Skin Regeneration and Whitening Effects of the Complex Extract of Dendrobii Caulis and Centella asiatica

석곡 및 병풀 복합 추출물의 피부 색소 침착 방지 및 피부재생 효과

Abstract

The objective of this study was to assess the effect of preventing pigmentation caused by external stimuli, promoting skin regeneration and whitening of the skin composition containing complex extract of Dendrobii Caulis and Centella asiatica (CE). We evaluated cell viability, tyrosinase and melanin inhibition activity, skin irritation test, and skin moisturizing and regenerative effects using CE. As a result of the tyrosinase inhibitory activity, 100 ㎍/mL CE (35.31%) showed higher value than kojic acid (21.32%). The results of melanin synthesis inhibition in B16F10 melanoma cells after treatment with α-melanocyte stimulating hormone showed a similar level of activity to that of arbutin, indicating an excellent whitening effect. In clinical test of the skin composition containing CE, we confirmed that CE is non-irritated in human skin primary irritation test as well as have a high skin moisturizing and regenerative effect. From these results, we suggested the CE not only prevents skin damage and pigmentation caused by external stimuli but has remarkable skin brightening activity and skin regeneration effect.

외부 환경과 직접 접하면서 인체를 보호하며, 생화학적 및 물리적인 기능을 가지고 있는 아주 중요한 조직 중 하나인 피부는 골격을 형성하는 케라틴 및 콜라겐 섬유 단백질을 피복하고 보호하는 여러 층의 세포로 구성되어 있다.¹⁾ 그러나 피부는 외부에 노출되어 있어 다양한 자극에 의해 쉽게 손상될 위험이 크기 때문에 꾸준한 관리가 필요하다. 특히 손상된 피부의 병변 치료 및 미용 목적으로 행해지는 레이저 시술은 색깔에 따라 흡수하는 빛의 파장이 달라지는 레이저의 원리를 이용하여 정상 피부와 다른 병변의 색에 잘 흡수되는 파장의 레이저 빛을 가하여 선택적으로 원하는 조직을 파괴할 수 있다. 이렇게 특정 파장의 레이저는 혈관 병변 또는 피부 색소성 병변을 파괴시킴으로써 안면홍조, 여드름 자국, 주근깨, 검버섯과 같은 피부 병변을 치료할 수 있다. 그러나 피부 병변 치료와 같은 효과를 가지는 동시에 피부에 레이저를 조사하면서 수반되는 다양한 피부 부작용 또한 발생한다. 피부에 가해진 레이저로 인해 파괴된 세포들이 비세균성 염증반응을 유발하여 감염 및 염증 후 색소침착 등의 부작용이 유발될 수 있다. 또한, 레이저 시술 후조직이 재생되는 과정에서 혈관신생으로 인해 시술 부위에 홍반을 동반한 다양한 피부 과민 반응이 발생할 수 있다. 따라서, 레이저 시술 후 발생할 수 있는 색소침착을 예방하고 부작용을 개선할 수 있는 새로운 조성물의 개발이 요구되고 있다.^2-5)

난초과(Orchidaceae)는 850여개 이상의 속과 약 20,000여 개 종을 가진 두 번째로 큰 화초과(flowering plant family)의 식물이다.⁶⁾ 난의 종류는 전 세계적으로 약 30만종 이상이 있다고 알려져 있으며, 다양한 생리활성을 나타내는 유효성분들이 다량 함유되어 있음이 밝혀지고 있다. 지금까지 알려진 난초과 식물의 생리활성으로는 항암, 항균, 항염, 항산화, 항당뇨, 항바이러스, 항알러지 활성을 포함하며 무수히 많은 활성을 가진 것으로 보고되었다. 특히 난초과에 속하는 덴드로비움 속(Dendrobium spp.)의 항산화 효과, 자란종(Bletilla striata spp.)의 항산화, 미백 및 항암 효과, 천마 (Gastrodia elata spp.) 종의 신경보호 작용과 같은 많은 연구가 보고된 바 있다.^7-10) 그러나, 본 연구에서는 난초과의 석곡에는 지금까지 알려진 난초과 식물의 생리활성 이외에도 피부 미백 및 색소침착 방지 효과가 뛰어난 것으로 확인되어 공시재료로 최종 선정하였다.

병풀(Centella asiatica)은 미나리과에 속하는 다년생 식물로서, 항산화 활성, 항균활성, 다양한 암에 대한 항암효과, 신경 안정 효능, 면역 활성 증진 등에 관한 다양한 생리활성기능에 관한 연구가 보고되었다.^11-18) 또한, 콜라겐 합성효능, 항염증 및 두피홍반 개선효과, 각질형성세포 증식, 피부 재생 등 피부미용에 탁월한 효능을 가진 것으로 알려져 있으며, 병풀로부터 분리된 아시아티코사이드 또는 그 유도체는 피부궤양, 광범위한 외상치료, 피부정맥, 노장성궤양, 미란성피부궤양, 한성원형탈모증 등 피부 재생 및 상처 치유 효과가 있다고 보고된 바 있다.^19-24)

이와 같이 석곡 및 병풀 각각의 추출물의 피부 미용 효과에 관해서는 많은 연구가 진행되었으나, 이들 복합추출물의 외부 자극에 의한 피부 손상에 대한 증상 완화 및 유용성에 관한 연구는 아직 보고된 바 없다. 따라서 본 연구에서는 석곡 및 병풀 복합추출물을 제조하여 피부 조성물의 외부 자극에 의한 붉음증 또는 색소침착 방지, 피부 재생 촉진 및 미백 효과를 확인하기 위한 목적으로 연구가 진행되었다.

재료 및 방법

실험재료 − 본 연구에서 사용된 석곡 및 병풀은 2017년 경동시장(Kyung-Dong Market, Seoul, Korea)에서 구입하여 ㈜김정문알로에 농공장에 소속되어 있는 김종곤 전문가의 정확한 감정을 거친 후 실험에 사용하였으며, voucher specium은 (주)김정문알로에 농공장에 보관되어 있다. 그 외 배지와 실험에 사용된 물질은 모두 Sigma-Aldrich(St. Louis, MO, USA)에서 구매하여 사용하였다.

석곡 및 병풀 복합 추출물 제조 − 석곡 및 병풀 복합 추출물을 얻기 위해 다음과 같이 실시하였다. 석곡 생초를 500 rpm의 속도로 분쇄 후, 분쇄물 200 g과 증류수 3 L를 혼합하여 환류 냉각추출기(Extraction System B-811, BUCHI Labortechnik AG, Switzerland)를 이용해 100^oC에서 3시간 동안 추출하였다. 그 후, 100 mesh의 여과포로 여과 후 잔여물을 동일한방법으로 1회 반복 추출하였다. 최종 추출물은 여과지(WF2- 1100; Whatman, UK)로 여과하여 불용성 물질을 제거한 후, 60^oC에서 감압농축한 후 -80^oC에서 24시간 동결건조 (FD8512, ilShinBioBase, Dongduchoen, Korea)하여 석곡추출물(수율: 21.2%)을 수득하였다. 동일한 방법으로 병풀 추출물(수율: 18.2%)을 수득한 뒤, 석곡 추출물과 병풀 추출물을 1:1 비율로 혼합하여 복합추출물을 제조하였다.

세포 독성 평가 − 석곡 및 병풀 복합추출물이 대표적인 인간 각질세포주인 HaCaT 세포(human keratinocyte cell line)에 미치는 독성을 확인하기 위해 3-(4.5-dimethylthiazol- 2-yl)-2, 5-diphenyltetrazoli-um bromide(MTT) assay를 실시하였다.²⁵⁾ 먼저 96-well plate에 10% Fetal bovine serum (FBS)가 첨가된 Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) 배지에 희석한 세포를 1×10⁵ cells/well씩 분주하여 24시간 부착한 후 각 well에 실험에서 수득한 복합추출물을 적절한 농도로 희석하여 처리하여 24시간 동안 배양하였다. 그 후 배지를 제거하고 각 well 당 2.5 mg/mL의 MTT 용액이 함유된 세포배양 배지 200 μL를 넣어 2 시간 동안 37^oC의 CO₂ 배양기에서 배양하였다. 이 후 배지를 제거하고 dimethyl sulfoxide(DMSO)를 100 μL씩 넣고 5분간 진탕하여 세포를 용해시킨 후 570 nm에서 흡광도를 측정하였다.

Tyrosinase 저해 활성 분석 − 석곡 및 병풀 복합추출물의 미백효과를 확인하기 위해 tyrosinase 억제 활성 분석을 진행하였다.²⁶⁾ 각각의 시료 15 μL를 96-well plate에 첨가하였고, 50 mM 인산 완충액(pH 6.5) 150 μL 및 1.5 mM의 L-티로신 용액 25 μL를 분주하였다. 그 후, tyrosinase 10 μL를 첨가하여 37^oC에서 20 분간 반응시킨 후에 490 nm에서 흡광도를 측정하였고, 생성된 도파크롬(dopa chrome)의양을 평가하여 tyrosinase에 대한 저해율을 측정하였다. 양성대조군으로 동일 농도의 kojic acid를 이용하였다.

B16F10 흑색종 세포를 이용한 멜라닌 합성 억제 활성 분석 − 석곡 및 병풀 복합추출물이 마우스 유래 B16F10 흑색종 세포(B16F10 melanoma cell) 내 멜라닌세포자극호르몬(α-melanocyte stimulating hormone, α-MSH)에 의해 유도된 멜라닌 생합성을 억제하는 효과를 분석하기 위해 다음과 같이 Hosoi 등의 방법을 일부 변형하여 진행하였다.²⁷⁾ 이때 복합추출물이 B16F10 흑색종 세포에 미치는 독성을 확인하기 위해 MTT assay를 진행하였다. B16F10 흑색종 세포는 10% FBS, 1% penicillin 및 streptomycin이 처리된 DMEM 배지를 이용하여 37^oC, 5% CO₂ 배양기에서 배양하였다. 그 후, 6-well plate에 well 당 1×10⁵ cells/mL로 접종하여 배양 후 10 mM 농도의 α-MSH로 처리하였고, 그로부터 4시간 후에 농도별 복합추출물을 처리하였다. 복합추출물 처리 24시간 후에 B16F10 흑색종 세포는 phosphate buffered saline(PBS)로 2회 수세 후 수거하였다. 여기에 1 mL의 lysis buffer(0.1 M sodium phosphate buffer pH 6.8, 1%(v/v) triton X-100)를 첨가하여 4℃에서 30분 반응시킨후 13,000 rpm에서 10분간 원심분리하고 상등액은 bicinchoninic acid(BCA) 단백질 정량법으로 정량하였다. 침전물은 1 N의 NaOH 용액 1 mL을 첨가한 후 90^oC에서 1시간 반응시키고 동일 농도의 단백질 양으로 희석한 후 490 nm에서 흡광도를 측정하여 멜라닌 생성량을 산출하였다. 이때 양성 대조군으로 arbutin을 이용하였다.

석곡 및 병풀 복합추출물로 제조한 연고제 및 외용제 제조 − 석곡 및 병풀 복합추출물을 이용하여 인체 적용시험을 진행하기 위해 복합추출물을 포함하는 연고제(Table I) 및 외용제(Table II)를 제조하였다. 연고제의 경우, A상을 80^oC 에서 가열하여 용해시켰다. 같은 온도에서 B상을 천천히 투입하여 교반 및 유화시킨 후, 같은 온도에서 C상을 투입하여 중화시킨 후 교반하였다. 그 후 45^oC까지 냉각한 후, 60^oC 에서 D상을 투입하고 교반하여 석곡 및 병풀 복합추출물이 포함된 연고제를 제조하였다. 외용제의 경우, 증류수에 파라옥시안식향산 메틸(methyl p-hydroxybenzoate)을 용해시키고 carbormer 934P로 교반하여 분산시켰다. 수산화나트륨으로 pH를 조정한 후 프로필렌글라이콜(propylene glycol)로 혼화 가열하여 멸균하였다. 그 후, 석곡 및 병풀 복합추출물, 나이아신아마이드(niacinamide), 정제수, 가수화 콜레스테롤 (hydrogenated cholesterol), 소듐데옥시콜레이드(sodium deoxycholate) 및 가수화 레시틴(hydrogenated lecithin)을 투입하고 교반하여 제조하였다.

Table I. Formation of the cream containing complex extract of Dendrobii Caulis and Centella asiatica in the ratio of 1:1

*Ethylene-diamine-tetraacetic acid

**Complex extract of Dendrobii Caulis and C. asiatica in the ratio of 1:1

Table II. Formation of the topical ointment containing complex extract of Dendrobii Caulis and Centella asiatica in the ratio of 1:1

*Complex extract of Dendrobii Caulis and C. asiatica in the ratio of 1:1

석곡 및 병풀 복합추출물로 제조한 연고제 및 외용제의 인체 피부 자극시험 − 석곡 및 병풀 복합추출물의 인체 피부에 대한 자극도를 분석하기 위해 헬싱키 선언에 근거한 윤리 규정, 식품의약품안전처 인체적용시험가이드라인의 관련 규정, 보건복지부의 생명윤리 및 안전에 관한 법률에 따라 KC피부임상연구센터에 의뢰하여 피부 첩포에 의한 일차 자극 인체적용시험을 실시하였다(KC-180827-S1J). 선정 기준에 적합하고 제외기준에 해당되지 않는 총 32명의 시험대상자를 대상으로 피부 첩포 시험을 실시하였다. IQ Ultimate^TM에 시험물질인 석곡 및 병풀 복합추출물을 포함한 연고제 및 외용제를 각각 25 μL씩 적하하여 시험 부위인 등 부위의 피부에 부착시켰다. 첩포는 24시간 동안 부착하였고, 패치 제거 1시간 및 패치 제거 24시간 후 시험자에 의한 피부반응 정도를 평가하였다. 시험자 육안평가는 국제접촉피부염연구회(International Contact Dermatitis Research Group; ICDRG)의 판정기준에 따라 자극 정도를 관찰하였으며(Table III), 피부자극지수는 아래의 식을 통해 산출하였다. 피부자극지수 범위 별 자극도는 Table IV 에 나타내었다.

Table III. Recording of patch test reactions

Table IV. Evaluation depending on range of stimulus degree

\(\text{Stimulus degree} = \begin{aligned} \sum \frac{\text { Grade } \times \text { No. of Responders } \times 100}{4(\text { Maximum grade }) \times 32 \text { (Total Subjects })} \times \frac{1}{2} \text { (No. of Evaluation) } \end{aligned} $$\)

석곡 및 병풀 복합추출물로 제조한 연고제의 보습 지속효과 분석 − 석곡 및 병풀 복합추출물을 포함하는 연고제의 보습 효과는 헬싱키 선언에 근거한 윤리규정, 식품의약품안전처 인체적용시험가이드라인의 관련 규정, 보건복지부의 생명윤리 및 안전에 관한 법률에 따라 피앤케이 피부 임상연구센터에 의뢰하여 인체적용시험을 실시하였다(PNK-16905- M1R). 선정 기준에 적합하고 제외기준에 해당되지 않는 시험대상자 21명(Appendix 1 참고)을 대상으로 석곡 및 병풀 복합추출물을 포함하는 연고제를 1회 사용하도록 하였다. 사용 전과 사용 직후, 사용 24시간 후, 48시간 후, 72시간 후, 100시간 후, 120시간 후에 Corneometer CM825(Courage- Khazaka electronic GmbH, Germany)를 사용하여 광대 근처 볼 부위의 피부 보습도를 측정하여 보습지속 효과를 분석하였다. 반대쪽 볼 부위에 비교를 위한 대조군으로 석곡 및 병풍 복합추출물 대신 정제수가 첨가된 동일 배합비의 피부 조성물을 동일한 방법으로 도포하여 보습도를 측정하였다.

인체적용시험을 통한 석곡 및 병풀 복합추출물로 제조한 외용제 피부 재생 효과 분석 − 석곡 및 병풀 복합추출물을 포함하는 외용제를 이용하여 피부 재생 효과를 확인하기 위해 인체 피부첩포시험을 실시하였다(IRB No.: EL- 180611314A052). 선정 기준에 적합하고 제외기준에 해당되지 않는 시험대상자 21명(최종 20명 시험완료, 평균 40.10±8.72세, 남성)(Appendix 2 참고)을 대상으로 시험 부위에 핀 챔버를 이용하여 1% sodium lauryl sulfate(SLS)를 챔버 내에 15 μL 적용 후 피험자의 시험부위에 첩포하여피부각질층 손상을 유도하였다. 그로부터 24시간 후에 첩포를 제거하고 시험 부위를 가볍게 정제수로 세척한 후 30분 뒤에 시험부위를 관찰 및 측정하며 3주간 지속적으로외용제를 처방하면서 관찰하였다. 피부자극 육안평가는 국제접촉피부염 연구회(International Contact Dermatitis Research Group; ICDRG)의 판정기준에 따라 자극 정도를 관찰하였으며(Table III), 피부 반응도는 아래의 식을 통해 산출하였다. 피부자극지수 범위 별 자극도는 Table IV에 나타내었다.

\(\text{Stimulus degree} = \begin{aligned} \sum \frac{\text { Grade } \times \text { No. of Responders } \times 100}{4(\text { Maximum grade }) \times 32 \text { (Total Subjects })} \times \frac{1}{2} \text { (No. of Evaluation) } \end{aligned} $$\)

피부 재생 육안평가는 손상 유도 후 회복 정도를 2명 이상의 시험자가 육안 평가기준에 의거하여 0-4단계(0, 전혀 회복되지 않음; 1, 미미하게 회복됨; 2, 약간 회복됨; 3, 회복됨; 4, 완전히 회복됨)로 평가하였다. 대조군으로 석곡 및 병풀 복합추출물 대신 정제수가 첨가된 동일 배합비의 조성물을 동일한 방법으로 도포하여 평가하였다.

통계처리 − 각 시료 간의 차이를 비교하기 위해 통계처리를 실시하였다. 모든 시료에 대해서는 3회 반복 실험을 진행하였으며 각 자료는 평균값과 표준오차로 나타내었다. 통계 분석은 SPSS(IBM SPSS Statistics, NY USA)를 사용하였고 95% 유의수준에서 Duncan의 일원배치 다중검정 시험으로 각 처리 간의 유의적인 차이를 확인하였다.

결과

세포 독성 평가 − 석곡 및 병풀 복합추출물이 피부 세포에 노출되었을 때 미치는 영향을 확인하기 위하여 MTT assay를 통해 인간 각질세포주 HaCaT 세포에 대한 직접적인 세포 독성을 평가하였다(Fig. 1). 석곡 및 병풀 복합추출물의 100, 200, 300, 400, 500, 1000 및 2000 μg/mL 농도에서의 cell viability는 각각 100.02, 101.13, 100.85, 99.81, 99.74, 97.22 및 85.67%로 최대 500 μg/mL 농도 범위까지 시료를 첨가하지 않은 음성대조군의 cell viability(100%)와 유의적인 차이를 보이지 않았다. 이를 통해 석곡과 병풀 복합추출물은 500 μg/mL 농도 이하에서 HaCaT 세포주에 대한 독성을 보이지 않는 것으로 확인되었다.

Fig. 1. Cell viability of the complex extract of Dendrobii Caulis and Centella asiatica in HaCaT cell line decided by MTT assay. Data represent the mean±S.D. with three separate exper- iments. Differences between groups were statistically analyzed by ANOVA with post-hoc by Duncan test. **p<0.05 compared to non-treated group.

Tyrosinase 억제 활성능 측정 − 석곡 및 병풀 복합추출물의 멜라닌 합성 억제 및 미백 효과를 확인하기 위해 tyrosinase 저해 활성을 분석하였다. 양성대조군으로는 멜라닌 합성 억제를 통한 피부 미백 효과가 있는 것으로 알려져있는 물질 중 하나인 kojic acid를 이용하였고, 결과는 Fig. 2에 나타내었다. 그 결과, 5, 10, 25, 50 및 100 μ g/mL에서각각 2.10, 6.09, 11.87, 18.92 및 35.31%로, 100 μg/mL 농도의 석곡 및 병풀 복합추출물은 kojic acid(21.32%)보다 우수한 tyrosinase 저해 활성을 보였다.

Fig. 2. Tyrosinase inhibitory activity of the complex extract Dendrobii Caulis and Centella asiatica in the ratio of 1:1. Kojic acid was used as a positive control. Data represent the mean±S.D. with three separate experiments. Differences between groups were statistically analyzed by ANOVA with post-hoc by Duncan test. **p<0.05 compared to kojic acid-treated group.

B16F10 흑색종 세포를 이용한 멜라닌 생성량 확인 − B16F10 흑색종 세포에 α-MSH를 처리하였을 때의 멜라닌합성 저해 활성 분석을 통해 석곡 및 병풀 복합추출물의 색소침착 방지 효과를 확인하였으며, 우선적으로 석곡 및 병풀 복합추출물의 세포 독성을 확인하기 위하여 MTT assay를 통해 B16F10 흑색종 세포에 대한 세포 독성을 평가하였다(Fig. 3(a)). 시료를 첨가하지 않은 음성대조군의 cell viability를 100% 기준으로 두었을 때, 석곡 및 병풀 복합추출물의 100, 200, 300, 400, 500 μg/mL 농도에서의 cell viability는 각각 100, 101, 100, 99.8 및 99%로 나타났다. 이를 통해 복합추출물은 500 μg/mL 농도까지 B16F10 흑색종 세포에 대해 독성을 가지지 않는 것으로 확인되었다.

Fig. 3. Effects of the complex extract of Dendrobii Caulis and Centella asiatica in B16F10 melanoma cell (a) Cell viability decided by MTT assay (b) Melanin inhibition activity stimulated by α-melanocyte stimulating hormone. Data represent the mean±S.D. with three separate experiments. Differences between groups were statistically analyzed by ANOVA with post-hoc by Duncan test. ns; not significantly.

B16F10 흑색종 세포에 α-MSH를 처리하여 멜라닌 합성을 유도하고, 석곡 및 병풀 복합 추출물을 처리한 후의 멜라닌 생성 저해율을 분석한 결과는 Fig. 3(b)에 나타내었다. 석곡 및 병풀 복합추출물 50, 100 및 250 μg/mL에서의 멜라닌합성 저해율은 각각 8.44±1.97, 19.35±1.42 및 39.52±0.68% 였으며, 같은 농도에서 양성대조군인 arbutin의 멜라닌 합성저해율과 유사한 결과를 보여주었다.

피부 첩포에 의한 일차자극 인체적용시험 − 석곡 및 병풀 복합추출물에 대해 인체 피부에서의 피부자극 정도를 평가하기 위해 인체피부 첩포시험을 실시하였다. 그 결과는 Table V와 같으며, 복합추출물이 포함된 연고제 및 복합추출물이 포함된 외용제 모두 패치 제거 1시간 후 및 24시간 후 모두 자극이 관찰되지 않았다. 따라서 피부 자극 지수 0.00으로 판정기준에 따라 홍반이나 특이현상을 발생시키지 않는 무자극 제품인 것으로 최종 판정되었다.

Table V. Results of human skin primary irritation test

^*Indication standard: (+) Slight erythema, either spotty or diffuse; (++) Moderate uniform erythema; (+++) Intense erythema with edema; (++++) Intense erythema with edema and vesicles.

^**Complex extract of Dendrobii Caulis and Centella asiatica in the ratio of 1:1.

피부 보습지속 효과에 대한 인체적용시험 − 석곡 및 병풀 복합추출물이 포함된 연고제를 이용하여 피부 보습지속 효과를 corneometer로 분석하였다(Fig. 4). 사용 전과 사용 직후, 사용 24시간 후, 48시간 후, 72시간 후, 100시간 후, 및 120시간 후 피부 보습도를 측정한 결과, 석곡 및 병풀 복합추출물을 포함한 연고제의 A.U.값은 37.54±8.24, 66.93±7.69, 56.19±9.67, 56.73±8.82, 51.41±9.44, 44.26±5.76 및 43.91±5.82 으로 사용 직후보다 24시간 후에서 약 1.78배 피부 보습이 증가하였으며, 120시간이 지났음에도 불구하고 유의적으로 보습이 일부 지속되고 있음이 확인되었다. 반면, 음성대조군으로 사용된 석곡 및 병풀 복합추출물 대신 정제수가 첨가된 조성물 연고제의 사용 전과 사용 직후, 사용 24시간 후, 48시간 후, 72시간 후, 100시간 후, 및 120시간 후 피부 보습 도를 측정한 A.U.값은 41.10±10.81, 39.04±9.28, 38.41±7.66, 39.01±9.31, 97.99±7.35, 35.58±6.70 및 35.59±5.87로 사용 직후부터 120시간까지 보습력이 지속되지 않는 모습을 보였다. 즉, 석곡 및 병풀 복합추출물을 포함한 연고제은 음성대조군에 비해 사용 직후부터 사용 24시간 후, 48시간 후, 72 시간 후, 100시간 후, 및 120시간 후 모두 유의적으로 (p<0.05) 우수한 피부 보습도를 가지고 있는 것으로 확인되었다. 또한 석곡 및 병풀 복합추출물이 포함된 피부 조성물은 1회 사용으로 120시간 이상 보습 지속력이 뛰어난 것으로 확인되었다.

Fig. 4. Skin hydration effects of the cream containing complex extract of Dendrobii Caulis and Centella asiatica (CE cream). Data represent the mean±S.D. with three separate experiments. Differences between groups were statistically analyzed by ANOVA with post-hoc by Duncan test. **p<0.05 compared to control group.

피부 재생 효과에 대한 인체적용시험 − 석곡 및 병풀 복합추출물이 포함된 외용제의 자극에 의한 피부 자극 진정효과를 평가하였다. 피부손상 유도를 위해 각 시험부위에 1% SLS를 24시간 첩포하고, 첩포 제거 24시간 후 시험 부위의 피부자극 정도를 점수화하여 평가하였다. 실험군과 대조군에서 각각 1.91과 1.88의 손상이 유도되었으며, 피부 각질층 손상 유도 후 3주 간 각각 군에 해당하는 외용제를 도포하며 피부 재생 변화를 관찰하였다. 그 결과, 실험군과 대조군 모두 시간경과에 따라 피부회복 정도가 증가되었으나, 도포 후 7일째가 되는 시점부터 석곡 및 병풀 복합추출물이 함유된 외용제가 적용된 실험군에서 유의적으로 높은 재생 효과를 보였다(Table VI). 위 결과로부터 석곡 및 병풀 복합추출물은 자극에 의해 손상된 피부의 재생 효과를 증진시키는 것으로 확인되었다.

Table VI. Results of human skin regeneration test from external stimuli

^*Complex extract of Dendrobii Caulis and Centella asiatica in the ratio of 1:1.

Differences between groups were statistically analyzed by ANOVA with post-hoc by Duncan test. ^**p<0.05 compared to control group.

고찰

Tyrosinase는 멜라닌 색소가 형성되는 산화반응 단계 중 melanogenesis의 속도 결정단계인 초기반응에 관여하는 요인들 중에서 tyrosine을 기질로 이용하는 구리 함유 효소이다.²⁸⁾ Tyrosine은 tyrosinase에 의하여 L-DOPA로, L-DOPA 는 dopaquinone으로 산화되어 최종적으로는 중합에 의해 멜라닌이 생성된다. 따라서 tyrosinase의 활성 억제는 피부 내에서의 멜라닌 생합성을 효과적으로 저해할 수 있기 때문에 유용한 효능 검증법으로 사용되고 있다.²⁹⁾ 본 연구에서 진행된 tyrosinase 저해 활성 분석 결과, 100 μg/mL 농도의석곡 및 병풀 복합추출물은 양성대조군인 kojic acid(21.32%) 보다 우수한 tyrosinase 저해 활성을 보였다. 따라서 석곡 및 병풀 복합추출물은 tyrosinase 활성을 억제시킴으로서 피부색소 침착 등을 방어할 수 있는 피부 조성물의 소재로 이용 가능할 것으로 기대되었다.

MSH는 pro-opiomelanocortin의 유도체로 주로 뇌하수체에서 생성되나 피부를 포함한 체내 다른 부위에서도 생성되는 것으로 알려져 있으며, 특히 피부에서는 각질 형성 세포와 멜라닌세포에서 생성된다. 태양 광선이 표피의 각질 형성 세포(keratinocyte)를 자극하면 α-MSH가 방출되고 이는 멜라노사이트를 자극하여 멜라닌 생합성을 증가시킨다.^{30, 31)} 본연구에서 진행된 B16F10 흑색종 세포를 이용한 멜라닌 생성량을 확인한 결과, 석곡 및 병풀 복합 추출물은 양성 대조군으로 이용된 arbutin과 유의적인 차이를 보이지 않았다. Arbutin은 멜라닌 생성 억제능에 있어서 안전하며 효능이 좋은 것으로 널리 알려져 있어 피부 미백을 위한 물질로 이용된다.³²⁾ 본 연구의 석곡 및 병풀 복합추출물이 arbutin과유사한 수준의 멜라닌 합성 저해율을 보이는 것으로 보아 복합추출물은 피부 미백 활성을 통한 우수한 색소침착 방지 효능을 가지는 것으로 사료된다. 이와 비슷한 연구로, Chan 등의 연구³³⁾에서 Dendrobium 종의 물 추출물의 멜라닌 저해 활성은 35% 가량인 것으로 확인되었다. 또한, Goo 등의 연구³⁴⁾에 따르면 물로 추출한 125-1,000 ppm 농도 범위의 병풀 추출물은 대조군에 비하여 최대 20%에 근접한 멜라닌 색소농도의 감소율을 보였다. 그러나 본 연구의 석곡 및 병풀 복합추출물의 멜라닌 합성 저해율이 250 μg/mL 농도에서 39.52% 이었던 것과 비교해 보았을 때, 석곡 및 병풀 복합추출물은 석곡 또는 병풀 단독 추출물에 비해서 더 높은 색소침착 방지 효과를 가지는 것으로 확인되었다.

석곡 및 병풀 복합추출물의 인체피부 첩포시험 결과, 복합추출물이 포함된 연고제 및 복합추출물이 포함된 외용제 모두 피부 자극 지수 0.00으로 판정기준에 따라 홍반이나 특이현상을 발생시키지 않는 무자극 제품인 것으로 확인되었다. 따라서 본 연구의 복합추출물은 기능성 화장품 또는 피부 외용제 원료로서 이용이 가능할 것으로 생각된다. 또한, 석곡 및 병풀 복합추출물이 포함된 연고제를 이용하여 피부 보습지속 효과를 분석한 결과, 복합추출물을 포함한 연고제는 대조군에 비해 사용 직후부터 사용 120시간 후까지 유의하게 높은(p<0.05) 피부 보습도를 가지는 것으로 나타났으며, 1회 사용으로 120시간 이상 보습이 지속되는 효과를 보여주었다. 이를 통해 석곡 및 병풀 복합추출물을 포함하는 피부 조성물은 우수한 보습 효과를 가지는 것으로 확인되었다.

상처치유와 같은 피부 재생은 응고, 염증, 사이토카인 생성, 세포의 이동, 증식 및 분화, 혈관신생, 세포 외 기질 (extracellular matrix)의 합성 및 리모델링(콜라겐 생성 및 증착)을 포함하는 복합적인 생물학적 과정이다.¹⁹⁾ 병풀 추출물 및 병풀에서 분리된 트리페노이드(tripenoid) 성분의 상처치유 활성 및 피부 보호 효과는 다수의 연구를 통해 증명된 바 있다.^{34, 35)} 본 연구에서 석곡 및 병풀 복합추출물이 포함된 외용제의 자극에 의한 피부 손상의 완화 및 재생 효과를 평가한 결과, SLS에 의해 피부손상이 유도된 부위에 7일 이상 도포할 경우 복합추출물이 포함된 외용제가 적용된 실험군에서 대조군에 비해 유의적으로 높은 재생 효과를 보였다. 이를 통해 석곡 및 병풀 복합추출물은 자극에 의해 손상된 피부의 재생 효과를 증진시키는 것이 확인되었다.

결론

본 연구에서는 석곡 및 병풀 복합 추출물을 이용하여 피부 조성물의 레이저 시술과 같은 외부 자극에 의한 붉음증또는 색소침착 방지, 피부 재생 촉진 및 미백 효과를 확인하였다. 석곡 및 병풀 복합추출물의 tyrosinase 저해활성 실험 결과 100 μg/mL 농도에서 35.31%의 저해활성을 보여 kojic acid(21.32%)보다 우수한 tyrosinase 저해 활성을 보였다. B16F10 흑색종 세포에 α-MSH 처리 후 멜라닌 합성 저해 활성을 분석한 결과, arbutin과 유사한 정도의 활성을 보여 우수한 미백 효과를 나타내었다. 석곡 및 병풀 복합추출물을 포함하는 피부 조성물의 인체적용시험 결과, 피부 첩 포에 의한 일차자극실험을 통해 무자극 제품인 것으로 확인되었으며, 높은 피부 보습효과 및 재생효과를 가지는 것으로 나타났다. 이러한 결과로부터 석곡 및 병풀 복합추출물은 외부 자극에 의한 피부의 손상 및 색소침착을 방지하며 우수한 미백 활성 및 피부 재생 효과를 가지는 것을 확인하였으며, 이를 통해 피부 레이저 시술 후 발생할 수 있는 붉음증또는 자극 완화를 위한 피부 조성물로써 석곡 및 병풀 복합추출물의 이용가치를 확인한 것에 그 의의가 있다. 추후 석곡 및 병풀 각각의 추출물에 관한 연구를 통하여 피부 미백 및 재생에 유익하게 작용하는 개별 성분을 규명하고, 그 명확한 기작을 확인하는 것이 필요할 것으로 사료된다.