Anti-aggregation Effect of Artemether Through Regulation of PI3K/Akt and MAPK in U46619-induced Platelets

U46619-유도의 혈소판에서 PI3K/Akt 및 MAPK 조절을 통한 Artemether의 응집억제효과

Abstract

When blood vessels are damaged, a rapid hemostatic response should occur in order to lower blood loss and keep normal circulation, and platelet activation and aggregation are essential. Nevertheless, abnormal or excessive platelet aggregation can be a reason of cardiovascular diseases including thrombosis, atherosclerosis, and stroke. Therefore, the screening for a substance which can regulate platelet activation and suppress aggregation reaction is very important for treatment and prevention of cardiovascular diseases. Artemether is a methyl ether derivative of artemisinin, which is isolated from the antimalarial plant Artemisia annua, but research on platelet aggregation or its mechanisms is still insufficient. This study identified the effects of artemether on U46619-induced human platelet aggregation and their granule secretion (ATP and serotonin release). In addition, the effects of artemether on the phosphorylation of PI3K/Akt or MAPK, which are related to signal transduction in platelet aggregation, were studied. As the results, artemether significantly lowered PI3K/Akt and MAPK phosphorylation, which inhibited platelet aggregation through granule secretion (ATP and serotonin release) dose-dependently. Therefore, we suggest that artemether is an antiplatelet substance that regulates PI3K/Akt and MAPK pathway and is of value as a therapeutic and preventive agent for platelet-derived cardiovascular diseases.

혈액은 각 장기 및 조직에 산소 및 영양분을 공급하고 노폐물을 운반함으로써 생명체의 생존에 필수적이기에 혈액의 순환이 원활하게 이루어져야 한다. 따라서, 혈관이 손상된 경우에 손실되는 혈액량을 최소화하고 정상적으로 순환을 유지하기 위해서는 적절한 지혈이 이루어져야 하며, 혈소판의 활성화와 응집반응이 시작점이다. 그런데, 혈소판 응집이 비정상적으로 과도할 경우, 혈전증, 뇌졸중, 뇌경색 및 죽상 동맥경화증 등과 같은 심혈관계 질환의 유발 요인이 될 수도 있다.¹⁾ 따라서, 혈소판 활성화를 적절히 조절하며 응집반응을 억제시킬 수 있는 물질을 발굴하는 것아 심혈관계 질환의 예방 및 치료제를 개발하는 데 있어서 중요하다.²⁾ 혈관이 손상을 입었을 경우, 혈관 내 collagen, ADP, thrombin 와 같은 물질에 의해 혈소판이 활성화되면서 손상된 혈관 부위로 몰려든다. 이 과정에서 혈소판 막에 위치한 phospholipase C가 활성화 되면서 phosphatidylinositol 4, 5- bisphosphate를 inositol 1, 4, 5-triphosphate(IP₃)와 diacylglycerol (DG)로 가수분해시키는데, 이 때 생성된 IP₃는 혈소판 내 dense tubular system의 Ca²⁺ channel을 열어주어 세포질 내 Ca²⁺ 농도를 증가시킨다고 알려져 있다.³⁾ 혈소판의 세포질 내에서 증가한 Ca²⁺은 세포골격 단백질 중 하나인 myosin light chain(MLC)을 인산화함으로써 혈소판 shape change와 혈소판의 과립 분비를 유도하면서 혈소판의 응집을 촉매하여 지혈 과정에 참여한다.⁴⁾ 혈소판이 활성화 되는 과정에서 cytosolic phospholipase A₂(cPLA₂)에 의해 가수분해된 arachidonic acid가 cyclooxygenase-1(COX-1) 및 TXA₂ synthase (TXAS)의 효소작용으로 인해 TXA₂로 변환되어 혈소판 밖으로 분비된다.^{5, 6)} 이때 방출이 증가된 TXA₂는 주변 혈소판의 막 수용체에 결합하여 추가적으로 혈소판 응집을 촉진하는 agonist로 역할을 한다고 알려져 있다.⁷⁾ 실제로, TXA₂ 의 안정한 유사체로 알려진 U46619(9, 11-dideoxy-9a.la- methanoepoxyprostaglandin F2a)가 혈소판 내 Ca²⁺ 농도를 상승 시켜 myosin light chain와 plecktrin을 인산화시킴으로써 혈소판 응집을 유도하는 것으로 알려진 바 있다.^{8, 9)}

Mitogen-activated protein kinase(MAPK)는 세포 내 신호전달에서 작동하는 인산화 효소로 알려져 있는데, 여기에는 extracellular signal-regulated kinase(ERK), c-Jun Nterminal kinase(JNK) 및 p38 MAPK가 있다. 이들 MAPK들의 지혈과 혈전 생성 과정에 미치는 역할에 대해서 꾸준히 연구되어왔다.¹⁰⁾ MAPKs 중 ERK, JNK 및 p38은 사람 혈소판에 상당히 존재한다고 보고되어 있으며, 혈소판에서 인산화 될 때 활성을 낸다고 알려진 바 있다.^11-13) 이들 MAPK가 인산화될 때 혈소판 과립 분비를 유발함으로써 혈소판 활성화에 기여하는 것으로 잘 알려져 있다.^{14, 15)} 또한, MAPK 경로와 함께 인산화 단백질로 알려진 PI3K/Akt 경로가 혈소판 dense 과립의 분비와 혈소판 응집 등에 있어서 중요하게 기능하는 것으로 보고된 바 있다.¹⁶⁾

Artemether는 Artemisia annua의 유효성분으로 알려진 artemisinin의 유도체로서 기생충의 액포에서 ferriprotoporphyrin IX(heme) 또는 철 이온과 상호 작용하여 세포 독성 radical을 생성하여 말라리아 치료에 효과적이라고 보고된 바 있다.¹⁷⁾ 제안된 메커니즘 중 하나는 항산화 및 대사 효소 억제를 통해 artemether가 세포에 산화 및 대사 스트레스를 가함으로써 기생충의 병변 및 성장에 감소시킨다는 것이다.¹⁸⁾ 그런데, 혈소판 활성화 및 응집에 있어서의 artemether의 역할과 U46619으로 유도한 사람 혈소판에서 artemether의 작용기전은 현재까지 알려진 바가 없다. 본 연구는 혈소판에 미치는 artemether의 조절 효과를 규명하고자 하였고, U46619 유도의 혈소판 응집과 이에 관련하여 혈소판 내 과립 방출 및 이 과정에서 중요하게 작용하는 PI3K/Akt 및 MAPK의 인 산화에 미치는 artemether의 효과를 확인하였다.

재료 및 방법

시료−Artemether는 Avention Corporation(Siheung, Korea) 에서 구입하여 사용하였다(Fig. 1). U46619는 Chrono-Log Corporation(Havertown, PA, USA)에서 제공되었다. ATP assay kit와 serotonin EIA kit를 Cayman Chemical Co. (Ann Arbor, MI, USA)로부터 취득하였고, 그 밖의 시약들은 Sigma Chemical Corporation(St. Louis, MO, USA) 로부터구입하여 사용하였다. Western blotting에 사용한 antibody 및 lysis buffer는 Cell Signaling(Beverly, MA, USA) 로부터제공받았고, Enhanced chemiluminescence solution(ECL)과 polyvinylidene difluoride(PVDF) membrane은 General Electric Healthcare(Buckinghamshire, UK)에서 구입하였다.

Fig. 1. The structure of artemether. PIN: Dihydroartemisinin methyl ether, Chemical formula: C₁₆H₂₆O₅, Molar mass: 298.379 g/mole.

사람 혈소판의 세척 및 준비−우리는 대한 적십자사 혈액원(Suwon, Korea)으로부터 사람 혈소판 풍부 혈장 (Platelet-rich plasma, PRP)을 제공받아서 준비하였다. 세척 혈소판은 앞서 수행된 방법을 따라서 제조하였다.¹⁹⁾ PRP를 1, 250×g에서 8분 동안 원심분리해서 혈소판을 모으고, 이를 세척 완충액(138 mM NaCl, 12 mM NaHCO₃, 0.36 mM NaH₂PO₄, 2.7 mM KCl, 5.5 mM glucose 및 1 mM Na₂EDTA, pH 6.9)를 사용하여 2번 세척하였다. 세척된 혈소판을 현탁 완충액(138 mM NaCl, 12 mM NaHCO₃, 0.36 mM NaH₂PO₄, 2.7 mM KCl, 0.49 mM MgCl₂, 5.5 mM glucose, 0.25% gelatin, pH 7.4)으로 부유하여 10⁸ cells/mL의 최종 농도가 되도록 하였다. 저온 상태에서 혈소판이 응집되는 것을 막기 위해 모든 절차는 25^oC에서 수행하였고, 이 실험은 남서울대학교 Institutional Review Board(IRB)의 승인을 받아 수행하였다(1041479-HR-201803-003).

혈소판 응집반응의 측정−준비된 세척혈소판에 여러 농도의 artemether를 첨가하여 37^oC에서 3분간 방치한 후, 2 mM의 CaCl₂ 및 U46619(0.5 µM)로 자극하여 5분 동안 반응을 측정하였다. 응집은 1, 000 rpm stirring 속도에서 aggregometer(Chrono-Log Co., Havertown, PA, USA)를 사용하여 측정되었고, 빛 투과도가 증가된 정도로 응집 능을 산출하였다. 현탁완충액의 투과도 0%을 기준값으로 두었고, artemether는 현탁완충액(pH 7.4)에 녹여서 사용되었다.

세포 독성 측정−혈소판의 세포질로부터 방출되는 Lactate dehydrogenase(LDH)의 측정하여 세포 독성을 확인하였다. 세척혈소판을 여러 농도의 artemether를 첨가해 주고 실온에서 1시간 동안 배양 한 다음, 12, 000 ×g에서 2분 동안 원심분리 한 후, 그 상층액의 LDH를 LDH EIA kit를 사용하여 synergy HT multi-reader(BioTek Instruments, Winoosku, VT, USA)사용하여 측정하였다.

ATP 방출량 측정−세척혈소판에 여러 농도의 artemether를 첨가하여 37^oC에서 3분간 방치한 후, 2 mM의 CaCl₂ 및 U46619(0.5 µM)로 자극하여 5분 동안 반응시켰다. Ice-cold 2 mM EDTA으로 반응을 정지하였고, 원심분리한 상층으로 방출된 ATP를 ATP assay kit를 사용하여 luminometer (BioTek Instruments, Winooski, VT, USA)에서 측정하였다.

Serotonin 방출량 측정−세척혈소판에 여러 농도의 artemether를 첨가하여 37^oC에서 3분간 방치한 후, 2 mM의 CaCl₂ 및 U46619(0.5 µM)로 자극하여 5분 동안 반응시켰다. Ice-cold 2 mM EDTA으로 반응을 정지하였고, 원심분리한 상층으로 방출된 serotonin을 serotonin EIA kit를 사용하여 synergy HT multi-reader(BioTek Instruments, Winoosku, VT, USA)에서 측정하였다.

Western Immunoblotting−Lysis buffer를 첨가하여 세포 반응을 종결하였고, 용해된 혈소판의 단백질 농도를 BCA protein kit(Pierce Biotechnology, Rockford, IL, USA)로 확인하였다. 단백질(20 µg)을 8% SDS-PAGE를 통해 분리하였고 PVDF membrane으로 transfer한 뒤, 항체처리하였다. 1차 항체를 1:1, 000의 희석배수로 준비하였고, 2차 항체를 1:2, 000의 희석배수로 준비하여 처리하였으며, ECL 시약 (General Electric Healthcare)으로 반응을 일으켜 시각화하였다.

통계 분석−실험 결과의 분석을 위해 평균±표준 편차를 사용하였고, ANOVA 또는 Student’s t-test 를 사용하여 통계 분석을 수행하였으며, P<0.05를 통계적으로 유의성이 있는 것으로 하였다. 분산 분석에 따라 그룹 평균 간의 유의성이 있는 경우에는 각 그룹을 Scheffe의 방법으로 비교하였다.

결과 및 고찰

U4669로 유도한 사람 혈소판 응집과 세포독성에 미치는 artemether의 효과−본 연구에서 우리는 U46619로 유도한 사람 혈소판에서의 artemether의 응집 억제효과와 그기전을 살펴보았다. 이 실험에서는 0.5 µM의 U46619를 응집 유도제로 사용하였고, 사람 혈소판에 여러 농도의 artemether(50, 100, 300, 500 µM)을 처리하여 반응시켰을 때, 농도 의존적으로 혈소판 응집이 억제되는 결과를 확인할 수 있었다(Fig. 2A). Artemether의 half-maximal inhibitory concentration(IC₅₀)는 257.96 µM로 확인되었고(Fig. 2B), 혈소판에 미치는 artemether의 세포독성을 확인하기 위해 방출되어 나온 LDH(lactate dehydrogenase)를 측정하였다. 그 결과, 사람 혈소판에서 artemether(50, 100, 300, 500 µM)의 처리에 의해 유의한 변화를 확인하지 못하였다(Fig. 2C). 이 결과는 artemether가 U46619로 유도한 혈소판 응집반응을 유의적인 세포독성없이 억제였음을 의미한다.

Fig. 2. Effects of artemether platelet aggregation and cytotoxicity. (A) Effect of artemether on the aggregation U46619-induced human platelets. (B) Half-maximal inhibitory concentration (IC50) value of artemether in U46619-induced human platelet aggregation. (C) Effect of artemether on cytotoxicity. The aggregation of platelets and cytotoxicity were implemented as stated in the “Materials and Methods” part. The data are expressed as the mean ± standard deviation (n=4). *p<0.05, **p<0.001 versus U46619- stimulated human platelets. NS, not significant.

Artemether가 PI3K/Akt 경로에 미치는 효과 − PI3K/Akt 가 혈소판 내 과립의 방출에 관여하는 단백질로 알려져 있 기때문에, 본 연구에서 우리는 artemether가 PI3K/Akt의 인 산화에 어떤 영향을 미치는지 확인하였다. 그 결과, Fig. 3 에서 보여주는 바와 같이, U46619는 PI3k/Akt의 인산화를 강력히 증가시켰고, artemether는 U46619에 의해 증가된 PI3k/Akt의 인산화를 농도의존적으로 억제하였다. 이는 artemether가 U46619 유도의 사람 혈소판에서 유의하게 PI3k/Akt의 인산화를 억제할 수 있는 물질임을 명확히 한 것이다.

Fig. 3. Effects of artemether on PI3K and Akt phosphorylation. Western blot was implemented as stated in the “Materials and Methods” part. The data are expressed as the mean ± standard deviation (n=4). a p<0.05 versus non-stimulated platelets, * p<0.05, **p<0.001 versus the U46619-stimulated human platelets.

PI3K/Akt 경로는 혈소판이 활성화되면서 세포 내 신호 전 달이 일어나는 과정에 작용하며, 이들의 인산화 반응이 혈 소판 응집과 dense 과립 분비를 포함한 혈소판의 조절 및 기능에서 주요한 역할을 담당한다고 알려져 있다. 16) 본 연 구에서 확인된 결과를 통해 artemether가 PI3K/Akt 경로의 인단백질의 인산화를 하향조절하면서 혈소판의 과립분비 및 혈소판 응집의 억제에 기여할 것이라고 기대된다.

Artemether가 MAPK 경로에 미치는 효과 −본 연구에서는 artemether가 MAPK(mitogen-activated protein kinase) 경로 로 알려진 단백질들이 인산화 및 그로 인해 유도되는 혈소 판 과립 방출에 미치는 효과를 확인하였다. Fig. 4를 보면 알 수 있듯이, U46619의 유도에 의해 인산화된 JNK/p38가 artemether에 의해 유의적으로 감소되었으나, ERK의 인산 화에는 유의한 영향을 미치지 않았다. 이는 artemether가 JNK/p38의 인산화를 억제하여 혈소판 응집의 신호 전달 과 정을 조절하고 있음을 보여준다. 앞선 연구 결과들에서 혈 소판 응집을 억제하는 물질이 JNK/p38에 비해 ERK 인산 화에 미치는 영향이 미미하다는 보고가 있다. 20,21) 따라서, ERK, JNK 및 p38의 인산화와 이들 MAPK가 사람 혈소판 의 응집반응에 어떻게 관여하는지에 대해서는 추가적인 연 구가 수행될 필요가 있어 보인다.

Fig. 4. Effects of artemether on MAPK phosphorylation. Western blot was implemented as stated in the “Materials and Methods” part. The data are expressed as the mean ± standard deviation (n=4). a p<0.05 versus non-stimulated platelets, * p<0.05, **p<0.001 versus the U46619-stimulated human platelets.

앞 선 연구들을 살펴볼 때, 사람 혈소판에는 다량의 MAPK 가 함유되어 있고, 활성화 작용제들에 의해 혈소판이 활성 화될 때 MAPK의 인산화가 촉발되면서 혈소판 응집에 기 능하는 것으로 알려져 있다. 11-13) 본 연구의 결과는 artemether 가 MAPK 경로의 인단백질의 인산화를 하향조절하여 혈소 판 내 과립분비 억제와 혈소판 응집의 억제에 기여하는 것으로 보여진다.

Artemether가 혈소판 내 과립 분비에 미치는 효과 − Artemether가 사람 혈소판에서 과립 분비의 지표로 잘 알려 져 있는 ATP 및 serotonin 방출에 어떤 영향을 미치는지 확 인하였다. 그 결과, U46619에 의해 ATP 방출이 0.15 ± 0.02 µM(intact cell)에서 8.41 ± 0.15 µM까지 증가되었다(Fig. 5A). 그러나, U46619가 증가시킨 ATP 방출량이 artemether(50, 100, 300 및 500 µM)를 처리하였을 때, 각각 6.51 ± 0.20, 4.87 ± 0.15, 2.72 ± 0.20 및 1.41 ± 0.08 µM로 농도의존적으로 감소되는 것을 확인하였다(Fig. 5A). 또한, U46619에 의해 serotonin 방출량이 8.65 ± 0.58 ng/108 cells(intact cell)에서 150.36 ± 1.30 ng/108 cells까지 증가하였고, artemether(50, 100, 300 및 500 µM)이 150.86 ± 14.48, 108.30 ± 13.78, 78.66 ± 8.92 및 50.17 ± 1.42 ng/108 cells로 농도의존적으로 감소시켰다. 이 결과들은 artemether가 혈소판의 과립분비를 유의적으로 억제한다는 것을 확실하게 보여준다.

Fig. 5. Effects of artemether on granule secretion (A) Effects of artemether on ATP release. (B) Effects of artemether on serotonin release. Measurement of granule secretion was implemented as stated in the “Materials and Methods” part. The data are expressed as the mean ± standard deviation (n=4). a p<0.05 versus non-stimulated platelets, * p<0.05, **p<0.001 versus the U46619-stimulated human platelets.

과립 분비는 혈소판 활성화를 촉진하면서 손상된 혈관으로 혈소판의 점착을 유발함으로써 혈전 형성에 중요한 역할을 한다고 알려져 있다. ⁴⁾ 본 연구를 통해, 우리는 artemether 가 U46619에 의해 유도된 혈소판의 과립분비를 감소함으로써 혈소판 활성화 및 응집 억제에 기여한다는 것을 명확히 하였다.

결 론

혈소판 활성화 및 응집 심혈관계 질환을 유도하는 중요한 인자로 알려져 있다. 따라서, 혈소판 활성화를 억제하는 것은 심혈관계 질환에 대한 매력적인 예방 및 치료 표적으로 여겨진다. Artemether는 항말라리아 식물인 Artemisia annua 에서 분리된 artemisinin의 methyl ether 유도체로 말라리아 치료에 효과적인 것으로 알려져 있지만, 혈소판 활성화와 그 기전에 대해서는 알려진 연구가 없다. 본 연구는 U46619 가 유도한 사람 혈소판 응집에서 artemether가 미치는 영향을 확인하였고, artemether의 인산화단백질의 조절에 미치는 작용 기전을 명확히 하였다. Artemether은 혈소판 응집 반응 중에 일어나는 신호 전달 과정에 작용한다고 알려진 인산화 단백질인 PI3K/Akt 경로 및 MAPK 경로를 하향 조절하였다. 또한, artemether는 ATP 및 serotonin을 포함한 혈소판 내 과립 분비를 감소시킴으로써 결과적으로 농도 의존적으로 혈소판 응집을 억제하였다. 이러한 결과로 볼 때, artemether가 사람 혈소판 활성화와 이를 통해 일어나는 혈전 형성을 억제하는 데 있어서 유효한 물질임을 시사한다.