 변화, 골형성 지표의 감소 및 골흡수 지표의 증가를 보인다37). 본 연구 또한 기존 연구 결과와 일치하였으며 이는 OVX가 에스트로겐 결핍에 의한 골다공증을 유도하였음을 시사한다. 한편 OVX 마우스에서 유발된 골다공증은 모든 약물 투여군에서 유의하게 억제되었고 YLZ는 용량 의존적으로 골다공증 개선 효과를 나타냈으며, YLZ 500 mg/kg 경구투여군은 17β-estradiol 0.03 μg/head 피하투여군과 효과가 유사함을 확인하였다.

위 결과를 종합하면 毓麟珠 열수 추출물(YLZ)은 갱년기장애, 즉 폐경 후 에스트로겐 결핍에 의한 비만·고지혈증·지방간·골다공증 개선을 위해 유효하게 사용될 수 있을 것으로 생각된다. 또한, YLZ는 각기 다른 유효성분을 가진 12가지 한약재로 구성되어 있으므로 향후 생물학적 활성 화합물에 대한 검토 및 개별 약재의 생리활성 및 효능 등에 관한 추가적인 연구가 수행되어야 할 것으로 생각된다.

Ⅴ. 결론

본 연구에서는 毓麟珠 열수 추출물(YLZ)의 갱년기장애 개선 효과를 알아보기 위해 OVX를 시행한 마우스에 YLZ 500, 250, 125 mg/kg를 경구투여하여 17β-estradiol 0.03 μg/head 피하투여군과 비교 후 아래와 같은 결과를 얻었다.

1. YLZ는 OVX로 유도된 비만을 유의하게 억제하였다(p<0.01).

2. YLZ는 OVX로 유도된 자궁의 위축성 변화를 유의하게 개선하였다(p<0.01).

3. YLZ는 OVX로 유도된 혈중 TC·LDL·TG 증가 및 HDL 감소를 개선하였다.

4. YLZ는 OVX로 유도된 간세포의 비대, 지방성 변화 및 혈청 AST·ALT 증가를 개선하였다.

5. YLZ는 OVX로 유도된 골다공증에 대하여 유의한 개선 효과를 보였다(p<0.01).

6. OVX로 유도된 비만, 고지혈증, 지방간, 골다공증에 대한 YLZ 500 mg/kg 경구투여군의 효과는 17β-estradiol 0.03 μg/head 피하투여군과 유사한 것으로 나타났다.

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