Korean Journal of Fisheries and Aquatic Sciences (한국수산과학회지)

The Korean Society of Fisheries and Aquatic Science (한국수산과학회)
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Characterization of the Novel Marine Bacterium Planococcus sp. 107-1T

신종 해양미생물 Planococcus sp. 107-1T의 분류학적 특성 분석

  • Kim, Dong-Gyun (Biotechnology Research Division, National Institute of Fisheries and Science) ;
  • Jung, Hyun-Kyoung (Biotechnology Research Division, National Institute of Fisheries and Science) ;
  • Kim, Young-Ok (Biotechnology Research Division, National Institute of Fisheries and Science) ;
  • Kong, Hee Jeong (Biotechnology Research Division, National Institute of Fisheries and Science) ;
  • Nam, Bo-Hye (Biotechnology Research Division, National Institute of Fisheries and Science) ;
  • Kim, Ju-Won (Biotechnology Research Division, National Institute of Fisheries and Science) ;
  • Kim, Young-Sam (Biotechnology Research Division, National Institute of Fisheries and Science)
  • 김동균 (국립수산과학원 양식산업연구부 생명공학과) ;
  • 정현경 (국립수산과학원 양식산업연구부 생명공학과) ;
  • 김영옥 (국립수산과학원 양식산업연구부 생명공학과) ;
  • 공희정 (국립수산과학원 양식산업연구부 생명공학과) ;
  • 남보혜 (국립수산과학원 양식산업연구부 생명공학과) ;
  • 김주원 (국립수산과학원 양식산업연구부 생명공학과) ;
  • 김영삼 (국립수산과학원 양식산업연구부 생명공학과)
  • Received : 2022.08.04
  • Accepted : 2022.10.17
  • Published : 2022.10.31
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Abstract

A novel Gram-positive, motile, non-spore forming aerobic marine bacterium, designated 107-1T was isolated from tidal mud collected in Gyehwa-do, South Korea. Cells of strain 107-1T were short rod or coccoid, oxidase negative, catalase positive and grew at 10-40℃ (with optimum growth at 25-30℃). It utilized menaquinones MK-7 and 8 as its respiratory quinones and its major fatty acids were anteiso-C15:0 (37.9%), iso-C16:0 (14.9%), and iso-C14:0 (10.8%). Phylogenetic analysis based on 16S rRNA gene sequences revealed a distinct clade containing strain 107-1T and close species Planococcus ruber CW1T(98.52% sequence similarity), P. faecalis KCTC 33580T(97.67%), P. kocurii ATCC 43650T(97.48%), P. donghaensis DSM 22276T(97.47%), and P. halocryophilus DSM 24743T(97.37%). Strain 107-1T contains one circular chromosome (3,513,248bp in length) with G+C content of 44.6 mol%. Estimated ranges for genome to genome distance, average nucleotide identity, and average amino acid identity comparing strain 107-1T with close taxa were 20.3-34.8%, 77.9-86.9%, and 73.6-92.8%, respectively. Based on polyphasic analysis, strain 107-1T represents a novel species belonging to the genus Planococcus.

Keywords

서론

해양환경은 생물자원의 보고로 현재까지 탐사되지 않은 영역이 큰 부분을 차지하고 있으며, 해양환경에 서식하는 생물자원으로부터 다양한 천연화합물이 지속적으로 분리, 보고되고 있다(Montaser and Luesch, 2011; Jiménez, 2018). 해양 생물자원의 중요한 부분을 차지하는 미생물은 그 특성이 매우 특이하며 새로운 천연물질의 주요 생산자로써 지속적 연구대상이 되고 있다. 단적인 예를 들어 향료와 의약품의 원료인 테르페노이드(이소프레노이드)는 주로 해양 진핵생물로부터 유래하였지만, 지난 20년간 지속된 연구를 통해 Actinomycetes와 같은 미생물이 새로운 테르페노이드 생산자로 알려지고 있으며(Helfrich et al., 2019; Moghaddam et al., 2021), 또 다른 유용물질 미사키놀라이드와 노카파이론은 바다 해면과 해양 연체동물로부터 유래된 것으로 생각되었지만, 연구를 통해 해면과 연체동물 내부 공생미생물들에 의해 생성되는 것으로 밝혀져 유용물질을 생산하는 해양생물 내부 공생미생물확보와 관련연구 또한 활발히 진행되고 있다(Bhushan et al., 2017; Moghaddam et al., 2021). 또한 2014년 나고야 의정서 결의로 생물자원의 확보만으로도 간접적 이익을 얻을 수 있으며, 타 국가 생물자원 이용으로 발생한 이익을 공유하게 되어 탐사되지 않은 해양환경으로부터 잠재적 신규 생물자원을 확보하기 위한 경쟁이 더욱 치열해 질것으로 예상된다.

본 연구에서는 다양한 유용 활성이 보고된 Planococcus속에 속한 새로운 종 단위 균주 107-1T을 해양 환경으로부터 순수 분리하였다. 연구 대상 균주가 속한 Planococcus속은 1894년 처음으로 보고된 이래 현재까지 토양(See-Too et al., 2017), 해수(Yoon et al., 2003), 영구 동토층(Mykytczuk et al., 2012), 펭귄분변(Kim et al., 2015), 염전(Yoon et al., 2010) 등 다양한 환경에서 분리된 총 32개 종 단위 분류군들을 포함하고 있다. Planococcus 속 분류군들은 대체로 내냉성, 호염성 그람양성 균주로 알려져 있으며(Kocur et al., 1970), 프로바이오틱스 균주로써 병원성 세균에 대한 저항성 향상(Li et al., 2021), 새로운 카로티노이드 색소 생성(Moyo et al., 2022)과 오염수 정화(Majumdar et al., 2019), 탄화수소 분해(Engelhardt et al., 2001), 그리고 생물계면활성제(Ebrahimipour et al., 2014) 생성과 같은 유용 특성들을 가지는 것으로 보고되었다. 또한 현재까지 보고된 Planococcus 속 균주 중 영하의 온도에서도 생장이 가능한 종들(Mykytczuk et al., 2012, 2013; Kim et al., 2015)이 보고되어 저온 환경에 적용 가능한 미생물 제제, 효소 등의 연구 개발 가능성 또한 존재한다.

본 연구에서는 과거 서해안 갯벌 미생물 생태조사 수행 중 확보, 보존된 다양한 균주들 가운데 16S rRNA 유전자 서열 분석을 통해 색소 생성 신종 균주 107-1T을 분리하였다. 본 연구는 균주 107-1T을 계통학적으로 동정하여 기존 Planococcus 분류군들과의 분류학적 차이를 비교, 입증하여, 균주 107-1T이 Planococcus 속 내 근연 분류군들과 구분되는 새로운 미생물 분류군임을 구명함과 신종 미생물 자원 확보를 위해 형태, 생리, 생화학, 계통, 유전학적 시험 등 다면적 분석을 수행하였다.

재료 및 방법

균주 순수분리

균주의 분리를 위해 전라북도 부안군 계화도 간척지에서 채집한 갯벌 시료 0.1 g을 phosphate buffered saline (PBS; Gibson, Scotland, UK)용액을 이용하여 10-5의 농도로 희석하였고, 희석액 100 μL를 marine agar (MA; Difco, Franklin, NJ, USA)배지에 도말 접종 후 20°C에서 3일간 배양하였다. 배양 과정을 통해 증식한 다양한 균주 집락 중 색소를 생성하는 집락은 동일한 배지 및 조건을 적용하여 두 차례 반복 분리를 수행하여 순수분리 하였고, 순수 분리된 균체는 차후 염기서열분석을 위해 20% glycerol-PBS (v/v) 용액에 현탁 후 -80°C에 보존하였다.

유전자 서열 및 계통학적 분석

순수 분리된 균주들의 16S rRNA 유전자 서열 확보를 위해 DNA 추출 및 16S rRNA 유전자 증폭을 수행하였다. DNA 추출에는 20°C에서 3일간 순수배양된 균주의 균체와 MiniBest bacterial DNA extraction kit (TaKaRa, Kusatsu, Japan)를 이용하였고, 유전자 증폭을 위해 유전자 양끝 말단 서열과 상보적인 8F (5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)와 1492R(5′-GGYTACCTTGTTACGACTT-3′) 프라이머를 이용하여 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)을 수행하였다(Weisburg et al., 1991). PCR은 pre-denaturation 95°C 3분, 35 cycle의 denaturation 95°C 30초, annealing 52°C 30초, extension 72°C 1분 30초, 그리고 final extension 72°C 3분의 조건 하에 20 μL 스케일로 AccuPower® PCR premix (K-2016; Bioneer, Daejeon, Korea)를 이용하여 수행하였다. 유전자 증폭 여부는 1% 아가로즈겔 전기영동을 통해 확인하였고, 증폭이 확인된 PCR 산물은 QIAquick PCR purification kit (QIGEN, Germantown, MD, USA)를 이용하여 정제 후, sanger 서열 분석 장비(3730XL; Applied Bioscience, Beverly Hills, CA, USA)를 이용한 서열 분석의 주형으로 사용하였다.

서열 분석 결과 확보된 균주들의 16S rRNA 유전자 서열은 Bioedit 프로그램(Hall, 1999)을 이용한 품질 평가 후 EZBiocloud 웹 데이터베이스(https://www.ezbiocloud.net/; Yoon et al., 2017) 상에서 기존 분류군에 대한 유사도 비교에 사용하였으며, 확보된 서열 중 기존 분류군 대비 가장 낮은 서열 유사도를 나타낸 균주 107-1T이 확인되었다. 이 후 계통학적 분석을 위해 균주 107-1T과 높은 유사도는 나타내는 Planococcus 속과 Sporosarcina 속 분류군들의 16S rRNA 서열, 그리고 계통학적 분석에 아웃 그룹으로 사용할 Bacillus subtilis NCIB 3610T 균주의 서열을 포함하여 총 40개 서열을 수집하였다. 수집한 서열은 MEGA 7 프로그램(Kumar et al., 2016)의 MUSCLE (Edgar, 2004) 서열 분석도구를 이용하여 상보적 서열을 정렬하였으며, 이어서 동일 프로그램의 neighbor-joining, maximum likelihood, 그리고 maximum parsimony 알고리즘을 이용한 계통학적 분석을 수행하였다.

형태 및 생리학적 분석

균주 107-1T의 성장 온도 범위는 균주를 MA 배지에 획선 접종하여 4–45°C 구간 5°C 간격 배양온도별 균집락 형성 양상을 확인하여 판단하였다. 형태학적 특성 조사를 위해 성장 온도 범위 실험 중 확인된 최적온도 30°C에서 MA 배지상 2일간 배양된 균집락으로부터 균체를 확보하여 그람염색, 포자염색, 편모염색을 각각 Remel gram stain kit (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA), Schaeffer and Fulton spore stain kit (Millipore, Brulington, MA, USA), 그리고 Leifson flagella stain kit (Fisher Science, Waltham, MA, USA)를 이용하여 수행하였고, 운동성 관찰을 위해 hanging drop (Bernardet et al., 2002)을 이용하여 광학현미경(BX40; Olympus, Tokyo, Japan)을 이용하여 균체 형태, 크기 및 염색 여부, 그리고 운동성을 관찰하였다.

다양한 기질에 대한 이용능력을 관찰하기 위해 API 20NE, 20E, 50CH, 그리고 ZYM (bioMérieux, Marcy-l'Etoile, France) 키트를 활용하였다. 키트 접종을 위해 MA 배지상 30°C, 2일간 배양된 균체를 접종액에 혼탁하였고, Mcfarland standard와 혼탁도 비교 후 접종, 배양하였다. 접종된 API 20NE, 20E, 50CH는 2일, 그리고 ZYM은 1일 배양 후 각각 지시약을 이용하여 반응 여부를 관찰하였다. 접종에 사용된 균체 일부는 1% (w/v) tetramethyl p-phenylenediamine (bioMérieux)를 이용한 oxidase 활성 테스트와 3% (v/v) 과산화수소수를 이용한 catalase 활성 테스트에 사용하였고, 각각의 반응은 용액의 발색과 기포 생성여부를 관찰하여 판별하였다.

생화학적 분석

균체 지방산 조성비 분석을 위해 MA 배지상 30°C, 2일간 배양된 균체로부터 microbial identification protocol (MIDI; Sasser, 1990)에 따라 지방산을 분리, 정제하였으며, 분리된 지방산은 gas chromatography (GC; Hewlett Packard 6890; HP, Palo Alto, CA, USA)와 Sherlock 프로그램(버전 6.3)을 이용하여 정성, 정량 분석하였다. 균체 퀴논 조성 분석에는 동일한 배지, 조건하에서 배양한 균체로부터 기존에 보고된 퀴논 정제법(Minnikin et al., 1984; Komagata and Suzuki, 1988)에 따라 퀴논을 분리, 정제하였으며, 정제 퀴논은 highperformance liquid chromatography (HPLC; e2695; Waters, Milford, MA, USA)와 역상 컬럼(C18, 5 μm, 4.6×250 mm; SunFire, Ireland), 그리고 이동상(methanol-heptane 혼합액, 90:10, v/v)을 이용하여 0.2 mL/분의 전개 속도로 분리하였다. 정제된 퀴논의 타입은 동일한 조건하에 전개된 표준물질 menaquinone MK-7 (vitamin K2; Merck, Rahway, NJ, USA), 그리고 Jeotgalibacillus alimentarius (KCCM 41826)의 MK-8과 비교 분석을 통해 확인하였다(Reddy et al., 2007).

유전체 분석

균주 107-1T의 전장 유전체 확보와 분석을 위해 MA 배지상 30°C, 2일간 배양된 균체로부터 MiniBest bacterial DNA extraction kit (TaKaRa)를 이용하여 genomic DNA를 추출 및 정제하였다. 정제된 DNA의 정량과 순도는 분광광도계(ND-1000; Thermo Scientific)를 사용하여 각각 230 nm, 260 nm, 그리고 280 nm 파장대의 흡광도를 측정하여 판단하였고, 260/230 nm, 260/280 nm 값이 각각 1.8 이상인 정제 DNA 약 10 μg을 차세대염기서열분석장치(Next-generation sequencing, NGS; Nanopore Flongle, Oxford, UK)를 이용한 서열분석에 사용하였다. Nanopore 플랫폼을 이용한 염기서열 분석시 Flongle flow cell에서 생산된 전기신호는 GUPPY base-caller (버전 3.4.3)를 이용하여 염기서열 정보로 전환되었고, basecalling 과정을 통해 확보된 서열 단편(sequence read)들로부터 Porechop 소프트웨어(버전 0.2.4)를 이용한 어뎁터 및 키메라 서열 제거가 수행되었다. 이어서 CANU assembler (버전 2.0)를 이용하여 서열단편들의 통합(assembly)과 Medaka 소프트웨어(버전 1.2.0)를 이용한 유전체 서열 완성도 향상 과정(polishing)을 거처 최종적으로 전장 유전체(whole genome sequence, WGS)를 확보하였다. NGS 분석을 통해 확보된 전장 유전체로부터 prokaryotic genome annotation pipeline (PGAP) (Tatusova et al., 2016)과 rapid annotations using subsystems technology (RAST; https://rast.nmpdr.org/rast.cgi; Aziz et al., 2008) 유전자 annotation도구를 활용하여 암호화된 유전자를 탐색하였고, 추가로 파지바이러스 서열 탐색 도구(PHASTER; https://phaster.ca/; Arndt et al., 2016)와 2차 대사산물 관련 유전자 탐색 도구(antiSMASH 6.0; Blin et al., 2021)를 사용하여 유전체 특성을 조사하였다.

유전체 기반 유사도 비교분석을 위해 참조균주 5종 Planococcus ruber CW1T (NCBI accession 번호, GCA_022819085.1), Planococcus faecalis KCTC 33580T (GCA_002009235.1), Planococcus kocurii ATCC 43650T (GCA_001465835.2), Planococcus donghaensis DSM 22276T (GCA_001687665.2), 그리고 Planococcus halocryophilus DSM 24743T (GCA_001687585.2)의 유전체, 유전자(coding sequence, CDS), 그리고 아미노산 서열을 National Center for Biotechnology Information (NCBI) GenBank database로부터 수집하였다. 이어서 균주 107-1T과 근연 분류군들의 유전체 유사도 분석을 위해 genome to genome distance calculator (GGDC 2.1, formula2; http://ggdc.dsmz.de/; Auch et al., 2010; Meier-Kolthoff et al., 2013)를, CDS 서열 유사도 분석에 average nucleotide identity calculator (ANI; www.ezbiocloud.net/tools/ani; Lee et al., 2016; Yoon et al., 2017)를, 그리고 아미노산 서열 유사도 분석에 average amino acid identity calculator (two-way AAI; http://enve-omics.ce.gatech.edu/aai; Rodriguez-R and Konstantinidis, 2014)를 각각 활용하였다. 균주 107-1T을 포함한 모든 균주의 단백질 암호화 유전자 중 공통적(core), 특이적(unique) 유전자 탐색에는 pan-genome analysis pipeline (PGAP; Zhao et al., 2012) 분석 도구를 활용하였고, 도구 내 GeneFamily 모델, 단백질 서열 비교에 30% identity, E-value 10-5이하 기준치를 적용하였다.

결과 및 고찰

계통학적 분석

균주 107-1T의 16S rRNA 유전자 서열 비교 결과 Planococcus, Metaplanococcus, Sporosarcina, Chryseomicrobium, 그리고 Psychrobacillus 속에 포함된 39개 균주들과 98.52–94.75%의 유사도를 나타내었다. 높은 유사도를 나타낸 상기 분류군들과의 계통학적 분석 결과 균주 107-1T은 Planococcus 속 분류군 Planococcus ruber CW1T (서열 유사도 98.52%; Wang et al., 2017), P. faecalis KCTC 33580T (97.67%; Kim et al., 2015), P. kocurii ATCC 43650T (97.48%; van Hao and Komagata, 1985), P. donghaensis DSM 22276T (97.47%; Choi et al., 2007), 그리고 P. halocryophilus DSM 24743T (97.37%; Mykytczuk et al., 2012)와 함께 독립된 클레이드(clade)를 형성하여 계통학적 근연 관계를 이루고, 이 중 P. ruber CW1T과 계통학적으로 가장 밀접하게 위치하였다(Fig. 1). 따라서 본 연구에서는 계통학적 근연 분류군인 P. ruber CW1T을 포함 상기한 5개 Planococcus 종을 참조균주로 선정하여 균주 107-1T과 다면적 비교분석을 수행하였다.

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Fig. 1. Neighbour-joining tree showing the phylogenetic position of strain 107-1T and close species within the genus Planococcus. The filled circles indicate that the nodes also formed in the maximum-likelihood and maximum-parsimony trees. The unfilled circles indicate that the nodes also formed in the maximum-likelihood tree. Bar, 0.01 substitutions per nucleotide site.

형태 및 생리학적 분석

균주 107-1T은 MA 배지상 온도 범위 10–40°C에서 균집락을 형성하며, 동일 배지상 최적온도인 30°C에서 약 2 mm 직경의 노란색 원형 집락을 형성하였다. 현미경을 이용한 형태관찰 결과 균주 107-1T의 균체는 약 1–2 μm 직경의 그람 양성 단간균 또는 구균으로, 운동성을 나타나며, 포자는 관찰되지 않았다(Fig. 2). 이는 일반적인 Planococcus 속 분류군, 특히 균주 107-1T과 계통학적으로 가까운 참조균주들에게서도 관찰되는 형태적 특징인 0.6–1.2 μm 직경의 운동성을 가지는 그람 양성 구형균체와 비포자성 특성과 유사하다(Table 1).

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Fig. 2. Gram stained cells of strain 107-1T . Scale bar 10 μm.

Table 1. Characteristics of strain 107-1T and related species in the genus Planococcus

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Taxa: 1, Strain 107-1T (data from this study); 2, P. ruber CW1T(data from Wang et al., 2017); 3, P. faecalis KCTC 33580T(Kim et al., 2015); 4, P. kocurii ATCC 43650 T(Van Hao and Komagata, 1985); 5, P. donghaensis DSM 22276T(Choi et al., 2007); 6, P. halocryophilus DSM 24743T(Mykytczuk et al., 2012). +, Positive; –, Negative; w, Weakly positive; ND, No data available; v, Variable reaction.

균주 107-1T과 참조균주들의 생장온도 범위 비교결과 모든 균주들이 최고 온도 범위 30–40°C, 최적 온도 25–30°C의 유사한 범위 내에서 생장하는 것으로 확인되었다. 반면 최저 온도 범위에 있어 균주들간 큰 차이를 보였는데, 특히 균주 107-1T과 P. ruber CW1T의 최저 생장 온도는 10–15°C로 P. faecalis KCTC 33580T, P. kocurii ATCC 43650T, P. donghaensis DSM 22276T, 그리고 P. halocryophilus DSM 24743T의 최저 생장 온도 -20–5°C와 큰 차이를 보였다. 이는 각 균주들이 분리된 환경과도 밀접한 관련이 있는 것으로 추측되며, 균주 107-1T의 경우 갯벌; P. ruber CW1T, 토양(Wang et al., 2017); P. faecalis KCTC 33580T, 남극 펭귄 분변(97.67%; Kim et al., 2015); P. kocurii ATCC 43650T, 북해(북대서양) 대구 표피(van Hao and Komagata, 1985); P. donghaensis DSM 22276T, 동해 심층 저니(Choi et al., 2007); P. halocryophilus DSM 24743T, 북극 영구 동토층(Mykytczuk et al., 2012)에서 각각 분리되었다는 점에서 Planococcus 속 미생물들이 지구상 극지역 토양과 해양의 주로 저온 환경에 광범위하게 분포하고, 상기한 서식환경에서 생존을 위한 특성을 가지기까지 오랜 기간 해당 환경에 적응, 진화해 왔음을 간접적으로 보여주는 특성으로 생각할 수 있다(Table 1).

균주 107-1T의 catalase, oxidase활성, 다양한 기질 이용능력 및 효소활성 관찰결과 catalase 활성, acetoin 생성, gelatin, glycerol, D-xylose, D-glucose, D-fructose, D-mannitol, N-acetyl glucosamine, esculine, cellobiose, 이용능, 그리고 alkaline phosphatase, esterase (C4), esterase lipase (C8), leucine arylamidase, valine arylamidase, cystine arylamidase, α-chymotrypsin, acid phosphatase, naphtol-AS-BI-phosphohydrolase, β-glucosidase, α-glucosidase와 같은 효소활성을 보유하는 것으로 관찰되었다. 균주 107-1T과 참조균주들의 특이적 기질 이용능 비교결과 확인 가능한 특성 중 30여 항목의 효소활성 및 기질 이용능이 상이하였고(Table 1), 계통학적으로 가장 가까운 균주 107-1T과 P. ruber CW1T이 17개 항목(ND 제외)에 대한 차이를 나타낸 반면 하위 클레이드에 속한 P. donghaensis DSM 22276T이 5개 항목(ND, variable 제외)에 대한 차이를 나타내어 계통학적 거리와 별개로 균주간 다양한 동화 및 에너지 대사능을 나타내었다(Table 1). 본 연구에서는 최적 배양 조건 하에서 관찰된 총 70여종의 효소활성 및 기질 이용능을 비교하였지만, 참조균주들의 서식환경을 고려하여 보다 다양한 조건하에서 특성을 시험한다면 더욱 다양한 활성을 관찰할 수 있을 것으로 사료된다.

생화학적 분석

균주 107-1T의 균체를 구성하는 총 지방산 조성 분석결과 총 16종(summed feature 포함, Table 2)의 지방산이 검출되었고, 이중 10% 이상 비율을 차지하는 3종의 주요 지방산 anteiso-C15:0 (37.9%), iso-C16:0 (14.9%), 그리고 iso-C14:0 (10.8%)가 전체 비율의 63%를 구성하였다. 균주 107-1T를 포함한 모든 참조균주들의 주요 지방산으로써 anteiso-C15:0가 가장 높은 비율(37.9–65%)을 나타내었는데, 지방산 anteiso-C15:0의 미생물 저온 환경 적응과 관련하여, 저온에서 Listeria monocytogenes 세포 유지(Annou et al., 1997), Bacillus속 미생물들의 휴면기 세포 유지와 포자 형성(Diomande et al., 2015)에 대한 그 중요성이 보고된 바 있다. 본 연구에서 선정한 참조균주 중 P. faecalis KCTC 33580T (Kim et al., 2015)의 최저 생장 온도가 영하 20°C에 이르는 점과 anteiso-C15:0의 비율이 균주들 중 가장 높은 65%에 달하는 점, 그리고 모든 균주들의 공통 주요 지방산으로써 anteiso-C15:0가 가장 높은 비율을 차지한다는 점은 Planococcus 균주들의 세포를 구성하는 주요 지방산 anteiso-C15:0가 저온 적응과 밀접한 연관이 있음을 보여주는 특성이라 여겨진다.

Table 2. Fatty acid profiles of strain 107-1T and related species

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Taxa: 1, Strain 107-1T (data from this study); 2, P. ruber CW1T (data from Wang et al., 2017); 3, P. faecalis KCTC 33580T (Kim et al., 2015); 4, P. kocurii ATCC 43650T (Van Hao and Komagata, 1985); 5, P. donghaensis DSM 22276T (Choi et al., 2007); 6, P. halocryophilus DSM 24743T (Mykytczuk et al., 2012). –, Not detected; TR, trace amount (< 1.0%). Fatty acids representing < 1% in all rows were excluded. Values accounting for > 10% are marked in bold. *Summed feature 4, anteiso-C17:1 B and/or iso-C17:1 I; Summed features 5, iso-C17:1 I and/or anteiso-C17:1.

지방산 이외 균체 구성요소 중 하나인 퀴논은 세균의 에너지 생성에 필수적인 전자전달체이다. Planococcus 속 분류군으로써 균주 107-1T과 모든 참조균주들은 Planococcus 속 분류군들이 공통적으로 메나퀴논 MK-7과 MK-8 (Ludwig et al., 2011)을 주요 전자전달체로 보유하는 것으로 확인되었다.

유전체 분석

균주 107-1T의 유전체 염기서열 분석을 통해 총 105,122개의 서열단편(sequence read)이 산출되었고, 통합(assembly)과정을 거쳐 G+C 함량 44.6 mol%인 3,513,248 bp길이의 환형전장 유전체 서열을 확보하였다(Fig. 3, Table 3). 확보된 균주 107-1T의 유전체는 참조균주들의 유전체와 비교하여 가장 큰 것으로, PGAP annotation결과 CDS (coding sequence) 3,552개, rRNA 서열 27개, tRNA 서열 72개가 탐색되어 3,137개에서 3,362개의 CDS가 탐색된 참조균주의 유전체 보다 많은 유전자를 포함하였다(Table 1). RAST annotation분석결과 균주 107-1T의 유전체는 총 1,707개 subsystem 관련 유전자를 포함하여 PGAP annotation결과와 마찬가지로 참조균주를 포함한 비교대상 중 가장 많은 subsystem 관련 유전자를 보유하였고, 특히 단백질, 아미노산, 탄수화물 대사관련 유전자의 수는 참조 균주들과 비교하여 각각 최대 69%, 17.9%, 그리고 39.7% 가량 더 많은 것으로 나타났다(Table 4). 이러한 결과는 균주 107-1T이 근연(참조) 분류군들 중 잠재적으로 보다 많은 특성을 보유하고 있을 가능성을 보여주는 결과로, 균주 107-1T이 분리된 환경(갯벌)이 참조균주들이 분리된 환경보다 더욱 많은 기능을 요구하는 환경임을 간접적으로 예상할 수 있는 결과라 생각된다.

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Fig. 3. Complete genome of Planococcus sp. 107-1T . ORF, Open reading frame; CDS, Coding sequence.

Table 3. Genome features of strain 107-1T

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형태 관찰결과 편모를 관찰할 수 없었지만 RAST annotation을 통해 균주 107-1T과 모든 근연 분류군의 유전체로부터 편모 구성과 관련된 subsystem을 확인할 수 있었다(Table 4). 균주 107-1T은 근연 분류군과 동일한 편모 구성요소 관련 유전자인 flaA (flagellin protein A), flgB와 C (Flagellar basal-body rod protein B, C), FliE (Flagellar hook-basal body complex protein E), 그리고 FtsI (Peptidoglycan synthetase)를 보유하고 있는 것으로 확인되었고, P. donghaensis DSM 22276T (관찰하지 않음)을 제외한 모든 근연균주들의 극성 편모가 전자현미경을 통해 관찰되어 107-1T의 편모 존재 가능성이 높은 것으로 예상되지만, 본 연구에서 사용한 실험 수단의 한계로 인해 편모 관찰이 어려운 것으로 사료된다.

Table 4. RAST subsystem features and counts of strain 107-1T and related species

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Taxa: 1, Strain 107-1T ; 2, P. ruber CW1T ; 3, P. faecalis KCTC 33580T ; 4, P. kocurii ATCC 43650T ; 5, P. donghaensis DSM 22276T ; 6, P. halocryophilus DSM 24743T.

PHASTER tool (Arndt et al., 2016)을 이용한 균주 107-1T의 유전체 내 프로파지(prophage) 서열 탐색결과 phage integrase와 관련된 바이러스 단백질 서열이 탐색 되었지만, 그 외 프로파지 서열에서 빈번히 확인되는 핵산 중합효소나 캡시드(capsid) 단백질 또는 polymerase와 tail과 같은 온전한 바이러스를 이루는 유전자 서열은 추가로 탐색되지 않아 균주 107-1T의 유전체는 감염능력이 없는 불완전한 프로파지 서열만을 포함하는 것으로 확인되었다. 추가로 동일한 분석도구를 이용하여 근연 분류군들의 유전체에 포함된 프로파지 서열을 탐색한 결과 모든 분류군에게서 각기 다른 수의 불완전 또는 완전한 프로파지 서열이 확인되었다(Table S1). 프로파지는 자신들의 생존과 번식을 위해 숙주 세포내에서 용균성(lytic cycle) 또는 용원성(lysogeny cycle) 생활사를 가지는 흔히 기생적 존재로 알려져 있는데, 현재는 이에 더하여 숙주의 병원성과 생존성에 영향을 미치며(Fortier and Sekulovic, 2013), 나아가 숙주가 새로운 특성을 획득하는데 중요한 역할을 하여 숙주와 함께 주어진 환경에 적응, 진화해 나가는 공동진화적(co-evolve)존재로도 인식되고 있다(Menouni et al., 2015). 이러한 측면에서 균주 107-1T과 모든 근연 분류군들의 유전체에서 탐색된 불완전한 프로파지 서열들은 단순히 과거 파지바이러스들의 감염흔적만이 아닌 오랜 기간 동안 해당 균주들과 함께 진화해온 프로파지들의 흔적으로 해석할 수 있으며, 현재로선 그 흔적의 의미를 완전히 이해하는 것은 불가능하지만, 이로부터 숙주 세균이 감염되었을 당시 존재했던 파지바이러스들의 자취와 서식환경에서 숙주에게 진화학적 도움이 되었을 것 등을 짐작해볼 수 있을 것이다.

Table S1. Detected prophages of Planococcus sp. 107-1T and related species

antiSMASH를 이용한 균주 107-1T의 2차 대사산물 관련 유전자 클러스터 탐색 결과 Minimum Information about a Biosynthetic Gene cluster (MIBiG database; Satria et al., 2020) 데이터베이스 대비 83% 유사도를 가지는 온전한 카로티노이드 색소 합성 유전자 클러스터와 클러스터를 구성하는 하위 유전자들 CrtNa (4,4'-diapophytoene desaturase, 59% of identity), CrtM (4,4'-diapophytoene synthase, 50%), CrtNb (hydroxydiaponeurosporene desaturase, 54%), 그리고 GT (putative glycosyl transferase, 48%) 등이 확인되었다. 균주 107-1T과 참조 균주들의 유전체, 단백질 암호화 서열, 그리고 아미노산 서열의 유사도를 비교하기 위하여 DDGC, ANI, AAI 값을 산출한 결과, 각각 20.3–34.8%, 77.87–86.9%, 그리고 73.61–92.75%의 범위를 나타내었다(Table 1). 이러한 수치는 종 단위 분류군을 구분하는 dDDH, ANI, AAI 유사도, 각각 70%, 95%, 95%(Konstantinidis and Tiedje, 2005) 이하의 수치로, 균주 107-1T이 참조균주들과 구분되는 새로운 종 단위 분류군임을 뒷받침 한다.

판게놈 분석을 통해 균주 107-1T와 근연 분류군들이 공통(core), 일부(accessory), 특이적(unique)으로 가지는 단백질 서열을 탐색한 결과 모든 균주들이 공통적으로 보유한 core 단백질 서열 클러스터 1,769개, 일부 균주들이 보유한 accessory 단백질 서열 클러스터 1,435개, 그리고 각 균주가 특이적으로 보유한 unique 단백질 서열 클러스터가 최소 115개에서 최대 208개로 확인되었다(Fig. 4). 균주 107-1T의 유전체에서 특이적으로 확인된 unique 단백질은 212개로, hypothetical protein, 또는 기능이 명확히 알려지지 않은 단백질들이 상당수를 차지하였으며, 이들 이외 다양한 기질의 산화, 환원반응을 촉매하는 산화환원 효소 그룹 Gfo/Idh/MocA family oxidoreductase (Taberman et al., 2016), macrolide계 항생제를 무력화하는 macrolide 2'-phosphotransferase (Taniguchi et al., 2004) 등 다양한 수송, 촉매 관련 단백질들이 확인되었다(Table S2).

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Fig. 4. Core, accessory, and unique gene cluster count of strain 107-1T and related species.

Table S2. Unique proteins of Planococcus sp. 107-1T

본 연구에서는 다면적 실험을 통해 균주 107-1T의 분류학적 특성을 조사하여, 균주 107-1T과 계통학적으로 가까운 근연 분류군들의 특성을 비교 분석하였으며, 이를 통해 확인된 균주들간 공통점과 특이적 특성에 기반하여 균주 107-1T이 Planococcus 속에 속하는 종(species)단위 신종 분류군임을 확인하였다. 본 연구에서 동정된 균주 107-1T은 한국생물자원센터(Korean Collection of Type Cultures, KCTC)에 기탁(기탁번호 KCTC 43422) 보존하였고, 전장 유전체와 16S rRNA 유전자 서열은 각각 유전체 번호 CP090977과 유전자 번호 OM319629로 NCBI GenBank database에 등록하였다.

사사

본 연구는 국립수산과학원 수산과학연구사업 유용 미생물 활용 넙치 건강도 향상 기술 개발(R2022029)의 지원을 받아 수행됨.

부록

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