Anticancer Activity of Chloroform Fraction of Methanol Extract of Sparassis crispa in Human Cervical Cancer Stem Cells

자궁경부암 줄기세포에 대한 꽃송이버섯 메탄올 추출물의 클로로포름 분획의 항암 활성

Abstract

Sparassis crispa is an edible mushroom that has been widely utilized in Japan and Korea. It has various biological activities, such as anti-hypertensive, anti-allergic, anti-diabetic, anti-inflammatory, anti-angiogenic, and anti-cancer effects. In this study, we investigated the anticancer activity and underlying molecular mechanism of chloroform fraction of methanol extract of S. crispa (CESP) against cervical cancer stem cells (CSCs), which contribute to tumor initiation, recurrence, and resistance to therapy of human cervical cancer. CESP effectively inhibited the proliferation, tumorsphere formation, and migration of HeLa-derived cervical CSCs by promoting apoptosis. In addition, CESP significantly downregulated the expression of key cancer stemness markers, including integrin α6, CD133, CD44, ALDH1A1, Nanog, Oct-4, and Sox-2, in HeLa-derived cervical CSCs. Furthermore, CESP remarkably suppressed in vivo tumor growth of HeLa-derived cervical CSCs in a chick embryo chorioallantoic membrane (CAM) model. Therefore, our findings suggest that CESP has potential as a natural medicine for the prevention and treatment of cervical cancer by targeting CSCs.

자궁경부암은 2020년 통계에 따르면 전 세계적으로 604,000여명의 새로운 환자와 342,000여명의 사망자가 발생하였고, 여성에게서 발생한 전체 종양의 약 6%를 차지하여 네 번째로 많이 발생한 여성암이다.¹⁾ 많은 연구에 따르면 자궁경부암의 대부분은 인유두종 바이러스(human papillomavirus, HPV) 감염에 의해 발생한다.²⁾ 과학의 발전으로 백신에 의해 예방이 가능하지만 진행성 환자의 경우 재발, 약물 내성 및 전이로 인해 예후가 좋지 않다.³⁾ 현재 진행성 및 전이성 자궁경부암에 사용되는 천연물 유래 항암제로는 cisplatin, paclitaxel, mitomycin 등이 있으며, 다양한 조합을 통한 병용요법이 1차 요법으로 권장되고 있다.⁴⁾ 그러나 표준 화학 요법의 발전에도 불구하고 생존 기간은 여전히 짧고, 이는 자궁경부암의 화학 내성 특성을 보여주는 결과이다.⁵⁾ 따라서, 자궁경부암의 더 나은 치료를 위한 유망한 항암제의 개발이 필요한 실정이다.

최근 자궁경부암의 불량한 예후를 초래할 수 있는 중추적인 기여자가 암 줄기세포(cancer stem cell, CSC)임이 보고되고 있다.⁶⁾ 자궁경부암 줄기세포는 종양 이질성을 유발하고, 그 하위 세포들은 분화 능력을 기반으로 하는 계층적 구조로 조직되어 악성 종양 형성 및 치료 불응성을 유발한다.⁷⁾ 자궁경부암 줄기세포의 대표적인 특징은 Nanog, CD133, Oct-4, Sox-2, ALDH₁A1, Integrin α6, CD44등과 같은 줄기세포 특성의 유지에 관련된 바이오마커들을 비정상적으로 발현시킨다.^{8, 9)} 또한, HPV 바이러스에 의해 발암 유전자 E6와 E7이 발현되며, 이는 세포자멸사(apoptosis)에 대한 저항성을 유발하게 되어 비정상적으로 증식할 수 있게 된다.¹⁰⁾ 따라서, 종양의 형성 과정과 내성 및 재발에서 암 줄기세포가 핵심적인 역할을 하고 있음이 입증됨에 따라, 자궁경부암 줄기세포를 표적하고 세포자살을 유도하는 것은 자궁경부암 치료에 필수적이다.

천연물은 예로부터 암을 비롯한 여러 질병의 예방 및 치료에 사용되어 왔으며, 실제로 현재 사용되는 항암제의 49% 이상이 천연물이거나 천연물에서 직접 파생된 것이다.¹¹⁾ 지금까지 많은 연구들에서 다양한 천연물들이 항암 활성을 갖고 있음이 보고되었다.^12-17) 꽃송이버섯으로 불리는 Sparassis crispa(Wulf.)는 면역력 강화, 항염증, 고지혈증 개선, 혈압강하, 항암 및 항혈관신생 효과와 같은 다양한 생리활성을 갖고 있다.^18-21) 꽃송이버섯은 베타글루칸(β-glucan), 페놀 화합물 및 렉틴과 같은 다양한 기능성분들을 함유하고 있고, 특히 다당류인 베타글루칸은 당뇨병 및 암과 같은 질병을 예방하고 치료하기 위한 활성물질로 연구가 활발히 이루어졌다.^22-26) 앞선 연구에 따르면 위암, 폐암 및 간암 세포주에서 꽃송이버섯 에탄올(ethanol) 추출물의 항암 효과에 대한 연구가 보고되어 있다.²⁵⁾ 또한, 우리의 최근 연구에서는 꽃송이버섯 메탄올 추출물의 클로로포름(chloroform) 소수성분획이 항혈관신생 및 항염증 효과를 나타냄을 새롭게 확인하였다.^{18, 21)} 그러나, 꽃송이버섯 추출물의 자궁경부암 줄기세포에 대한 항암 활성은 아직 연구된 바가 없다. 이에 따라 본 연구에서는 자궁경부암 줄기세포에 대한 꽃송이버섯 메탄올 추출물의 클로로포름 분획(chloroform fraction of methanol extract of Sparassis crispa, CESP)의 항암 효과와 그 작용 메커니즘을 처음으로 입증하였다.

재료 및 방법

시약 및 재료 − 건조된 꽃송이버섯(Sparassis crispa)은 LK Biotech(Cheonan, Korea)에서 제공받았다. 꽃송이버섯의 자실체는 한국등록특허 제10-1480396호에 기재된 방법으로 배양되었고, 한국 전남식품산업연구센터에서 동정하였다(표본번호 1307-018). 본 연구에 사용된 꽃송이버섯 원생 약의 표본은 선문대학교 유전체기반 바이오-IT 융합연구소에 보관되어 있다(표본번호 NCB-CESP-2017). DMEM/F12 (Dulbecco’s Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12) 배지는 HyClone(Marlborough, MA, USA)에서 구입하였고, epidermal growth factor(EGF)와 basic fibroblast growth factor(bFGF)는 Prospecbio(East Brunswick, NJ, USA) 에서구입하여 사용하였다. Fetal bovine serum(FBS), B-27 serum free supplement, L-glutamine, penicillin/streptomycin은 Gibco (Grand Island, NY, USA)에서 구입하였다. 단백질 항체는 Cell Signaling Technology(Danvers, MA, USA)에서 구입하여사용하였고, CellTiter-Glo^® luminescent assay kit, wound healing assay kit, Muse^® Annexin V & Dead Cell kit는 각각 Promega (Madison, WI, USA), ibidi GmbH(Munich, Germany), Luminex(Austin, TX, USA)에서 구입하였다. Matrigel은 Corning Costar(Acton, MA, USA)에서 구입하여 사용하였다.

꽃송이버섯의 추출 − 꽃송이버섯 건조 분말 100 g을 메탄올(methanol) 600 mL에 첨가하고 혼합물을 실온에서 24시간 동안 교반 후 여과시켰다. 이어서, 꽃송이버섯의 메탄올 추출물을 회전식 감압농축기로 농축하였다. 유의한 소 수성 물질을 획득하기 위해 농축된 추출물을 100 mL 증류수에용해시킨 후 헥산(hexane) 100 mL을 추가하여 24시간 동안교반하였다. 헥산층을 제거한 후 클로로포름(chloroform) 100 mL를 시료에 넣고 24시간 동안 교반하였다. 수층이 제거된클로로포름층을 회전식 감압농축기로 농축하고, 농축물은 24시간 동안 -110°C에서 동결 건조하여 꽃송이버섯 메탄올 추출물의 클로로포름 분획(CESP)을 수득하였다.²¹⁾ 시료는 dimethylsulfoxide(DMSO)에 녹여 200 mg/mL의 농도로 만들어 냉장보관하고 실험에 사용하였다.

HeLa 유래 자궁경부암 줄기세포 배양 − 무혈청 배지 (serum-free media)를 이용한 삼차원(3D)의 스페로이드 (spheroid) 세포 배양은 암세포주로부터 암줄기세포만을 선택적으로 분리 및 성장시킬 수 있는 효과적인 방법으로 입증되었다.^{27, 28)} 따라서, HeLa 자궁경부암 세포주로부터 줄기세포 특성을 가진 암세포만을 높은 비율로 증식시키기 위해, 1X B-27, 5 µg/mL heparin, 2 mM L-glutamine, 20 ng/mL bFGF, 20 ng/mL EGF, 1% penicillin/streptomycin이 포함된 DMEM/F12 무혈청 배지를 사용하여 이산화탄소 세포 배양기(37°C, 5% CO₂)에서 현탁배양(suspension culture)을 하였다. 7일 후, 형성된 HeLa 유래 자궁경부암 종양구체 (tumorsphere)를 회수한 후 Accutase(Millipore, Temecula, CA, USA)를 처리하여 단일세포로 분리하였다. 이 단일 세포를 다시 무혈청 배지에서 7일 동안 배양하여 형성된 종양 구체를 단일세포로 분리하는 과정을 2~3회 반복함으로써, 고비율로 자궁경부암 줄기세포를 획득하여 실험에 사용하였다.

자궁경부암 줄기세포의 증식도 분석 − 꽃송이버섯 메탄올 추출물의 클로로포름 분획(CESP) 처리에 의한 세포 증식억제 활성은 CellTiter-Glo^® luminescent assay를 이용하여 측정하였다. HeLa 유래 자궁경부암 줄기세포(5×10³ cells/ well)를 0.3% agarose로 코팅한 96-well white plate의 각 well에 분주한 후, 꽃송이버섯 추출물을 다양한 농도(6.25- 400 µg/mL)로 처리하였다. 이를 7일간 배양한 다음, 각 well에 기질 용액 20 µL를 첨가하고 2분 동안 교반 후 8분 동안 반응 시켜 microplate reader(BioTek, Inc., VT, USA)를 사용하여 발광을 측정함으로써, 꽃송이버섯 추출물의 자궁경부암 줄기세포 증식 저해 활성 정도를 조사하였다. IC₅₀값은 GraphPad Prism, version 5(GraphPad Software, La Jolla, CA, USA)의 curve-fitting 프로그램으로 분석되었다.

자궁경부암 줄기세포의 종양구체 형성 분석 − HeLa 유래 자궁경부암 줄기세포(5×10³ cells/well)를 0.3% agarose로 코팅한 96-well plate의 각 well에 분주한 후, 꽃송이버섯 추출물(CESP)을 다양한 농도(6.25-400 µg/mL)로 처리하였다. 이를 7일간 배양한 다음, 형성된 종양구체의 크기를 위상차 현미경(Olympus, Center Valley, PA, USA)을 이용하여 200배로 관찰하였고, 직경이 >75 µm인 종양구체의 수를 세었다.

자궁경부암 줄기세포의 이동능력 분석 − 꽃송이버섯 메탄올 추출물의 클로로포름 분획(CESP) 처리에 의한 세포 이동 억제 활성은 wound healing assay를 이용하여 분석하였다. 세포를 부착시키기 위해, 1% laminin 용액으로 코팅 후 건조한 24-well plate를 사용하였다. 각 well에 ibidi culture- insert를 부착한 후 HeLa 유래 자궁경부암 줄기세포(2×10⁵ cells/70 µL)를 각 insert안에 분주하여 24시간 동안 배양하였다. Insert를 떼어내고 1X PBS 용액으로 부착되지 않은 세포를 제거한 후, 꽃송이버섯 추출물을 30, 60 µg/mL 농도로 처리하였다. 위상차 현미경을 이용하여 100배로 세포의 이동 정도를 시간별로 관찰하였다.

자궁경부암 줄기세포의 세포사멸 분석 − 꽃송이버섯 메탄올 추출물의 클로로포름 분획(CESP) 처리가 세포사멸 (apoptosis)에 미치는 영향을 분석하기 위해, HeLa 유래 자궁경부암 줄기세포(2×10⁵ cells/well)를 60-mm culture dish에 분주하고 CESP를 50, 100, 200 µg/mL의 농도로 48시간 동안 처리하였다. 세포를 회수하여 PBS로 세척한 후 100 µL의 Muse^® Annexin V & Dead Cell 시약으로 20분 동안 염색한 다음, Guava^® Muse^® Cell Analyzer를 사용하여 세포사멸을 분석하였다.

자궁경부암 줄기세포의 단백질 발현 분석 − 꽃송이버섯 메탄올 추출물의 클로로포름 분획(CESP) 처리가 암 줄기세포 특성 조절인자들의 단백질 발현에 미치는 영향은 western blot analysis를 이용하여 확인하였다. 60-mm culture dish에 HeLa 유래 자궁경부암 줄기세포(5×10⁵ cells/well)를 분주하고 꽃송이버섯 추출물을 50, 100 µg/mL의 농도로 48시간 동안 처리하였다. 세포를 회수하여 RIPA buffer(ATTO, Tokyo, Japan)로 용해한 후, 동일한 양의 세포용해액을 10% sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis(SDS- PAGE)로 분리하였다. 분리된 단백질을 표준 electroblotting 절차에 따라 polyvinylidene difluoride(PVDF) membrane으로 옮긴 후, 4°C에서 Nanog, CD133, Oct-4, Sox-2, ALDH1A1, Integrin α6, CD44, β-actin에 대한 일차 항체로 면역 표지하였다. 면역 표지는 제조사의 지침에 따라 enhanced chemiluminescence(ECL) kit(Biorad, Berkeley, CA, USA) 로 검출하였다.

자궁경부암 줄기세포의 in vivo 종양형성 분석 − 꽃송이버섯 메탄올 추출물의 클로로포름 분획(CESP) 처리에 의한 in vivo 종양 형성 억제활성은 chick embryo chorioallantoic membrane(CAM) assay를 이용하여 확인하였다. 수정된 유정란을 37°C 부화기에서 4일 동안 배양하였다. 계란의 윗부분에 송곳으로 작은 구멍을 내어 계란 안쪽의 공기가 빠져나가도록 24시간 동안 부화기에서 유지시킨 후, 구멍 주변으로 1 cm이내의 작은 창을 만들었다. Matrigel(10 mg/mL, 30 µL/egg)과 HeLa 유래 자궁경부암 줄기세포 배양액(10 µL, 1×10⁶ cells/egg)을 혼합한 후, 꽃송이버섯 추출물(100 µg/egg) 과 대조군(DMSO)을 각각 처리하였다. 이어서, 이러한 혼합액을 이산화탄소 세포배양기(37°C, 5% CO₂)에서 30분 동안 굳혔고, CAM 표면에 실리콘 링(직경 8 mm, 두께 1 mm)을올려 그 안쪽에 굳힌 혼합액을 주입하였다. 창을 거즈로 덮고 유정란을 다시 부화기에 넣어 7일간 배양한 후, 형성된 종양을 회수하여 각각의 크기와 무게를 측정하였다.

통계처리 − 결과는 최소 3번의 독립적인 실험에서 얻은 평균±표준 편차(SD)로 표시되었다. 결과의 통계분석은 SPSS 9.0(SPSS Inc., Chicago, IL, USA)의 ANOVA를 이용하였다. 사후 분석은 Tukey의 다중비교검정법을 사용하여 수행되었으며, p<0.05는 통계적으로 유의한 차이를 나타내는 것으로간주되었다.

결과 및 고찰

꽃송이버섯 추출물의 자궁경부암 줄기세포 증식 저해 효과 − 첫번째로, 꽃송이버섯 메탄올 추출물의 클로로포름분획(CESP)이 자궁경부암 줄기세포의 증식에 영향을 미치는지를 조사하였다. HeLa 유래 자궁경부암 줄기세포에 CESP 를 다양한 농도 범위(0-400 µg/mL)로 7일 동안 처리하였고, 세포 증식은 ATP-monitoring luminescence assay를 이용하여 분석하였다. CESP의 처리 농도가 증가함에 따라 처리하지 않은 대조군에 비해 세포의 증식이 억제되었으며 IC₅₀ 값은 26.65 µg/mL로 측정되었다(Fig. 1A). 다음으로, HeLa 유래 자궁경부암 줄기세포의 종양구체 형성능력에 대한 CESP의효과를 분석하였다. CESP를 다양한 농도(0-400 µg/mL)로 7일 동안 처리한 결과, 종양구체의 크기와 수가 농도 의존적으로 감소하였고 종양구체 형성 저해에 대한 IC₅₀ 값은 33.80 µg/mL로 측정되었다(Fig. 1B, C). 이러한 결과는 꽃송이버섯 메탄올 추출물의 클로로포름 분획이 HeLa 유래 자궁경부암 줄기세포의 증식과 종양구체 형성 능력을 효과적으로 억제함을 입증한다.

Fig. 1. CESP inhibits the proliferation and tumorsphere formation of HeLa-derived cervical CSCs. (A) Effect of CESP on the proliferation of HeLa-derived cervical CSCs. Cells were treated with CESP (0-400 μg/mL) and incubated for 7 days. Cell proliferation was measured using the CellTiter-Glo^® luminescent assay. (B, C) Effect of CESP on the tumorsphere forming ability of HeLa- derived cervical CSCs. Cells were treated with CESP (0-400 μg/mL) and incubated for 7 days. The number and size of tumor spheres in each well were observed under an optical microscope. Each value represents the mean±SD of three different experi-ments. *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001 vs. the control.

꽃송이버섯 추출물의 자궁경부암 줄기세포 이동능력 억제 효과 − 꽃송이버섯 메탄올 추출물의 클로로포름 분획(CESP) 이 자궁경부암 줄기세포의 이동(migration) 능력에도 영향을 미치는지 조사하기 위해, wound healing assay를 수행하였다. Laminin으로 코팅한 plate에 HeLa 유래 자궁경부암 줄기세포를 부착하고 CESP를 30, 60 µg/mL의 농도로 처리하였다. 6 h 경과 후, CESP를 처리한 세포의 이동 정도는 대조군과 비슷한 수준으로 나타났다(Fig. 2). 그러나, 24 h 경과 후에 대조군과 CESP 처리군을 비교하였을 때 30과 60 µg/mL 농도에서 HeLa 유래 자궁경부암 줄기세포의 이동능력을 각각19와 40% 억제하였다. 이러한 결과는 꽃송이버섯 메탄올 추출물의 클로로포름 분획이 HeLa 유래 자궁경부암 줄기세포의 전이능력을 저해할 수 있음을 시사한다.

Fig. 2. CESP inhibits the migration of HeLa-derived cervical CSCs. Cell migration was measured using the wound healing assay. Cells were incubated in the absence or presence of CESP (30, 60 μg/mL) for 24 h. The migrated area was calculated at the indicated time points using ImageJ software (version 1.5: NIH). Dotted black lines indicate the gap at 0 h. Each value represents the mean±SD of three different experiments. *p<0.05 vs. the control.

꽃송이버섯 추출물의 자궁경부암 줄기세포 사멸 유도 효과 − 세포자멸사(apoptosis)의 유도는 암 줄기세포를 억제하는 치료 전략 중 하나로 여겨지고 있다.⁸⁾ 꽃송이버섯 메탄올 추출물의 클로로포름 분획(CESP)의 자궁경부암 줄기세포에 대한 항암 활성이 세포자멸사 유도와 관련되어 있는지 확인하기 위해, HeLa 유래 자궁경부암 줄기세포에 CESP를 50, 100, 200 µg/mL의 농도로 처리하고 48 시간 동안 배양하였다. 세포를 회수하여 Annexin V/PI 형광 염색을 한 후유 세포 분석(flow cytometry)을 수행한 결과, 대조군의 경우 apoptotic cell의 비중이 17.38%인 반면, CESP를 50, 100, 200 µg/mL의 농도로 처리했을 때 각각 28, 28.95, 48.1%로 현저하게 증가되었다(Fig. 3). 이러한 결과는 꽃송이버섯 메탄올 추출물의 클로로포름 분획이 세포자멸사를 유도함으로써 HeLa 유래 자궁경부암 줄기세포의 증식과 종양 구체형성을 저해하였음을 나타낸다.

Fig. 3. CESP causes the cellular apoptosis of HeLa-derived cervical CSCs. Cells were treated with CESP (50, 100, 200 μg/mL) for 48 h. The apoptotic cell death was evaluated using a Guava^® Muse^® Cell Analyzer with Muse^® Annexin V & Dead Cell kit. Each value represents the mean±SD of three different experiments. *p<0.05, **p<0.01 vs. the control.

꽃송이버섯 추출물의 자궁경부암 줄기세포 조절인자 발현억제 효과 − 자궁경부암 줄기세포는 다양한 줄기 마커 (stemness marker)들을 과도하게 발현하여, 자가재생, 종양 형성, 화학적 내성, 증식 및 전이를 유도한다고 보고되어 있다.²⁶⁾ HPV는 CD44와 CD133과 같은 세포 표면 마커들을 통해 자궁경부 상피 줄기세포를 표적하여 E6 및 E7 종양단백질을 발현시킨다.²⁶⁾ 이는 Oct-4, Nanog, Sox-2, ALDH₁A1, Integrin α6와 같은 자궁경부암 줄기세포의 형성 및 특성 유지에 중요한 주요 조절인자들의 발현을 촉진하여, 암 줄기세포의 세포자멸사를 억제하고 전이, 종양구체 형성 및 약물내성을 유발한다.²⁶⁾ 따라서, 꽃송이버섯 메탄올 추출물의 클로로포름 분획(CESP)이 자궁경부암 줄기세포의 주요 조절 마커들의 발현에 영향을 미치는지 알아보기 위해, HeLa 유래 자궁경부암 줄기세포에 CESP를 50, 100 µg/mL 농도로 48 시간 동안 처리한 후 western blot을 수행하여 마커들의 단백질 발현 정도를 확인하였다. 분석 결과, CESP는 암 줄기세포 미세환경 유지 및 항상성 조절에 중요한 역할을 하는 Integrin α6의 발현을 농도 의존적으로 억제하였을 뿐만 아니라, 암 줄기세포 표면 마커인 CD133과 CD44의 발현을 현저하게 저해하였다(Fig. 4). 또한, CESP는 암 줄기세포의 약물 내성에 관여하는 ALDH₁A1과 암 줄기세포의 자가재생과 분화를 조절하는 핵심 전사인자들인 Nanog, Oct-4, Sox-2의 발현을 효과적으로 감소시켰다. 그러므로, 이러한 결과들은 꽃송이버섯 메탄올 추출물의 클로로포름 분획 이주요 줄기 조절 마커들의 발현을 억제함으로써 HeLa 유래 자궁경부암 줄기세포에 대한 항암활성을 나타냄을 입증한다.

Fig. 4. CESP downregulates the expression of cancer stemness markers of HeLa-derived cervical CSCs. Cells were treated with CESP (50, 100 µg/mL) for 48 h, and the protein levels of stemness markers were detected by western blot analysis using specific antibodies and were further quantified by densitometry. β-actin levels were used as an internal control. Each value represents the mean±SD of three different experiments. *p<0.05 vs. the control.

꽃송이버섯 추출물의 자궁경부암 줄기세포 in vivo 종양 형성 억제 효과 − 꽃송이버섯 메탄올 추출물의 클로로포름분획(CESP)의 자궁경부암 줄기세포에 대한 항암활성을 in vivo 종양 형성 실험을 통해 검증하기 위해, chorioallantoic membrane(CAM) assay를 수행하였다. HeLa 유래 자궁경부암 줄기세포와 CESP(100 µg)를 혼합하여 굳힌 Matrigel을 CAM 표면에 주입하여 7일간 배양한 후, 형성된 종양의 크기와 무게를 비교하였다. 그 결과, 대조군의 종양 무게는 13.1±6.3 mg인 반면, CESP처리군의 종양 무게는 1.7±0.8 mg 으로 자궁경부암 줄기세포의 종양 형성이 현저하게 저해되었다(Fig. 5). 이러한 결과는 꽃송이버섯 메탄올 추출물의 클로로포름 분획이 HeLa 유래 자궁경부암 줄기세포의 in vivo 종양 형성 능력을 유의하게 억제함을 입증한다.

Fig. 5. CESP suppresses in vivo tumor growth of HeLa-derived cervical CSCs in a CAM model. Fertilized chick eggs were incubated in a humidified incubator at 37°C. At embryonic day 5, HeLa-derived cervical CSCs were mixed with Matrigel in the absence or presence of CESP (100 μg/egg) and implanted onto the CAM surface inside the silicone ring. Seven days later, the CAMs were photographed, formed tumors were retrieved, and tumor weight was calculated. Each value represents the mean±SD of three different experiments. *p<0.05 vs. the control.

암 줄기세포(cancer stem cell)는 종양 조직 내에서 1~3%의 적은 양으로 존재하지만, 높은 종양형성능, 자가재생과 분화능 등의 특징을 가지고 있어 종양 내 이질성, 암의 재발 및 항암치료 내성에 핵심적인 역할을 담당하고 있다.^{6, 7)} 자궁경부암에서도 암 줄기세포가 나쁜 임상적 예후와 관련되어 있음이 보고되어, 자궁경부암 줄기세포를 제거하기 위한 효과적인 치료법의 발굴 및 치료제의 개발이 요구되고 있다.^{8, 9)} 우리는 최근 꽃송이버섯 메탄올 추출물의 클로로포름소수성 분획이 항염증 및 항혈관신생 활성을 나타냄을 새롭게 확인하였다.^{18, 21)} 이러한 소수성 분획은 nuclear factor- κB(NF-kB) 및 mitogen-activated protein kinase(MAPK) 신호전달 경로를 억제하여 lipopolysaccharide(LPS) 자극에 의해 유도된 RAW 264.7 대식세포주의 염증 활성을 효과적으로 억제하였다.¹⁸⁾ 또한, 이 소수성 분획은 vascular endothelial growth factor receptor 2(VEGFR2) 매개 신호전달 경로를 억제하여 혈관내피세포성장인자(VEGF)에 의해 유도된 인간 제대 정맥 내피세포(HUVEC)의 혈관신생 촉진 활성을 저해하였다.²¹⁾ 현 연구에서 우리는 꽃송이버섯 메탄올 추출물의 클로로포름 분획이 자궁경부암 줄기세포의 증식과 전이 능력을 저해할 뿐만 아니라 자궁경부암 줄기세포의 in vivo 종양 형성 능력을 효과적으로 억제할 수 있고, 이러한 항암효능이 세포자멸사 유도 및 줄기 조절 마커들의 발현 억제에 근거함을 새롭게 밝혀내었다. 비록, 앞선 보고에서 꽃송이버섯 에탄올 추출물이 위암, 폐암 및 간암 세포주에서 항암 활성을 나타낸다고 알려져 있지만, ²⁵⁾ 꽃송이버섯 메탄올 추출물의 클로로포름 분획의 자궁경부암에 대한 항암 활성은 연구되어 보고된 바가 없다. 또한, 꽃송이버섯의 주요 친 수성 성분인 베타글루칸(β-glucan)이 자궁경부암의 예방 및 치료효능이 있는 것으로 알려져 있으나, ²⁹⁾ 현 연구에서 우리는 꽃송이버섯의 소수성 유효성분들을 포함하고 있는 메탄올 추출물의 클로로포름 분획이 자궁경부암 줄기세포에 대해 항암 효과를 가짐을 처음으로 입증하였다. 그러므로, 우리의 현 연구 결과는 꽃송이버섯 소수성 추출물이 앞선 연구에서 확인한 항염증과 항혈관신생 활성 뿐만 아니라 자궁경부암에 대한 우수한 항암 활성을 나타냄을 새롭게 밝혀내어, 천연물의약품 또는 건강기능식품 개발을 위한 유용한 천연물 소재로 활용될 수 있음을 시사한다. 향후 연구에서는 꽃송이버섯 메탄올 추출물의 클로로포름 분획 내의 유효 소수성 성분들을 분리 및 동정하여 약리 기전을 보다 심층적으로 규명해야 할 것으로 사료된다.

결론

본 연구에서는 꽃송이버섯 메탄올 추출물의 클로로포름분획(CESP)의 자궁경부암 줄기세포에 대한 항암 활성을 확인하였다. 그 결과, CESP는 25-200 µg/mL의 농도 범위에서 HeLa 유래 자궁경부암 줄기세포의 증식, 종양구체 형성 및 이동 능력을 유의적으로 억제하였다. 특히, CESP의 HeLa 유래 자궁경부암 줄기세포에 대한 항암 효과는 세포자멸사 유도 뿐만 아니라 CD133, CD44, Integrin α6, ALDH1A1, Nanog, Oct-4, Sox-2와 같은 줄기 특성 조절인자들의 발현저해에 근거한 것임을 확인하였다. 또한, CAM assay를 통해 CESP가 HeLa 유래 자궁경부암 줄기세포의 in vivo 종양 형성 능력을 효과적으로 억제함을 입증하였다. 따라서, 본 연구는 꽃송이버섯 메탄올 추출물의 클로로포름 분획이 자궁경부암 줄기세포의 자멸사 촉진과 주요 자궁경부암 줄기 조절 마커들의 발현을 억제함으로써 HeLa 유래 자궁경부암 줄기세포에 대한 항암 활성을 나타냄을 새롭게 밝혀내어, 자궁경부암의 예방 및 치료를 위한 유용한 천연물 소재로의 활용 가능성을 시사한다.