배양육 조직구현을 위한 배향성 부여에 관한 연구

A Study on Conferring Orientation to Myoblast for Realizing Tissue of Cultured Meat

Abstract

The limitations of food production caused by global warming, consumption of soil fertility, and land shortage have demanded the development of alternative foods. Their market has been increasing, and in particular, there is an urgent need for an alternative meat. Among them, the non-slaughtered cell-cultured meat that can be manufactured in the laboratory, that is, cultured meat, is in the spotlight, which can solve the problem of meat consumption while including the advantages of meat. It is classified into minced cultured meat and structured one with a structure similar to that of real meat. The latter is currently facing limitations related scaffolds, cells, and the multiplicative problems, and many attempts are being made to solve them. The complex problem is related to secure texture and taste as well as structural similarity to actual meat. To solve the problems, it is necessary to lay emphasis on cells, there are fat cells and vascular cells, and the most fundamental cells, muscle cells. These are the main cells that control the texture and nutrients of meat, and unlike other cells, they grow in the form of fibers. A myofibril (also known as a muscle fibril) is a basic rod-like organelle of a muscle cell, which is a quantitatively major component of meat, and one of the tissues that maintain the appearance of the body and bones. In this review article, we focused on the growth of muscle cells into long, tubular cells known as muscle fibers using the fabricated fibrous scaffold, and reviewed not only research results for muscle tissue engineering but also various results in the related fields for the last five years.

1. 서론

인류가 발전함에 따라 많은 부작용이 동반되며, 환경오염은 지속되고 있다. 이러한 환경오염의 주축에는 인간이 필요로 하는 단백질의 1/3 이상을 제공하며, 매년 10억명의 식량을 책임지고 있는 축산업이 자리잡고 있다. 축산업은 다양한 부분에서 환경 오염을 유발하는데, 온실가스 배출의 14.5%를 차지하며, 수질오염은 물론 담수 소비의 10%를 차지한다. 또한, 전 세계의 바이오매스의 60%를 소비하는 등 다양한 오염을 유발하고 있는 실정이다^1,2). 이러한 축산업의 문제를 해결하고자 시작된 배양육의 개발을 위해 다양한 연구들이 진행되고 있다.

현재 중점을 두고 있는 연구는 실제 고기의 조직과 유사한 구조를 구축하는 것이다²⁾. 현재 다짐육^3,4)이나, 필름 수준의 얇은 고기^5,6)는 어느 정도 개발과 상품화에 접어들었지만, 실제 고기와 유사한 조직 및 구조의 배양육은 여러 기술적인 측면에서 한계점에 도달하였다.

고기의 실제 조직과 유사한 3차원 구조의 배양육을 만들기 위해서는 다양한 조건을 만족시켜야 하는데, 그 중 가장 중요한 것은 조직의 구현이다²⁾.

조직의 형상은 흔히 우리가 부르는 식감은 물론 외형, 지방과 단백질의 적절한 배치를 통한 맛, 그리고 고기의 주성분인 근섬유의 형성에 영향을 미친다. 우리가 흔히 먹는 고기는 근육조직이 주를 이루며, 사이사이 지방조직이 마블링이라고 부르는 형태로 들어가 있는 상태이다.

실제 고기와 유사한 3차원 배양육을 위해서는 이들 사이의 구획화와 동시에 또 다른 구조적인 부분을 해결해야 하는데, 쉽게 말해 그것은 근조직의 구현이다^7-11). 흔히 우리가 먹는 고기의 근조직은 골격근으로써, 이들의 형태는 우리가 흔히 배양하는 부착세포와 같이 성상모양을 이루는 것이 아닌, 근아세포가 근생성이라 불리는 성숙과 분화를 통해 하나의 세포로 되어 버린 다핵세포이다. 이러한 근세포들은 세포외기질로 이어지며 근섬유가 되고, 이들이 모여 하나의 조직을 이루는데 여러 개의 빨대가 꽂혀 있는 통과 같은 형태가 된다^7,9-11).

고기는 주로 골격근으로 구성되며, 이는 근섬유 다발과 지방, 결합 조직에 의해 다발이라 하는 작은 단위체로 고정되어 있다. 이러한 다발에는 수십 개의 작은 근섬유 다발이 포함되어 있고, 이는 정렬된 근세포로 구성되어 있다⁷⁾(Figure 1).

Figure 1. Schematic representation of the hierarchical structure of vertebrate muscle; a) cross-sectional view of a muscle with a single fascicle, muscle fiber, myofibril, and sarcomere magnified to show detail, b) mammalian/avian and c) fish muscle cut longitudinally and in cross-section to highlight their structural homology. Copyright 2021, WILEY-VCH Verlag GmbH⁷⁾.

이러한 조직의 형태를 in vitro에서 얻기 위해서는 단순한 배양으로는 불가능하다. 일반적인 생물학적 자극을 통해서 근아세포들을 섬유화하면 근섬유로 분화는 가능하다. 하지만 이렇게 형성된 근섬유는 배향성을 갖고 있지 않은 상태로 Figure 2와 같이 난립한 형태로 분화하게 된다^12-15). 이렇게 난립한 근섬유는 우리가 알고 있는 근조직의 형태가 아니며, 이는 진짜 고기와 비슷한 배양육이 아닌 근섬유 덩어리에 불과하게 된다. 이를 해결하기 위한 방법은 선행된 인간 근육 재생을 위한 연구에서 제시되고 있다. 그것은 바로 근아세포에 배향성을 부여하는 것이다¹⁵⁾. 이를 위한 방법은 물리적^16,17), 전기적^16,18), 생물학적 방법¹⁹⁾ 등 다양한 방법이 있지만, 가장 간단하면서도 직관적이고, 효과적인 방법인 근아세포 자체의 정렬을 유도하는 것이다.

Figure 2. Regulation of bovine myotube alignment using micropatterned thermoresponsive culture substrates prepared with different patterning conditions; (a) schematic illustration of photo-induced micropatterning of PAAm on a PIPAAm-grafted substrate, (b) fluorescence image of fluorescently-labeled fibronectin immobilized on the micropatterned substrate (photo-irradiation time: 20 min). (c–f) Microscopic images of myotubes differentiated on (c) non-patterned or (d–f) patterned substrates (photo-irradiation time: (d) 7 min, (e) 10 min, and (f) 20 min) were taken on Day 2 after induction of differentiation. Histograms of orientation of the myotubes were analyzed from six samples in each group. Copyright 2022, Elsevier Inc.¹⁵⁾.

앞서 말한 물리적, 전기적, 생물학적 방법들은 지지체의 특수한 물성(탄성, 전도성)이나 또는 배양과정에서의 생물학적 처리(성장인자 처리 및 농도구배 조성, 공배양 비율 및 환경 조성), 지속적인 환경 유지(배향성을 가진 자기장, 전기장, 장력등의 부여) 등이 반드시 필요하다. 이러한 한계는 향후 대량 생산 및 대량 배양이 필요한 배양육 시장에서 단점이 될 수 있다.

반면 지지체 자체의 배향성을 부여하는 방법은 제조 공정 단계 이후에 다른 방법과 같은 특정 물성 확보, 배양 조건 구현, 지속적 환경 유지 등이 아닌 기본적인 배양 조건의 구성만이 필요하다. 이러한 장점을 가지고 있는 배향성 지지체 연구는 기존의 근육 재생 연구^20,21,23) 또는 뼈 재생 연구²²⁾ 등 배향성이 요구되는 지지체 개발에서 선행되어 왔다.

본 리뷰논문에서는 근아세포에 배향성을 부여하기 위한 방법 가운데, 섬유형 지지체를 통한 배양육의 제조를 위해 이전 선행되었던, 근조직 재생용 섬유형 지지체 제조 방법에 초점을 두고 다루고자 한다.

2. 실험

2.1 근섬유의 배향성 부여를 위한 제조 방법

현재까지 개발되어온 지지체의 제조법은 기존에 선행되어 왔던 섬유의 방사와 방직(용융 방사, 건조 방사, 습식 방사, 전기 방사, 접촉 방사)부터 시작하여 최근의 3D 프린팅까지 다양한 방법이 있다. 우리는 이러한 섬유형 지지체를 통한 지지체 내부의 미시적, 거시적 배향을 통한 세포의 정렬 방법에 대해서 말하고자 한다.

2.1.1 방사법

방사법은 인류의 의류 역사와 같이 시작되었다고 해도 무방하다. 방사는 식물성 섬유를 이용한 의류의 역사와 함께 동반되며, 고분자의 시대가 열렸을 때에도 계속해서 인류와 함께 해왔다. 현재는 단순히 직물을 제조하여 의류에 적용되는 것 외 다양한 분야에도 적용되고 있으며, 그 중 조직공학용 지지체 개발로도 이어졌다²⁴⁾. 방사에는 용융 방사^25,26), 습식 방사^27-29), 건식 방사³⁰⁾, 용액 방사, 계면 방사, 전기 방사^31-34), 접촉 방사^32,33) 등 다양한 방법이 존재한다(Figure 3).

Figure 3. Schematic diagram of a) melt spinning, b) wet spinning, c) dry spinning, d) electrospinning, e) touch spinning, and f) 3D printing.

2.1.1.1 용융 방사

용융 방사는 고분자의 용융 온도가 열분해 온도보다 낮을 때 사용되는 방법으로써, 압출기를 통해 가열 및 가압 마찰하여 용융해낸 고분자 용융액을 압출하여 연속적인 고분자 필라멘트를 제조하는 방법으로 공기나 액체를 통해 냉각시켜 제조하는 방법이다.

Kenny 연구팀은 poly-ε-caprolacton(PCL)을 이용한 방법으로, 분자량 80,000 Da의 PCL을 185-235℃ 온도로 압출하여 단일 필라멘트와 다중 필라멘트를 제조하고, 이를 직조하여 지지체를 제조하였다²⁵⁾. 또한, Wei 연구팀의 경우 poly(glycolic acid)(PGA)와 Poly-l-Lactic Acid(PLLA)를 255℃로 가열하여, 1.0 ~2.5km/min의 속도로 사출한 뒤 이를 1.4의 연신비로 95℃ 조건에서 연신 하였으며, 최종 단계에서 액체 질소로 급랭하여 지지체를 제조하였다²⁵⁾.

2.1.1.2 습식 방사

습식 방사는 용융 방사와는 달리 고분자의 용융 온도가 열분해 온도보다 높을 때 사용하는 방법으로, Figure 2(A)와 같이 압출기로부터 고분자 용융액 또는 용액에 가교제 또는 응고제가 포함된 욕조에 담구어 섬유를 제조하고 권취하는 방법이다. 이 방법은 의류용 섬유에 응용된 역사가 길며, 수십 년 동안 생체 모방용 섬유 제조에 사용되어 왔다.

Kim 연구팀은 근조직과 유사한 지지체를 얻기 위해, 전통적인 습식 방사를 통해 콜라겐이 배향된 지지체를 제조하였다. 이들은 말의 힘줄로부터 얻은 I/II형 콜라겐 입자를 아세톤(350 mM) 또는 염산(10mM) 수용액에 여러 농도(5~15mg/ml)로 용해한 후, 이를 1:50(v/v)(pH9)의 NH₄OH와 아세톤으로 구성된 응고욕내로 압출하였다. 이 때, 압출되는 용액의 직경은 압출기의 니들(27G, 21G, 18G)로 조절하였으며, 압출 속도는 각각 30, 45-50, 70-75μl/min으로 조절하였으며, 응고된 섬유는 상온에서 공기 건조 후 권취되었다. 이렇게 얻은 한 가닥의 섬유를 21개의 날실 사이로 씨실을 통과시키는 방법으로 섬유형 지지체를 제조하였다²⁷⁾(Figure 4).

Figure 4. Collagen fiber processing; a) photograph of the tape loom used to fabricate flat and tubular woven collagen structures. SEM images of structures with various morphological features fabricated using wet spun collagen fibers. Image of collagen fibers woven in a b) flat and c) tubular structure fabricated using a tape loom d) Image of a flat structure created by weaving collagen fibers using a frame e) Image of a braided structure using three single collagen fibers. Copyright 2020, Wiley-VCH GmbH²⁷⁾.

또한, Luke 연구팀은 원심력을 이용하여 압출하는 방식의 습식 방사를 통해 지지체를 제조하였는데, 압출 시 젤라틴의 응고를 방지하기 위해, 5ml의 스테인리스 스틸 개방형 회전형 저장소와 0.5mm의 압출 노즐을 구축하였다. 지지체는 회전 방사(10ml/min, 원심력 15krpm)를 통해 제조하였으며, 방사된 섬유를 저장하기 위해 10kPa의 압력을 가했다. 회전형 방사기를 100%, 80%, 70%, 60%, 30%의 에탄올 수용액 응고욕에 침지하여, 섬유형 지지체를 수거하였다. 이후 이들은 순수한 에탄올에 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride(EDC)(479mg/50ml) 및 N-Hydroxysuccinimide(NHS)(115mg/50ml)를 사용하여 24시간 가교를 진행하였으며, 일부 샘플은 20%의 gelatin 용액과 소화 효소인 microbial tran sglutaminase(mTG) 50% 용액을 2:1로 혼합하여 제조되었다²⁸⁾(Figure 5).

Figure 5. Fibrous gelatin production by immersion rotary jet spinning(iRJS); a) schematic (i) and photo (ii) of iRJS fiber production. The schematic shows a precursor solution fed into an open-top rotating reservoir. The solution is extruded through small orifices in the reservoir wall into a precipitation bath where fibers are collected on a rotating cylindrical collector. b) removal of gelatin fibers from the iRJS collector following a 10-min production run; scale bar is 10 cm. c) peeling fibrous gelatin; scale bar is 1 cm. d) freeze-dried fibrous gelatin. Copyright 2019, Springer Nature²⁸⁾.

Anita 연구팀은 Poly Lactic-co-Glycolic Acid(PLGA)와 Polylactic Acid(PLA), 그리고 세포가 포함된 알지네이트를 이용하여, 근재생용 지지체를 제조하였다. Figure 5와 같이 스테인리스로 이루어진 노즐(40mm)과 단일 축을 따라 섬유 출력 유도를 위한 피스톤으로 구성하여 섬유를 제조하였다. 알지네이트를 이용한 섬유의 경우, 알지네이트 뿐 아니라 세포와 함께 CaCl₂(2%) 용액으로 압출하여 제조하였다. 근아세포를 60, 40, 20x10⁶cells/ml의 농도로 세포 완충액(300mM NaCl, 20mM Hydroxyethyl piperazine Ethane Sulfonicacid(HEPES))에 현탁액과 동일 부피의 알지네이트 용액(2.4%)와 혼합하여 0.03ml/min의 속도로 압출하였으며, 회전형 컬렉터를 통해 2cm/s의 속도로 귄취하였으며, 이 후 수집된 섬유는 세포 손상을 최소화하기 위해 즉시 10mM NaCl, 154mM HEPES의 용액으로 옮겨 보관하였다. PLA:PLGA의 경우, 클로로포름에 20wt%의 75:25의 비율로 현탁된 PLA와 PLGA를 이소프로판올 수조에서 응고시켰으며, 방사 용액 주입 및 섬유 수집 속도는 이전과 동일한 방법으로 0.03ml/min으로 사출하여 2cm/s로 수집하였다²⁹⁾(Figure 6). 그 외에도 다양한 방법의 습식 방사를 통한 근육 지지체의 연구는 지속되고 있다.

Figure 6. Wet-Spinning BioSynthetic Myoblast fibers(PLGA and Alginate); Comparison of native Muscle, PLGA and “Trojan Horse” Alginate fibers. Line schematic. Copyright 2020, Frontiers²⁹⁾.

2.1.1.3 건식 방사

건식 방사는 휘발성을 가지고 있는 용매를 사용하여 공기중에서 압출된 용액을 건조시켜 섬유를 제조하거나 이러한 압출 용액을 공기중에서 냉각시켜 응고하여 제조하는 방식이다.

Chao 연구팀은 실크 피브로인과 그래핀 산화물을 이용한 건식 방사를 통해 섬유형 지지체를 제조하였다. 이들은 탈검화된 실크 피브로인과 그래핀 옥사이드를 1,000:0.5~2의 비율로 혼합된 45wt%의 용액을 25℃, 상대습도 45%에서 0.5μl/min으로 압출하였다. 이 때 방사구와 권취기 사이의 거리는 10cm, 방사속도 3cm/s로 하여 섬유를 권취하였고, 이를 48시간동안 진공건조 한 뒤 80% 에탄올 용액에서 4배로 연신하여, 2시간 동안 침지 상태로 유지해서 지지체를 제조하였다³⁰⁾.

2.1.1.4 전기 방사

전기 방사는 현재 가장 다양한 조직 공학용 섬유형 지지체를 제조하는 방법으로써 수많은 연구가 진행되고 있는 분야이다. 전기 방사는 정전기력을 통해 용액을 컬렉터로 연속적으로 당기는 섬유 제조 방법이며, 방사용액이 주사기 펌프 또는 압력 가스를 통해 압출되며, 바늘 끝에는 용액의 방울이 맺히게 된다. 정전기력과 표면 장력의 균형에 따라 액체 방울이 대전되고 원뿔 형태로 늘어나며, 일정 이상의 전압이 가해지면 이러한 원뿔의 정점으로부터 가속되며 용매가 증발하여, 고체섬유가 수집되는 형태이다. 이러한 전기 방사는 수 마이크로 사이즈의 섬유 외에도 나노 사이즈의 섬유 또한 제조가 가능한 장점이 있어, 많은 연구가 지속되어 왔다. 전기 방사는 용액의 유변학적 특성뿐 아니라 대전성, 가교 방법, 컬렉터 사이의 거리, 압출 속도, 전압 등의 변수가 다양하다.

Yeo 연구팀의 경우 Strut라는 보조체를 이용하여 Alginate/poly-ε-183 caprolacton(PCL)을 184 이용하여 근육 지지체를 제조하였다. 이들은 Strut는 350μm의 노즐을 가진 3D 프린터를 185 이용하여 PCL, Polyvinyl Alcohol(PVA) 추출 PCL, 콜라겐 Strut을 제조하였다. 이들은 이를 186 이용하여 2%의 Alginate와 Poly(ethylene oxide)(PEO) 3%를 증류수에 혼합하고 이를 10.5kV의 187 고전압을 통해 180μm의 노즐을 통해 140mm 거리의 30mm 크기의 전극에 걸려 있는 Strut에 188 0.25ml/h의 속도로 방사하여 이를 얻었다. 해당 연구팀은 이러한 Strut에 다양한 각도로 전극을 189 배치하여 전기 섬유를 배향하였으며, 이러한 접근방법을 통해 전기장 내부에 고분자 매트릭스 190 또는 금속판 위에 섬유를 배향할 수 있다³¹⁾(Figure 7).

Figure 7. a) Schematic and optical image of the electrospinning process, b) SEM and optical images of the surface of the PCL strut. The electrospinning was performed to arrange the nanofibers in the c) horizontal, d) diagonal, and e) multi-diagonal directions. Copyright 2019, Elsevier Inc.³¹⁾.

또한, Naagarajan 연구팀은 회전형 컬렉터를 통해 섬유를 배향시켜, 배향성이 부여된 지지체를 제조하였다. 이들은 20%, 30%, 40%의 Poly Lactic-co-Glycolic Acid(PLGA)를 Tetra hydrofuran(THF):Dimethylformamide(DMF)를 3:1로 혼합한 용매를 통해 용액을 제조하여, 이를 18G 니들을 통해 2ml/h의 속도로 20kV의 전압을 걸어 방사하였다. 컬렉터와의 간격은 20cm이며 전위는 1kV/cm로 유지되었다. 컬렉터의 회전속도는 1,000rpm으로 5시간동안 방사하여, 330~ 3,000nm의 직경을 가지는 지지체가 제조되었다³²⁾(Figure 8).

Figure 8. Schematic illustrating the fabrication of polymer fibers via electrospinning. Copyright 2020, Frontiers³²⁾.

높은 회전속도 및 전압을 통해서, 배향성이 부여된 전기 방사 섬유 지지체 제조가 가능하며, 농도를 통한 굵기의 조절 또한 가능하나 농도 자체의 영향 외에도 농도에 따른 점도의 변화나 다른 변수에 의해 정비례하지는 않는 것으로 나타났다(Figure 9).

Figure 9. SEM images for the morphological analysis of aligned PLGA fibers with different polymer concentrations; a) 20% PLGA (Matrix 1), b) 30% PLGA (Matrix 2), c) 40% PLGA (Matrix 3), Scale bar 50μm. d) bar graphs of the relationship between PLGA fiber diameter and polymer concentration (n = 90 fibers; n = 3 images per scaffold) showing that an increase in PLGA concentration from 20 to 40% resulted in an increase of fiber diameter ranging from 335 ± 154 nm to 3013 ± 531 nm, e) categorical scatter plot showing mean alignment angle with the spread for PLGA fibers indicating high alignment of fibers using three different polymer concentrations. Copyright 2020, Frontiers³²⁾.

Human umbilical vein endothelial cells(HUVECs)가 포함된 PCL, PVA 바이오잉크를 전기방사한 지지체가 Yeo 연구팀에 의해 제조되었다. 이들은 2% 알지네이트와 3% PEO 수용액에 5x10⁶cells/ml의 혈관 중간배엽세포를 포함한 바이오잉크를 PCL, PVA가 leached 된 콜라겐 Strut를 제조하고, 이를 방사하여 제조하였다. 0.25ml/h의 속도로 10.5kV의 전압을 걸어 0.075kV/mm의 전기장 조건에서 방사하였으며, 위의 보조체를 30mm 간극의 전극 막대 사이에 걸어 3분간 방사하였다³³⁾(Figure 10).

Figure 10. Schematics of a) a native skeletal muscle structure with a vascular network and b) the cell electrospinning process using human umbilical vein endothelial cells (HUVECs). c) SEM and live/dead images of HUVECs-laden fibers fabricated using various electric fields. A quantitative analysis of d) orientation factor of nanofibers and e) cell viability. Copyright 2020, Elsevier Inc.³³⁾.

또한, Dirk 연구팀은 collagen-PCL 용액을 대전된 판 사이의 간극으로 전기방사하여 정렬된 섬유형 지지체를 제조하였다. 이들은 PCL:Collagen 2:1의 비율로 10과 12%의 혼합비로 90% 아세트산을 용매로 제조하였다. 각 용액은 15, 20, 25kV의 전압을 걸고 1, 2, 3ml/h의 속도로 2, 3, 4cm의 간극을 둔 판으로 Figure 11과 같이 방사를 진행하였다³⁴⁾.

Figure 11. Basic scheme of the electrospinning setup used for the experiments. Copyright 2019, Elsevier Inc.³⁴⁾.

배향성을 가진 전기 방사의 경우 대체적으로 회전형 컬렉터의 고속회전을 통해, 배향과 간극을 가지고 있는 막대형 전극 그리고 판과 보조체를 통한 수집의 방법으로 나누어진다.

2.1.1.5 접촉 방사

접촉 방사는 기존의 건식 방사와 유사할 수 있으나 그 연신 방법이 이전과는 다소 차이가 있으며, 접촉 방사의 경우 막대가 달린 판이 회전하면서 압출되는 주사기의 용액 방울과 접촉하고 회전을 반복하면서 막대에 권취하는 방법이 사용된다.

Juan 연구팀은 접촉 방사를 통해 근조직 공학용 부드러운 탄성 섬유 지지체를 제조하였다. 이들은 poly-ε-caprolacton(PCL)-diol과 Hexamethylene diisocyanate(HDI)를 무수 Dimethyl sulfoxide(DMSO)에 질소 조건에서 70℃에서 Dibutyltin dilaurate(DBTDL) 촉매를 droplet 방식으로 첨가하며 혼합한 후, 3시간 동안 반응시켜 이소시아네이트 말단을 가진 점성 prepolymer를 제조하였다. 이후 사슬연장제로 Butanediol(BD) 또는 Polyethylene glycol(PEG)를 무수 DMSO에 용해한 후 prepolymer에 첨가하고, 70℃에서 3시간 동안 질소조건에서 반응시켜 PCL-Polyurethane(PU) 공중합체를 얻었다.

반응 후 합성된 PCL-PU를 과량의 탈이온수에 침전시키고 아이소프로필알코올에서 3일 동안 반응을 정지시켰다. 이후, 맞춤형 터치 방사 장치에서 진행하였는데, PCL500-HDI-BD 1:2:1의 경우 20% w/v, PCL2000-HDI-PEG3000 1:2:1의 경우 17% w/v로 18G 니들로 플라스틱 디스펜서를 통해 1.0mm 5.0cm 거리에서 Figure 12와 같이 휠/디스크 및 브리지 컬렉터에 부착된 회전 막대를 사용하여 접촉 방사를 진행하였다. 컬렉터와 평행봉 사이의 간격은 2.5cm로 회전 속도는 최대 속도 3,000rpm으로 고정하여 0.1~0.15bar의 압력으로 압출하였다³⁵⁾. 이외에도 다양한 방사 방법 등이 시도되고 있으며, 방사법을 통해 지지체 내 배향성을 부여하는 관련 내용들을 Table 1에 간략하게 정리하였다.

Figure 12. Schematic diagram of touch spinning. Copyright 2021, American Chemical Society³⁵⁾.

Table 1. Oriented fibrous scaffolds for muscle tissue engineering manufactured through various spinning methods

2.2 3D 프린트

3D 프린트는 현시대에 와서 다양한 분야에서 사용되고 있는 제조방법이다. 이는 건축, 반도체, 가구 등의 제조업 분야부터 인체용 지지체 및 조직을 구현하는 기술까지 다양하다. 필라멘트 또는 용액을 잉크로 하여 3D 설계대로 노즐이 움직이며, 이를 인쇄하여, 구조를 재현하는 방법이다. 이 때, 인쇄 속도, 3차원 구조, 베드의 온도, 노즐의 온도, 베드의 가교 방법 등 다양한 방법을 통해 제어가 가능하며, 그 중 세포를 포함하지 않은 배향성을 부여한 지지체(필름, 시트, 전체 지지체)와 세포를 포함한 바이오 잉크를 이용한 지지체 제조 방법 등에 대하여 간략히 정리하였다.

2.2.1 세포를 포함하지 않은 고분자 3D 프린트

Matteo 연구팀은 polylactic acid(PLA)와 그래핀^@PLA(GRAFYLON3D) 1.75 mm 필라멘트를 이용하여 지지체를 제조하였다. 지지체는 순수 PLA에 분산된 그래핀으로 구성되어 있으며, 그래핀은 천연 흑연을 순수하게 물리적 처리를 통해 얻은 그래핀 나노판으로 구성하여 유기 용매 또는 산을 사용한 화학적 처리가 아닌 물, 온도 및 압력을 이용하여 흑연 두께를 감소시켰고, 나노미터 수준으로 제조된 것을 구매하여 사용하였다. 이러한 필라멘트를 fusion 360을 이용하여 설계하였으며, 100μm의 두께로 인쇄하여 1mm너비의 50x50x15mm의 속이 빈 큐브로 제조하였으며, 50μm마다 재료를 교체하였다. 최종 지지체는 입방체에서 24-well plate에 적합한 약 13.0 x 13.0 및 높이 1.0mm의 둥근 모서리의 사각형으로 제조하였다³⁷⁾(Figure 13).

Figure 13. Frontal, lateral and axonometric views of scaffold design; a) 100 μm series and b) 400 μm series. Scale bar of the fourth image of each panel is 100 μm and 400 μm, respectively. Copyright 2022, MDPI³⁷⁾.

Kim 연구팀은 밀도 1.135g/cm³, 분자량 45,000g/mol, 녹는점 60℃의 poly-ε-caprolacton(PCL)을 사용하여, 150℃에서 250μm 싱글 노즐, 5.41ⅹ10^-1Torr, 50kHz의 낮은 주파수의 30W 전기장에서 3D 프린트를 이용하여, 5-20sccm의 기체 흐름으로 1시간씩 3번 처리하여 지지체를 제조하였다. PCL을 위의 조건과 동일하게 설정하고, 110℃로 노즐 및 유압 350 kPa로 처리하여 제조하였다. 이를 통해 단순히 노즐을 통한 3차원 지지체 제조가 아닌 전기장을 통해 조절이 가능한 3D 프린팅 방법을 사용하였으며, 고분자의 압출 속도와 노즐의 움직임의 제어가 필수적이다³⁸⁾.

2.2.2 세포를 포함하는 3D 프린트

Figure 14와 같이, Kim 연구팀은 30G 노즐을 이용한 3축 인쇄 시스템을 이용하여 지지체를 제조하였다. 37℃로 인쇄 작동부를 설정하고, 인쇄 카트리지를 25℃로 설정, 10mm/s의 속도로 0.8μl/s의 바이오 잉크를 glycine(Gly)/KCl 완충액으로 인쇄하여 지지체를 제조하였다. 압출되는 바이오 잉크의 경우 10X Enriched Dulbecco's Modified Essential Medium (DMEM)을 1:1로 5% 콜라겐 용액과 희석하여 사용했으며, 세포는 1x10⁷cell/ml의 세포를 첨가하여 인쇄하였다³⁹⁾.

Figure 14. a) schematic images of 3D cell printing process using the Gly/KCl buffer solution [(1) randomly dispersed collagen molecules in the bioink before printing, (2) alignment and assembly into collagen fibrils of collagen molecules during 3D cell-printing process, (3) formation of aligned collagen fibers in the Gly/KCl buffer solution. Copyright 2019, Elsevier Inc.³⁹⁾.

이에 더하여 이들은 Gelatin methacryloyl(GelMA)와 meth acrylated collagen(ColMA)를 제조한 후, 각 용액을 세포와 함께 교반하여 자외선조사 가교형 바이오잉크를 제조하였다. GelMA 3wt% 또는 ColMA 3wt%와 C2C12 myoblasts과 hMPC(muscle precursor cells) 1x10⁷cell/ml, 2-hydroxy-4’-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone(photoinitiator) 3mg/ml의 농도로 바이오 잉크를 제조하였는데, ColMA의 경우 6wt%의 수용액으로 제조 후, 이를 10x DMEM과 1:1로 희석하여 2x10⁷개의 세포와 혼합하였다. 각 세포가 포함된 용액은 CO₂ 인큐베이터에서 3, 5, 7일간 배양한 후 지지체를 제조하였다.

이후 Figure 15와 같이 DTR3-2210을 사용하여 10℃ 플레이트에서 30G 노즐을 이용하여 10mm/s의 노즐 이동 속도로 120kPa 및 10℃ 배럴 온도에서 300mW/cm² UV의 조건하에 지지체를 제조하였다. ColMA의 경우 33℃ 플레이트에서 10mm/s의 이동속도로 45kPa 및 배럴 온도 10℃로 제조하였으며, 각 지지체는 37℃의 PBS로 세척하여 미반응물을 제거하였다⁴⁰⁾.

3D 프린트를 이용한 배향성 부여의 경우, 방사법과는 달리 어느 정도 정형화된 형태를 가지고 있는 반면, 미세패턴의 크기가 비교적 큰 것을 알 수 있다. 세포를 포함하지 않은 지지체의 경우, 이후 세포 배양을 따로 해주어야 된다는 문제점을 가지지만, 세포를 포함한 지지체의 경우 세포의 사멸 이후 노폐물이나 세포의 성장으로 인한 이동이 비교적 어려움을 알 수 있다. 3D 프린트를 통해 제조한 배향성이 부여된 지지체에 대해 간단히 Table 2를 통해 정리하였다.

Table 2. Classification according to cell types combined with scaffolds fabricated by 3D printing

3. 결론 및 전망

인류의 발전과 개발이 불러온 자원의 소모 및 환경문제 등으로 인하여 대체식품, 그 가운데 배양육의 개발과 이를 통한 경제적이고 효율적인 육류 시장의 대체는 상당한 도전 과제가 되었다. 관련 연구는 여전히 초기 단계에 머물러 있으며, 기반 연구는 아직 부족한 실정으로, 지속적으로 수행되고 있다.

배양육 제조를 위해 사용되는 소재의 경우, ‘식용가능(edible)’ 이라는 명확한 한계로 인하여, 배양육 연구의 필요성이 대두된 시점과 비교하여 소재 관련한 연구는 뚜렷하게 발전적이지 못한 실정이다. 이러한 현 시점에서 중요한 과제는 이미 상용화된 다짐육(minced) 형태의 배양육이 아닌, 등심, 안심 등과 같은 specific 조직 유사(tissue-like) 배양육의 개발이다. 조직 유사 배양육의 경우, 배향성 없이 근조직으로의 구현이 불가능한 상태로써, 이를 위해서는 지지체의 섬유화와 세포의 배양과정에서의 외부자극이 필요함을 위에서 언급된 다양한 연구 결과에서 도출할 수 있다. 지지체의 섬유화는 미시적 관점과 거시적 관점의 배향성 부여와 서로 다른 지지체의 혼합 등으로 가능할 것이라 사료된다.

하지만 현재 개발된 근육 지지체의 배양육 적용에는 일부 문제점이 존재하는데, 재료, 제조과정, 세포 배양 과정 등에서 나타나고 있다. 우선, 재료의 측면에서 보자면, 대부분의 재료들이 동물성 식품 재료 또는 식용이 불가능한 재료라는 것이다. 콜라겐과 젤라틴의 경우 근세포와의 적합성 때문에 흔히 사용되고 있으며, 또한 근세포와 근육의 물성을 충족시키기 위해, 즉 근세포의 생장과 분화를 촉진시키기 위해서 전도성을 부여하는 방법이 사용되고 있다. 그렇기에 배양육의 완전한 개발을 위해서는 이를 대체할 수 있는 재료와 가교 방법의 탐색이 중요한 부분이다. 다음으로 제조 과정 측면에서 보자면, 일부 제조 과정이 식용에 부적합한 유기 용매를 사용하거나, 식용 가능한 재료의 특성에 적합하지 않은 방법을 사용하므로, 이 부분에 대해서는 우선 재료를 탐색한 이후, 재료에 맞추어 상기의 서술한 다양한 방법에 적용하는 순서로 적용해야 될 것이다.

마지막으로 세포 배양 과정에서 역시 FBS, horse serum, FGF 등의 동물성 배지의 사용으로부터 벗어나는 것 또한 배양육의 개발에 중요한 부분일 것이다. 이러한 부분은 외부의 물리적, 전기적, 화학적 자극과 비동물성 첨가물을 통한 돌파구를 탐색해야 될 것이다.

우리는 본 리뷰에서 제시한 연구들을 통하여, 섬유형 지지체에 근세포를 배양하였을 경우 세포의 성장방향이 섬유 배향방향을 따르는 것을 확인할 수 있었다. 지지체 내 배향성이 부여된 구조를 구현하는 방법은 기존의 물리적, 전기적, 생물학적 자극을 부여하는, 까다롭고 복잡한 방식과 차별되는 효율적인 방법으로, 마이크론 크기의 미세한 섬유형 구조를 구현함으로써 근육조직 뿐만 아니라 미세 섬유다발로 이루어진 신경조직의 재생에 활용될 수 있는 기술이다.

이러한 제조 방법 또는 그 외의 다양한 지지체 제조 방법을 통해 조직과 유사한 형태의 식용 지지체를 제조할 수 있다면, 배양육 개발 및 상용화에 더욱 박차를 가할 수 있을 것이다. 이후의 문제점으로 대두되고 있는 생검을 통해 얻거나 중간배엽 세포의 분화를 통한 근세포, 지방세포, 혈관 세포의 안정적인 확보, 식용 가능하며, 생분해성 및 생체 적합성이 우수하며, 물리적 특성이 육류와 유사한 재료의 선택, 효율적이고, 경제적이며, 비도축성, 즉 무혈청 배지의 확보 등이 있으며, 이들이 모두 종합된 이후에는 배양육 배양기 및 용기의 제작과 상품화 등 다양한 문제점이 남아 있으며, 이 모든 것이 해결된 이후에는 그 누구도 하물며, 동물마저도 희생되지 않는 영양소 공급을 위한 배양육의 개발이 완료되고, 우리는 가정에서 이러한 배양육을 섭취하며 살아갈 수 있을 것이다.