Study on the Anti-allergic Effect using Immature Persimmon (Diospyros kaki Thunb. Sangju-Dungsi) Ethanol Extract

미성숙 감(Diospyros kaki Thunb. Sangju-Dungsi) 에탄올 추출물의 항알레르기 생리활성 연구

Abstract

This study was conducted to verify the availability of immature persimmon ethanol extract (IPEE) as a natural and functional ingredient in protecting inflammation and allergy of skin based on the mechanism. The major content analysis, antioxidant activities, anti-allergic activity, anti-inflammatory effect, and safety related to irritation of IPEE were evaluated. The gallic acid content per 10 mg/mL of IPEE was 0.522% (5.22 mg/g). The total polyphenol and flavonoid contents were 428.3 mg/g and 31.1 mg/g, respectively. In ABTS+ activity, DPPH ability and SOD-like activity, it showed a concentration-dependent increase, which indicated IPEE has excellent antioxidant activities. As for the anti-allergy test in RBL-2H3 cells, the IPEE showed a decrease in β-hexosaminidase secretion as the concentration increases, and IPEE tended to decrease IL-4 secretion in all RBL-2H3 cells compared to the IgE + HSA group. IPEE showed good anti-inflammatory effect in RAW 264.7 cells by decrease of NO production and inflammation cytokines (TNF-α and IL-6). Also IPEE showed non-irritant in BCOP assay. By the results of this study, the IPEE containing high tannins, had good antioxidant, anti-allergic, and anti-inflammatory effects, which indicated that the immature persimmon is considered to be a useful for the development of related functional ingredients.

산업화로 인해 서구화된 식품의 섭취 비중이 높아짐에 따라, 신체 내 면역력이 낮아져 알레르기성 질환의 발병이 증가하고 있는 추세이며, 환경오염으로 인한 미세먼지 증가 또한 알레르기 질환의 증가를 유도한다고 보고되고 있다.^{1, 2)} 현대인들에게 알레르기 질환은 정신 건강에 영향을 미치며, 이로 인한 스트레스는 또 다른 알레르기 질환을 야기한다.^{3, 4)} 또한 알레르겐(allergen)의 다양화와 항원에 대한 민감성 증대도 알레르기 발병에 크게 영향을 주고 있어, ⁵⁾ 현재 알레르기 질환 예방과 치료에 대한 많은 연구가 진행되고 있다. 특히 현재 많이 사용되고 있는 화학적으로 합성된 항 알레르기성 물질인 항히스타민제나 부신피질 호르몬제 등은 즉각적인 항알레르기 능을 가지고 있으나 다양한 부작용 위험으로 인해, 이를 대체할 수 있는 새로운 천연소재의 연구가 요구되어지고 있다.^{6, 7)}

알레르기(allergy)는 과민성 면역 반응으로, 알레르겐 (allergen)이라는 특정한 항원으로 인해 특이적인 Immunoglobulin E(IgE) 항체가 비만세포(mast cell)에 결합되어 유도되는 염증 반응이다.⁸⁾ 알레르기 반응을 일으키는 알레르겐으로는 꽃가루, 집먼지 진드기 등 주변에 다양하게 분포되어 있으며, 선진국의 사람들 중 10∼40%가 1개 이상의 항원에 대한 알레르기를 가지고 있다고 한다.⁹⁾

비만세포(mast cells)는 알레르기 반응을 유도하는 세포로서, 탈과립을 통해 염증세포를 유도하는 물질을 분비하여 선천면역에 중요한 역할을 한다. 이는, 전신에 분포되어 있으며 특히 혈관과 신경주위의 상피조직 기저에 분포하는 것으로 알려져 있다.¹⁰⁾ 분비된 IgE가 비만세포 표면에 존재하는 IgE 고친화성 수용체인 FcRI에 결합한 후, 원인 항원이 IgE에 결합할 경우 비만세포는 히스타민(histamine)등의 염증성 전달 물질을 분비하고 사이토카인 활성을 증가시켜 과민 반응을 일으키게 된다. 비만세포가 과도하게 활성화될 경우, 히스타민(histamine) 등의 탈과립(degranulation) 성분들은 가려움을 유발하고, IL-4, IL-6, TNF-α와 같은 사이토카인 (cytokine)과 프로스타글란딘(prostaglandin), 류코트리엔 (leukotrienes)과 같은 물질들은 염증(inflammation)반응을 증폭 시킨다.¹¹⁾

T림프구 중 Th1 세포는 IL-2, TNF-β 등을 분비하며 대식세포를 활성화시켜 세포성 면역 반응을 유도하며, Th2 세포는 IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-13 등을 분비하여 IgE 분비 증가, 호산구(eosinophil) 및 비만세포의 분화 유도 등의 체액 성 과민 반응을 유도한다.¹²⁾ 알레르기성 피부염 유발 과정은 감작기(sensitization)와 유발기(challenge)로 나누어지는데, 감작기에 표피의 랑게르한스세포가 항원정보를 림프절로 이동하여 T세포에 제시해 주고, 활성화된 Th2 세포에서 분비된 사이토카인에 의해 성숙화 된 B세포에 의해 IgE가 생성된다. 이때 생성된 IgE는 비만세포의 탈과립을 유도하여 피부 가려움증 등의 피부 염증을 일으키는 작용을 한다.¹³⁾

본 연구에서는 피부알레르기를 개선할 수 있는 천연 소재발굴에 주안점을 두었다. 감(Diospyros kaki Thunb.)은 식이섬유, 카로티로이드, 카테킨 등 생리활성물질이 다양하며 국내에서 대량 생산되고, 여러 가지 기능성을 가지는 것으로 알려져 있다.^{14, 15)} 감은 탈삽시켜 만든 단감과, 삽미가 잔존하는 미숙과로 분류된다.¹⁶⁾ 품종에 관계없이 미숙과에서 항산화 성분인 탄닌으로 인해 떫은 맛(삽미)이 나타나며, 과실이 숙성됨에 따라 탄닌 함량은 점차 감소된다.¹⁷⁾ 탄닌은 항균, 항바이러스 작용 및 면역기능 회복작용을 나타내며, ¹⁸⁾ 활성산소 소거작용 등으로 인해 종양세포 증식 억제 및 항암 작용도 나타낸다.^{19, 20)} 감의 미숙과는 항당뇨기능, ²¹⁾ 중성지질 대사 개선효과²²⁾ 및 콜레스테롤 대사 개선효과²³⁾를 가진다고 알려져 있다.

감잎(Diospyros kaki Leaves)은 엽록소, 비타민 등이 풍부하여 성인병인 고혈압, 동맥경화 및 심장병 등과 만성질환인 당뇨병, 위궤양 등에 효과가 있으며, ^{24, 25)} 아토피 개선효과, ²⁶⁾ 미백효과, ²⁷⁾ 광 노화 억제효과²⁸⁾가 알려져 있으며, 감잎에서 분리한 탄닌은 항돌연변이 효과, ^{29, 30)} 중금속 제거효과³¹⁾ 및 tyrosinase 저해효과³²⁾ 등이 보고되어 있다. 이와 같은 감잎, 감과피, 감꼭지 등의 연구는 진행되어지고 있지만, 미성숙 감에 대한 항알레르기 소재로서 생리활성 기전연구는 미비하다. 미성숙 감은 높은 탄닌 함량으로 인한 떫은맛과 낮은 상품 가치 등으로 인해 단감보다 선호도가 떨어지지만, 높은 효능에 대한 기대감으로 인해 부가가치 소재로서의 활용 면에서 의의가 있다고 할 수 있다.

이에 본 연구에서는 경상도 지역에서 많이 재배되고 있는탄닌 함량이 높은 미성숙 상태의 상주 둥시 감(Diospyros kaki Thunb. Sangju-Dungsi) 과육 에탄올 추출물을 이용하여, 항산화능, 항알레르기 및 항염증 평가를 통해 새로운 알레르기성 완화제로서 실용 가능성을 확인하고자 하였다.

재료 및 방법

시료 제조 및 추출 수율 측정 − 본 시험에 사용된 미성숙 상주 둥시 감(Diospyros kaki Thunb. Sangju-Dungsi)은 일반적인 수확시기인 10월 말경~11월 초 보다 이른 8월 초에 경상북도 상주지역에서 수확한 떫은 미성숙 감으로, 수확 즉시 과육을 동결건조 하였다. 과육의 추출은 70% 에탄올을 이용해 상온에서 24시간 동안 교반 하여 침전물과 상등액을 분리한 후 여과와 농축을 진행하였으며, 이후 농축액을 72 시간 동안 동결 건조 후 분말 형태의 미성숙 감 에탄올 추출물(immature persimmon ethanol extract, IPEE)을 얻었다. 수율은 8.34%이었으며, 사용전까지 -20°C에서 냉동 보관하였다.

Gallic acid 성분 분석 − 정량, 정성 분석을 위해 Shimadzu (Kyoto, Japan)사의 HPLC-DAD system과 Agilent(Santa Clara, CA, USA)사의 QTOF-MS system을 사용하였으며, 분석 컬럼은 Shiseido(Tokyo, Japan)사의 Capcell Pak C₁₈(4.6 mm ×250 mm)을 사용하여(Table I) 270 nm의 파장에서 gallic acid 를 분석하였다. Gallic acid는 표준품 1 mg을 칭량 후 50% 메탄올 1mL을 혼합하여 1 mg/mL의 농도의 표준용액을 제조하였고, 5, 10, 20, 40, 100, 200, 500 µg/mL로 계열 희석 (double dilution)하여 검량선을 작성하였다.

Table I. Condition of HPLC-DAD and UPLC-QTOF-MS

감 추출물 10 mg을 칭량 후 50% 메탄올 1 mL을 혼합하여 10 mg/mL의 농도로 조제하여 HPLC-DAD로 크로마토그램 면적을 그린 후, 이로부터 gallic acid의 함량을 도출하였다.

In vitro 항산화능 실험 − IPEE의 총 폴리페놀 함량 측정을 위해 시험물질 1 mL에 7.5 mL의 증류수와 0.5 mL의 Folin- reagent를 가하여 혼합 후 3분간 안정화하였다. 안정화 후 1mL의 Na₂CO₃ 포화용액을 가한 뒤 1시간 동안 실온에서 반응시킨 후 spectrophotometer를 이용하여 760 nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준곡선은 tannic acid를 사용하여 작성하였으며, 총 폴리페놀 함량은 시료 1g 중 tannic acid의 함량을 환산하였다.³³⁾ 총 플라보노이드 함량 측정을 위해서는, 적절한 농도로 제조한 시료 200 μL, 10% aluminium nitrate 100μL와 1M potassium acetate 100 μL를 혼합하고, 혼합액에 80% ethanol 3 mL을 가하여 실온에서 40분간 반응 후 spectrophotometer를 이용하여 415 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다. 총 플라보노이드 함량은 quercetin을 이용하여 작성한 표준곡선을 이용하여 시료 1g 중 quercetin의 함량을 환산하였다.³⁴⁾

DPPH(2, 2-diphenyl-1-picrylhydrazyl) 전자공여능(Electron Donating Ability, EDA) 실험은, 준비 시료 100 µL와 DPPH (0.2 mM) 50 µL를 섞어 차광 시켜 30분 동안 방치한 후 517 nm에서 spectrophotometer로 흡광도를 측정하여 전자공여 능을 계산하였다.³⁵⁾ ABTS⁺ radical scavenging activity를 위해서는, 2.2-Azinobis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid) 7 mM과 potassium persulfate 2.45 mM을 동량 혼합 후 차광하여 실온에서 12시간 동안 반응시켰다. 반응 후 solution은 에탄올로 희석하여 흡광도를 734 nm에서 측정하였다. 농도별로 조제된 시료(100 µL)에 ABTS solution(100 µL)을 섞어 암실에서 반응시킨 후(약 7분간) spectrophotometer로 734 nm에서 흡광도를 측정한 후 radical 소거능을 계산하였다.³⁶⁾ SOD 유사활성 측정은 Marklund-Marklund의 방법³⁷⁾에 의거하여 실시하였으며, 이들 시험의 양성대조군으로는 ascorbic acid를 사용하였고, 아래의 식을 사용하여 계산하였다.

\(\text { Antioxidant capacity }(\%)=\left(1-\frac{\text { 시료 첨가군의 흡광도 }}{\text { 대조군의 홉광도 }}\right) \times 100\)

RBL-2H₃ cell을 이용한 항알레르기 평가−Rat basophilic leukemia(RBL)-2H₃ 세포주는 한국세포주은행(KCLB, 22256, Seoul, Korea)으로부터 분양 받았으며, 4 mM L- glutamine, 100 units/mL penicillin, 100 μg/mL streptomycin과 15% heat-inactivated fetal bovine serum가 포함된 minimal essential medium(MEM)을 사용하여 37°C, 5% CO₂ 조건에서 배양하였다.

시험물질에 의한 세포독성을 확인하기 위해, RBL-2H3 cells를 24 well plate에서 2×10⁵ cells/mL로 500 μL씩 분주하고, incubator에 24시간 배양하였다. 이후, 세포를 PBS로 1회 세척 후, anti-DNP(dinitrophenyl)-IgE를 50 ng/mL 농도로 500 µL/well 분주하고 24시간 배양하였다. MEM으로 2회 세척 후 MEM 160 μL/well 분주하고 20분 동안 incubator에 넣어 안정화 시키고, 각 well에 시료를 농도별(125, 250, 500 µg/mL)로 20 μL 첨가 후 1시간 동안 배양하였다. DNP- HSA(0.1 g/mL)를 20 μL 첨가 후 4시간 동안 추가 배양하였다. 이후 상층액을 제거한 후 RBL-2H₃ cell을 PBS로 1회 washing하고 0.5mg/mL의 MTT 용액을 500 µL씩 넣은 후 37°C, 5% CO₂ incubator에서 3시간 반응시켰다. MTT용액을제거한 다음 DMSO를 100 µL씩 넣어 상온에서 20분간 반응시킨 후 spectrophotometer로 405nm 파장에서 흡광도를 측정하였다. 세포생존율은 다음 식에 의해 산출하였다.

Cell viability(%)=(Absorbance_sample/Absorbance_Normal)×100

RBL-2H3 cell에서 β-Hexosaminidase 분비량 측정  − RBL-2H₃ cells는 10% FBS, 1% P/S가 함유된 MEM 배지에 37°C, 5%, CO₂ 조건인 incubator에 24시간 배양하여 안정화 시킨 후 실험에 사용하였다. RBL-2H3 cells를 PBS로 한번 세척 후, 50 ng/mL anti-DNP-IgE를 500 µL/well 분주하고 24시간 배양 하였다. MEM으로 2회 세척 후 MEM 160 μL/ well을 분주하고 20분 동안 incubator에 넣어 안정화 시켰다. 각 well에 시료를 농도별(125, 250, 500 µg/mL)로 20 μL 첨가 후 1시간 동안 incubator에 배양하였다. DNP-HSA(0.1g/mL) 20 μL를 첨가 후 4시간 동안 incubator에 배양하였다. 세포에서 방출 된 β-hexosaminidase 활성을 측정하기 위해 배양 배지를 옮겨 원심분리(4°C 13, 000 RPM, 10 분) 반응을 정지하였다. 96-well plate에 상층액(25 μL)과 substrate buffer (4-nitrophenyl N-acetyl-β-D-glucosaminide 5mM, sodium citrate, 0.1M, pH 4.5), (0.1M citrate buffer(pH 4.5)를 50μL/well로 첨가 후 1시간 동안 incubator에 배양한 후 sodium carbonate buffer(pH 10.0)를 100 µL 첨가하여 반응을 정지하여 spectrophotometer를 이용하여 405 nm 파장으로 흡광도를 측정하였다.

RBL-2H3 cell에서 IL-4 단백질 발현 측정−RBL-2H3은 RIPA buffer 200 μL/well 씩 분주한 후 scraper를 사용하여 세포를 떨어뜨린 후 tube로 옮겨 10분간 원심분리 하였다. Lowry 등(1951)의 방법에 의거하여 단백질 농도를 정량분석 한 후, 시료는 LSB와 lysis buffer를 첨가하여 15분간 가열 한 후 사용하였다. 추출된 단백질은 SDS-polyacrylamide gel을 사용하여 전기영동을 하고, membrane에 transfer 하였다. Transfer된 membrane은 5% nonfat dry milk로 1시간 동안 blocking하고, TBST(TBS+0.1% Tween-20, pH 5)를 사용하여 세척한 다음 primary antibody를 16시간 교반 반응시켰다. IL-4에 반응하는 항원을 검출하기 위해 immunoblotting을 진행한 후 TBST로 세척하고 secondary antibody를 가하여 1시간 교반 반응한 후 TBST로 3회 세척하였다. Band의 시각화는 ECL(Amersham)을 이용하였고 X-ray film에 가시화하였다.

RAW 264.7 cell을 이용한 항염증 평가 − 마우스 대식세포 주인 RAW 264.7 cell은 한국세포주은행(KCLB, 40071, Seoul, Korea)을 통해 분양 받았으며, 배지 조성은 DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium)에 10% FBS(fetal bovine serum)와 1% P/S(penicillin-streptomycin)을 첨가하여 사용하였고, 37°C, 5% CO₂ 조건에서 배양하였다. RAW 264.7 cells에 DMEM을 사용하여 각각의 농도로 시험물질 (IPEE)을 희석한 후 LPS(1 μg/mL)를 처치하여 염증을 유발하였다(Table II). 실험은 3회 반복하였다.

Table II. Experimental groups for anti-inflammatory test in RAW 264.7 cells

¹⁾LPS: Lipopolysaccharide, ²⁾IPEE: Immature persimmon ethanol extract.

RAW 264.7 cell에서 시험물질의 세포독성−안정화된 RAW 264.7 cell을 96-well plate에 1×10⁵ cells/well로 분주하여 37°C, 5% CO₂ incubator에서 24시간 배양한 후 시험물질(IPEE)을 농도별로 희석하여 100 µL씩 처치하고 같은 조건에서 24시간 배양하였다. 이후 상층액을 제거한 후 RAW 264.7 cell을 PBS로 1회 washing 하고 0.5 mg/mL의 MTT 용액을 100 µL씩 넣은 후 37°C, 5% CO₂ incubator에서 3시간 동안 반응 시켰다. 상층액을 제거한 다음 DMSO를 100 µL씩 넣어 실온에서 20분간 cell을 녹인 후 spectrophotometer를 이용하여 570 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다. 시험물질(IPEE)의 세포 생존율은 다음 식에 의해 산출하였다.

Cell viability(%)=(Absorbance_sample/Absorbance_Normal)×100

RAW 264.7 cell에서 LPS 처치에 따른 세포독성−안정화된 RAW 264.7 cell을 96-well plate에 1×10⁵ cells/well로 분주하여 37°C, 5% CO₂ incubator에서 24시간 배양한 후 시험물질(IPEE)을 농도별로 LPS(0.1 µg/mL)를 넣은 DMEM에 희석하여 200 µL씩 처치하고 같은 조건에서 24 시간 배양하였다. 이후 상층액을 제거한 후 RAW 264.7 cell을 PBS로 1회 washing 하고 0.5 mg/mL의 MTT 용액을 100 µL씩 넣은 후 37°C, 5% CO₂ incubator에서 3시간 동안 반응하였다. MTT용액을 제거한 다음 DMSO를 100 µL씩 넣어 상온에서 20분간 반응시켰다. 그 후 spectrophotometer로 540 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다. 세포생존율은 다음 식에 의해 산출하였다.

RAW 264.7 cell에서 NO 생성 저해평가−안정화된 RAW 264.7 cell을 96-well plate에 1×10⁵ cells/well로 분주하여 37°C, 5% CO₂ incubator에서 24시간 배양한 후 DMEM 배지에 희석한 LPS(0.1 µg/mL)와 시험물질을 농도별로 200 µL 씩 처치하고 동일한 조건에서 24시간 배양하였다. 이후 상층액 50 µL을 새로운 96-well plate에 옮긴 다음 동일한 양의 Griess 시약을 넣고 10분간 반응시켰다. 그 후 spectrophotometer를 이용하여 540 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다. NaNO₂ 표준액의 정량곡선으로 세포 배양액 내 NO 농도를 계산하였다.

NO 저해율(%)

\(\left(1-\frac{\text { 시료 첨가군의 흡광도 - 무 첨가군의 흡광도 }}{\text { LPS 처치군의 흡광도 - 무 첨가군의 흡광도 }}\right) \times 100\)

RAW 264.7 cell에서 TNF-α와 IL-6 단백질 발현 측정 − RAW 264.7 cell은 PBS로 2번 세척 후 RIPA buffer 200 μL/well 씩 분주한 후 scraper를 사용하여 세포를 떨어뜨린 후 tube로 옮겨 원심분리를 10분간 하였다. Lowry 등(1951)의 방법에 의거하여 단백질 농도를 정량분석 하였다. 단백질 정량 후 시료는 LSB와 lysis buffer를 첨가하여 15분간 가열한 후 사용하였다. 추출된 단백질은 SDS-polyacrylamide gel을 사용하여 전기영동을 하였다. 그 후 membrane에 transfer 하였다. transfer된 membrane을 5% nonfat dry milk로 1시간 동안 blocking하고, TBST(TBS+0.1% Tween-20, pH 5)를사용하여 세척한 다음 primary antibody를 16시간 교반 반응시켰다. TNF-α, IL-4에 반응하는 항원을 검출하기 위해 immunoblotting을 진행한 후 TBST로 세척하고 secondary antibody를 가하여 1시간 교반 반응한 후 TBST로 3회 세척하였다. Band의 시각화는 ECL(Amersham)을 이용하였고 X-ray film에 가시화 하였다.

BCOP assay를 이용한 안점막 자극 평가 − Bovine Corneal Opacity and Permeability(BCOP) assay는 OECD test guideline 437³⁸⁾에 의거하여 진행하였다. 시험물질은 IPEE를 10, 50, 100 mg/mL 농도로 처지하였으며, 음성 대조군은 distilled water(DW), 양성 대조군은 ethanol을 사용하였다. 도축한 소의 안구로부터 각막을 분리하여 Hank’s balanced salt solution(HBSS)으로 세척하고 각막의 상피를챔버 상단을 향하도록 한 뒤 각막이 손상되지 않도록 주의하며 양쪽 챔버를 장착하였다. 그리고 양쪽 챔버에 홀더에 phenol red가 함유되지 않은 MEM배지를 채웠다. 홀더에 장착된 각막을 incubator에서 32°C 조건으로 1시간 동안 배양하고 양쪽 챔버에 phenol red가 함유되지 않은 MEM 배지를 채운 후 opacitometer를 사용하여 initial opacity값을 측정하였다. 각막의 혼탁도가 7 이하의 각막만 사용하였다. 홀더 상단 챔버의 각막 상피에 시험물질 750 μL을 10분간 적용하고, 양쪽 챔버 내부에 phenol red가 함유된 MEM배지를 사용하여 3회 세척 후 phenol red가 함유되지 않은 MEM 배지를 사용하여 3회 세척하였다. 이후 phenol red가 함유되지 않은 MEM배지를 양쪽 챔버에 채우고 2시간 후배양 하고, 최종 혼탁도를 계산하였다.

Fluorescein sodium 용액은 각막 적용 전 미리 32°C에서 데워 준비한 뒤 상단 챔버에 1mL씩 적용 후 32°C incubator 에서 90분간 반응시켰다. 그 후 하단 챔버의 MEM 배지를 뽑아내어 96-well plate에 300 μL씩 넣은 뒤 spectrophotometer를 이용하여 490 nm에서 흡광도를 측정하여 각막 투과율을 아래 식에 따라 계산하였다. OECD test guideline 437에 의거하여 안점막 자극지수(IVIS)를 계산하여 자극여부를 판정하였다(Table III).

Table III. Irritant scores and classification used in BCOP assay

¹⁾ Opacity=[(Lux_control/Lux_sample)−0.9894]/0.0251

²⁾ Permeability=Absorbance_sample−Absorbance_control

1) Opacity = [(Lux_control/Lux_sample) − 0.9894]/0.0251

2) Permeability = Absorbance_sample− Absorbance_control

3) IVIS=Opacity average+(15×Permeability average)

통계처리 − 실험 데이터의 통계 처리는 평균 ± 표준편차로 나타냈다. Windows용 SPSS 21.0을 이용하여 일원 배치 분산분석(one-way ANOVA)을 실시하였다. 각 그룹 평균 간의 차이를 검정하기 위해 Duncan’s multiple range test를 통하여 사후분석을 실시하였다. 실험의 통계학적 유의성 검증 수준은 p<0.05, p<0.01, p<0.001로 하였다

연구 결과

Gallic acid 정량 및 정성분석 − Gallic acid의 표준품은 6.7분에서 검출되었으며, IPEE도 6.7분에 gallic acid가 검출되었다(Fig. 1). Gallic acid 표준용액은 5∼500 μg/mL 범위에서 우수한 직선성을 나타내었다(Fig. 2). IPEE 10 mg/mL당 gallic acid의 함량은 평균 0.522±0.004%(5.22 ± 0.04 mg/g) 로확인되었다.

Fig. 1. HPLC-PDA chromatograms of gallic acid standard (A) and immature persimmon ethanol extract (B).

Fig. 2. Calibration curve of gallic acid standard.

미성숙 감의 열수, 70 및 100% EtOH 추출물에서 gallic acid가 검출되었으며(Fig. 3), mass spectrometry를 참고문헌과 비교하여 gallic acid임을 확인하였다(Fig. 4).

Fig. 3. HPLC-ESI-QTOF-MS Chromatograms of water extracts (A), 70% EtOH extracts (B) and EtOH extracts (C).

Fig. 4. Negative ESI-MS spectrum of gallic acid in extract.

항산화 활성 평가 결과 − IPEE의 총 폴리페놀 함량은 428.3±3.0 mg/g이었으며, 플라보노이드의 함량은 31.1 ± 1.9 mg/g으로 확인되었다. IPEE의 ABTS 라디칼 소거 활성은 물질 농도가 증가함에 따라 농도 의존적으로 활성이 높아졌으며, 250 μg/mL 농도에서 양성대조군인 ascorbic acid와 유사한 정도의 항산화능을 보여주었다(Fig. 5A). 전자공여능도 물질 농도에 의존적으로 활성이 높아지는 모습을 보였고 1, 000 μg/mL 농도에서 73.7%의 전자공여능을 보였다 (Fig. 5B). SOD 유사활성도 농도 의존적으로 높아졌으며, 1, 000 ppm 농도에서 54.5% 활성산소 소거능을 보였다(Fig. 5C).

Fig. 5. ABTS⁺ radical scavenging ability (A), electron-donating ability (B) and superoxide dismutase (SOD)-like activity (C) of IPEE. Values represent the mean±SD of 3 independent measurements. Values with different letters are significantly different (p<0.05). IPEE: Immature persimmon ethanol extract

RBL-2H3을 이용한 항알레르기 평가결과 − RBL-2H3 세포에서 IPEE을 125, 250, 500 µg/mL 농도로 처리하여 MTT assay로 세포생존율을 측정한 결과, 각각 93.4%, 85.1%, 81.4%으로 나타나, 이후 실험에서 세포 생존에 영향을 미치지 않는 농도인 500 µg/mL 이하 농도에서 실험을 수행하였다(data not shown).

IPEE에 의한 RBL-2H3 세포로 부터의 β-hexosaminidase 생성량을 측정한 결과, DNP-IgE와 DNP-HSA에 의해 감작된 control군에서 분비된 β-hexosaminidase 양을 100%로 볼 때 IPEE는 125, 250, 500 µg/mL 농도에서 47.42, 39.31, 16.95% 의 방출량을 보여 농도가 증가하면서 β-hexosaminidase 분비량이 감소하는 양상을 나타내었다(Fig. 6). IPEE를 처치한 모든 RBL-2H₃ cells에서 IgE + HSA 군에 비해 Th2 cytokine 인 IL-4가 감소하였으며 특히 200 μg/mL의 농도 군에서는 현저한 감소가 확인되었다(Fig. 7).

Fig. 6. β-Hexosaminidase release in IgE antigen complex-stimulated RBL-2H₃ cells. The values represent mean ± SD of 3 independent experiments. Asterisk indicates a significant difference from the IgE+HSA treatment control (***p<0.001).

Fig. 7. Effect of IPEE treatment on the IL-4 levels of inflammation in RBL-2H₃ cells. Values are relative to the Vehicle treatment control and is expressed mean ± SD of 3 independent measurements. Asterisk indicates a significant difference from the IgE+HSA treatment control (***p<0.001). N : IgE, C: IgE+HSA, E1: IgE+HSA+IPEE 100 µg/mL, E2: IgE+HSA+IPEE 200µg/mL.

RAW 264.7 cell을 이용한 항염증 평가 − RAW 264.7 cells에서 시험물질의 세포독성을 MTT assay로 측정한 결과, IPEE은 31.25∼500 µg/mL에서 모두 80% 이상의 높은 세포 생존율을 나타냈으며, 이후 실험은 500 µg/mL 이하 농도에서 수행하였다(data not shown).

RAW 264.7 cell에 LPS와 IPEE를 병용 처치 하였을 때의 세포 생존율을 측정한 결과, LPS 단독처치군의 세포 생존율이 77.8%이었으며, IPEE 병용 처치군에서는 세포 생존율이 증가하였고, LPS 및 IPEE 500 μg/mL을 처치한 군에서는 80.6%의 세포 생존율을 보였다(Fig. 8). LPS에 의한 NO 생성량은 IPEE 농도에 의존적으로 감소하는 양상을 나타냈으며 최고 농도인 500 µg/mL에서 가장 큰 감소를 보였다(Fig 9). RAW 264.7 cell에서 LPS에 의해 증가된 염증인자인 TNF-α와 IL-6 발현량이 IPEE 처치에 의해 감소하였으며, 특히 500 μg/mL 농도 처치군의 감소가 현저하게 확인되었다(Fig. 10A, 10B).

Fig. 8. Cell viability of LPS and IPEE in RAW 264.7 cell. The values represent mean ± SD of 3 independent experiments. Cells viability expressed as a percentage of NC. Values with different letters are significantly different (p<0.05). NC : vehicle-treatment control.

Fig. 9. Rate of nitric oxide production in RAW 264.7 cell. The values represent mean ± SD of 3 independent experiments. Cells viability expressed as a percentage of LPS. Values with different letters are significantly different (p<0.05). NC : vehicle-treatment control. LPS : LPS-treatment control.

Fig. 10. Effect of IPEE treatment on the TNF-α (A) and IL-6 (B) levels in RAW 264.7 cells. Values are relative to the vehicle treatment control and is expressed mean ± SD of 3 independent measurements. Asterisk indicates a significant difference from the vehicle treatment control (***p<0.001). N: Vehicle, C: LPS, E1: LPS+IPEE 250µg/mL, E2: LPS+IPEE 500µg/mL.

BCOP assay를 이용한 안점막 자극시험 평가−양성대 조군으로 사용한 ethanol의 각막 혼탁도와 투과도는 매우 높은 수치를 보였고 IPEE는 음성대조군인 distilled water와 비슷한 0에 가까운 수치를 보였다(Fig. 11A, 11B). 각막의 혼탁도와 투과도를 이용하여 안자극지수(IVIS)를 산출하였을 때, 양성대조군인 ethanol은 55이상의 수치를 보여 자극성으로 판정되었으며, 모든 IPEE 처치군은 3 이하의 수치를 보여 비자 극성으로 판정되었다(Fig. 11C).

Fig. 11. The opacity (A), permeability (B) and IVIS (C) values of IPEE in BCOP assay. Values are mean ± SD of 3 independent measurements. Values with different letters are significantly different (p<0.05). NC : distilled water, PC : ethanol.

고찰

알레르기 피부염은 면역기전에 의한 피부 질환이며, 염증 증상 외에 피부 장벽 손상 등을 통한 2차 감염 유발도 문제시되고 있다.³⁹⁾ 이러한 알레르기 피부염의 치료법으로 많이 사용되는 항생제, 항히스타민제, 소염제인 스테로이드제 등은 대부분 합성원료로서 안전성에 문제가 우려되기 때문에, 천연 기능성 소재의 발굴이 항상 요구되고 있다. 본 연구에서는 미성숙 감 에탄올 추출물(IPEE)의 항산화, 항염증 및 항알레르기 연구를 통하여 피부염과 알레르기로부터 피부를 보호할 천연 기능성 소재로서의 활용 가능성을 확인하고자 하였다.

먼저 IPEE내 gallic acid는 5.22 mg/g으로 측정되어, 밤송이 내에서 1% 내외의 함량을 보인 선행논문⁴⁰⁾에 비해서는 다소 낮았지만 적지 않은 양이 관찰되었다. 밤송이의 경우, 탄닌 함량에 대비하여 유효성분인 gallic acid는 1/4 정도 수준으로 관찰되는 것으로 알려져 있다.⁴¹⁾ IPEE의 항산화능평가를 위해 총 폴리페놀 함량을 측정한 결과 428.3 mg/g 으로 나타나, 이는 기존에 보고된 단감 38.36∼77.53 mg/g, 대봉감 220∼293 mg/g, 반시 180∼198 mg/g 등에 비해 상대적으로 높은 결과였으며, 플라보노이드 함량은 31.11 mg/g 으로 나타나 기존 보고된 단감 11.81∼12.0 mg/g, 대봉감 24.8∼28.0 mg/g, 반시 39.2∼54.0 mg/g에 비해 크게 적지 않은 함량을 보였다.⁴²⁾ 감의 생리활성연구에 기초자료가 되는 감의 총 폴리페놀, 총 플라보노이드 함량 및 항염증 효과 등은 재배 시기와 품종에 따라 차이를 보이며, ¹⁴⁾ 이번 실험에서는 탄닌산 뿐만 아니라 높은 폴리페놀 함량이 효과에 큰 기여를 한 것으로 사료된다.⁴³⁾

IPEE의 DPPH 전자공여능 assay, ABTS 라디칼 소거 활성 및 SOD 유사활성시험 결과, 농도 의존적으로 증가하는 양상을 보였다. 이는 미성숙 감에 함유된 높은 폴리페놀 및 플라보노이드 함량에 기인한 것으로 생각되며, 페놀성 믈질이 증가할수록 높은 항산화능을 보인다는 기존 연구 결과와 일치한다고 볼 수 있다.⁴⁴⁾

감 시기별 성숙 정도에 따른 탄닌 함량변화 및 항염에 관한 연구¹⁴⁾ 등에 의하면 감은 성숙되면서 점차 탄닌의 함량이 줄어든다고 보고되어 있다. 탄닌 성분과 성숙 시기별 감의 생리활성 비교 연구⁴⁵⁾를 보면, 탄닌은 다양한 생리활성효능에 영향을 주기 때문에, 감의 수확 시기 조절을 통해 감의 효능을 높일 수 있음을 시사하고 있다.

β-Hexosaminidase는 비만세포의 과립안에 존재하며 면역학적 활성화로 인해 세포 밖으로 분비되며, 비만세포의 탈과립의 지표로 이용되고 알레르기 억제 물질의 생리활성 측정에 유용하게 사용된다.⁴⁶⁾ 항알레르기 평가를 위해 감작된 RBL- 2H₃ 세포에 IPEE를 처치하여 β-hexosaminidase를 분비량 측정한 결과 IPEE의 농도가 증가하면서 β-hexosaminidase 분비량이 감소하는 양상을 나타내었고 IPEE는 500 µg/mL 농도에서 83.05±6.6%의 우수한 억제 효과가 확인되었다. 시험물질의 RBL-2H₃ 비만세포의 탈과립에 미치는 효과를 확인하기 위해 IgE에 감작된 비만세포에서 방출 된 히스타민의 양을 일반적으로 측정하지만, 이때 방출되는 히스타민의 농도는 낮고 측정하는 과정이 복잡하여, 탈과립 지표로 β-hexosaminidase 농도를 대신 측정하는 방법을 많이 사용한다.⁴⁶⁾

비만세포는 표면에 IgE와 결합할 수 있는 Fc 수용체를 가지고 있으며 히스타민 등을 함유한 과립을 포함하고 있다. IL-4는 알러지 반응에 의해 분비되는 사이토카인으로 B세포의 IgE 생성에 영향을 미치며 체액성 면역반응의 예측에 많이 활용된다.⁴⁷⁾ 알레르기 피부염 과정에서 IL-4에 의해 유도된 IgE 생성은, 비만세포의 탈과립을 유도하고 히스타민을 방출 시켜 가려움을 유발하며 피부의 기능손실을 초래하게 된다. 본 시험에서도 IPEE에 의한 IL-4의 발현 정도를 확인한 결과 모든 군에서 농도 의존적으로 감소함이 관찰되어, 항알레르기 효과의 유효성을 확인할 수 있었다.

TNF-α는 랑게르한스 세포가 진피로 이동시키고 NO를 활성화시켜 염증을 유발하고, IL-6는 염증성 자극에 반응하여 다량 분비되어 B세포의 분화와 T세포의 증식에 관여한다.^{48, 49)} 본시험에서 RAW 264.7 cells을 통한 항염증 평가에 있어서는, IPEE의 농도에 의존적으로 LPS에 의한 NO생성을 저해하였으며, 최고 농도인 500 µg/mL에서는 94.5%의 NO 저해율을 보였다. 염증인자인 TNF-α, IL-6의 발현의 경우, IPEE를 처치한 모든 군에서 발현이 감소하였으며 특히 500 μg/mL의 농도에서 현저한 감소를 확인하였다.

BCOP assay는 소의 각막을 이용하여 시험물질에 대한 안 점막 자극을 평가하는 대체시험법으로, ⁵⁰⁾ 혼탁도와 투과도를 통해 자극을 분류하는 안점막 자극지수(IVIS)를 계산하여 시험물질의 자극여부를 판정한다. IPEE는 시험한 모든 농도에서 3이하의 값을 보여 비자극 물질로 판정되어 자극성이 없는 것으로 확인되었다.

결론

이상의 연구 결과, 미성숙 감 에탄올 추출물(immature persimmon ethanol extract, IPEE)은 함량 분석 실험에서 gallic acid 분석을 통해 적지 않은 탄닌과 폴리페놀 함량이 확인되었고, 항산화, 항알레르기 및 항염 효과에 있어서 기전적인 측면에서 효능을 확인할 수 있었으며, 자극에 대한 안전성도 확인되었다. 이를 바탕으로, 미성숙 감은 항염 및 항알레르기 효과가 있는 기능성 천연 소재로서 실용 가능성이 있을 것으로 판단되었다. 하지만 추후 실용화되기 위해서는, 추출물의 다양한 기전연구와 임상연구 등의 추가적인 연구가 필요할 것으로 사료된다.

Conflice of interest

The authors declare that we have no competing interests.