Anticancer Effects of the Extracts of Adonis multiflora

세복수초(Adonis multiflora) 추출물의 항암 활성

Abstract

This study aims to evaluate the antitumor effect of Adonis multiflora, one of the plants in the Ranunculaceae, on mice to which hepatoma cells were transplanted and to suggest its possibility as a candidate natural substance to replace antitumor drugs. We performed the MTT assay to assess the extract had a decrease in the growth rate of hepatoma cells depending on concentration. In particular, 100 ㎍/㎖ of the extract showed 40% of growth retardation rate. We assessed the autophagy activity to identify the inhibitory autophagy mechanism of tumor cells in the extract. This proved that the activity increases more as the concentration of the extract is higher. We conducted the Western blot test to confirmed the expression of two proteins LC3 and p62. The expression of p62 was in inverse proportion to the concentration of the extract whereas LC3-Ⅱ increased more as the concentration of the extract was higher. This showed that an increase in the autophagy relies on the conentration of the extract. We performed a test to discover the influence of the extracts on hepatoma cells transplanted to mice. The test proved that the extract triggers a significant decrease in the growth rate of tumor cells. Compared to the start of the test, the size of tumor cells with 50, 100 and 200 ㎎/㎏ of the extract respectively increased by 4, 3.7 and 3.5 times whereas in the controlling group by 6.3 times. The size of tumor cells in benign tumor controlling group increased by 3.1 times. This showed a significant decrease in the growth rate of tumor cells compared to the controlling group. We carried out the experiment of influence of the extract on the expression of two proteins LC3 and p62 in the tumor tissue transplanted into mice. The experiment showed that LC3-II increases more as the concentration of the extract is higher. However, there was a rapid decrease in p62 with 200 ㎎/㎏ of the extract compared to the controlling group. In this study, we proved that the autophagy activity of Adonis multiflora extract inhibits the growth of hepatoma cells by in vitro and in vivo experiments. In conclusion, the inhibitory autophagy mechanism of tumor cells in the extract can be used as a new treatment of antitumor.

본 연구에서는 세복수초 추출물에 대한 항암활성을 평가하고자 간암세포주인 SK-Hep1 세포주에서 MTT를 통한 세포독성을 평가하고 자가포식(autophagy) 형성정도를 확인하였다. 또한, 종양형성능 측정(Xenograft assay)를 통하여 세복수초 추출물에 대한 항암활성평가를 수행하였다. 그 결과 in vivo및 in vitro에서 모두 항암활성이 뛰어나게 나타났으며, 세복수초 추출물의 항암작용은 자가포식(autophagy)을 증가시키는 것으로 나타났다. 세복수초 추출물은 in vitro및 in vivo에서 모두 LC3의 발현을 농도의존적으로 증가시켜며 p62의 발현을 억제시키는 것으로 확인되었으며, 따라서 세복수초 추출물은 자가포식(autophagy) 활성을 증가시켜 암세포의 세포사멸을 유도하는 것으로 판단되어 간암치료제 개발 및 간암치료제와의 병용요법 등 새로운 작용기전의 항암신약개발 소재로서의 가능성이 있음을 제시한다.

서 언

정상적인 세포는 세포수의 항상성을 유지하지만 암세포는 세포주기 조절의 교란에 의해 비정상적인 세포주기 반복을 통한 증식이 계속되어 세포가 끊임없이 증식된다(Weinberg, 1994; Schulze-Osthoff et al., 1998).

자가포식(autophagy)은 리소좀을 통하여 불필요하거나 기능을 제대로 하지 못하는 세포 내 구성물질을 분해하여 에너지를 만들어 재사용하는 기전을 가지는 주요한 이화작용의 하나이다(Cuervo, 2004; Eisenberg-Lerner et al., 2009).

자가포식(autophagy)에 의해 유도된 세포사를 자가탐식(autophagic cell death, progrmmed cell death type II)이라 하며, 자가포식(autophagy) 이용한 암 치료법에 대한 연구가 진행되고 있으나, 자가포식(autophagy)의 암에서의 작용은 매우 복잡하며, 암의 종류, 단계, 유전적 차이에 따라 다르게 나타나는 것으로 보인다(Chen and Karantza, 2011; Kimmelman, 2011).

LC3(또는 Atg8)은 유비퀴틴(ubiquitin)형 단백질이며, 신생단백질 LC3는 단백질 분해효소 Atg4에 의해 C-말단 인접부위가 절단되어 LC3-Ⅰ이 되고 이로 인해 C-말단 글리신 잔기가 노출된다. LC3-Ⅰ은 포스파티딜에탄올아민(phosphatidylethan-olamine, PE)에 의해 LC3-Ⅱ로 전환된다. 이러한 과정은 자가포식소체(autophagosome) 형성에 필수적이다(Kabeya et al., 2000). p62 (sequestosome 1) 단백질은 유비퀴틴 결합부위(ubiquitin-associated domain, UBA)를 통해 유비퀴틴화(ubiquitination)된 단백질과 결합할 수 있다. 이 후 자가 올리고 머화(oligomerization)를 통해 결합된 단백질을 기능적으로 격리시키고 이 유비퀴틴화 단백질-p62 올리고머 복합체는 자가포식소체(autophagosome)에 결합되어 있는 LC3-Ⅱ와 결합하여 p62를 포함하는 자가포식소체(autophagosome) 내의 리소좀에서 단백질과 세포소기관이 분해된다(Bjorkoy et al., 2005).

암을 치료하는 방법으로 수술요법, 방사선 요법, 화학요법등 여러 가지 방법이 시행되고 있는데, 화학요법은 암의 종류에 상관없이 시행할 수 있기 때문에 매우 유용한 암 치료 방법으로 사용되고 있으나(Matsuyama et al., 2006; Lee et al., 2015), 화학요법제에 대한 내성이 있는 암세포의 출현과 독성으로 인한 부작용은 화학요법 시행을 제한하는 요인이 된다(Lønning, 2010; Sancho-Martinez et al., 2012).

최근 자연식품 중에서 기능성 물질을 섭취하려는 요구가 증가하면서 암, 당뇨, 노화 등 성인병에 치료 및 예방에 효과가 있는 천연물질들이 주목을 받고 있다(Lee et al., 2008; Ham et al., 2009; Jun et al., 2014).

복수초속(Adonis L.)식물은 미나리아재비과(Ranunculaceae)에 속하는 식물로서 대부분 다년초로서 북반부 온대지역인 아시아, 유럽 및 북아메리카를 중심으로 약 26~30여종이 생육하고 있으나 일부 일년초의 종은 서남아시아에서부터 아프리카 북부와 지중해 연안에 분포하는 것으로 알려져 있다(Cronquist, 1981; Meusel et al., 1965; Iman et al., 1977; Ohwi, 1984; Tamura, 1991; Park, 2007; Mabberley, 1990; Im, 1996; Hoffman, 1998; Robinson, 2001; Lee, 2006). 한국산 복수초속식물은 복수초(A. amurensis Regel et Radde), 세복수초(A, multiflora Nishikawa et Ito), 개복수초(A. pseudoamurensis W. T. Wang)로 총 3종이 알려져 있다(Lee et al., 2003). 본 연구에서는 우리나라에 자생하고 있는 세복수초의 성분과 작용에 관한 연구보고가 거의 없음에 착안하여 간암세포 이식한 마우스에서 항암효과를 평가하여 기존의 항암제를 대체하거나 병용요법 등의 항암보조제로서의 천연후보물질로의 가능성을 제시하고자 하였다.

 

재료 및 방법

실험 재료

본 연구에 사용된 세복수초 추출물은 제주생물종다양성연구소(Jeju Biodiversity Research Institute, Korea)로부터 분양받아 사용하였다. 세복수초는 2013년 3월초에서 4월중순까지 제주특별자치도 서귀포시 한라산 해발 300~500 m에서 채취하였으며, 증류수로 세척 후 음건세절하여 70% EtOH로 추출 후 여과 및 감압농축(수율 8.2%)하여 시험시까지 −80℃ (Voucher No. JBR209)에 보관하였다.

암세포 배양

인체 유래 간암 세포주인 SK-Hep-1 세포는 한국 세포주 은행(KCLB)에서 구입하였다. Dulbeco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM, Gibco, USA) 배지에 10% fatal bovine serum (FBS, Gibco, USA), 1% penicillin/streptomycin (P/S, Invitrogen, USA)을 첨가하여 배양배지로 사용하였고, 배양조건은 37℃에서 95% 이상 습도가 유지되고 5% CO2 가습 공기 조건 하에서 배양하였으며, 4일마다 계대배양 하였다.

MTT assay

간암세포주인 SK-Hep-1 세포에 대한 세복수초 추출물의 항암 활성을 측정하기 위해 Martin et al. (1993)의 방법에 따라 MTT (3-(4, 5- dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) assay를 실시하였다. 배양된 암세포를 96 well plate에 2 × 10⁴cells/㎖ 농도로 분주하여 24시간 배양한 후 시료를 농도별로 첨가하고 37℃, 5% CO2 조건의 incubator에 24시간 배양하였다. 5 ㎎/㎖ MTT 용액을 첨가하고 4시간 동안 배양한 후 생성된 formazan 결정을 DMSO (dimethylsulfoxide)에 녹여 540 ㎜에서 흡광도를 측정하였다. 대조군의 세포수를 100%로 하여 상대적인 세포 증식 억제율을 구하였다.

Autophagy activity assay

세복수초 추출물의 간암세포 성장 억제 작용기전을 규명하기 위하여 SK-Hep-1 세포를 96 well plate에 1 × 104cells/well로 분주하고 24시간 후 세복수초 추출물을 농도별(25, 50 및 100 ㎍/㎖)로 처리하고 24시간 배양하였다. 그 후 PBS로 wash 후 4% paraformaldehyde (PFA, Noble Bio, Korea)으로 고정하였다. PBS로 wash 한 후 50 μM dansylcadaverine (MDC, Sigma, USA)를 100 ㎕ 처리하였으며, 1 시간 동안 배양한 후 PBS로 wash하고, 1μM EtBR을 50 ㎕ 처리하여 실온에서 10분간 방치하였다. PBS로 wash하고, DMSO를 50 ㎕ 넣어 cell을 lysis 시킨 후 fluorometer (Tecan, Switzerland, MDC excitation 380 ㎚; emission 525 ㎚, EtBr excitation 530 ㎚; emission 590 ㎚)로 측정하였다. 결과 분석은 MDC 값 / EtBr 값으로 계산하여 측정하였다.

실험동물

실험동물은 4주령 BALB/c nude mice를 중앙실험동물(서울)에서 구입하여 사용하였다. 동물사육실의 환경은 항온(20 ± 2℃), 항습(50 ± 4%). 12시간 간격의 광주기로 일정한 조건을 유지하고 동물들은 polycarbonate cage에 본 연구에 5마씩 분리하여 사육하였다. 생쥐는 1주일간 동물사육실 환경에 적응시킨 후 사용하였다.

Xenograft

사람 간암 세포주인 Sk-Hep-1 세포를 1 × 107 cells/mice의 농도로 PBS에 혼탁하여 nude mice를 마취한 후 옆구리 피하부위에 0.1 ㎖씩 주입하였다. 이식 2 주일 후, 세복수초 추출물을 50, 100 및 200 ㎎/㎏의 용량으로 경구 투여하였으며, 양성대조군으로 cisplatin을 2 ㎎/㎏으로 주 2회 복강투여하였다. 관찰기간 동안 주 2회caliper를 사용하여 종양의 장축(length)과 단축(width)을 측정하였으며, 다음의 계산식에 대입하여 종양의 부피를 계산하였다.

Tumor volume (mm3) = width2 × length / 2

시험 종료 후 종양 및 간, 신장, 비장을 적출하여 중량을 측정하였으며, 종양에서의 LC3 및 p62의 단백질 발현을 확인하였다.

Western blot analysis

배양된 SK-Hep-1 세포에 세복수초 추출물을 처리하고 일정시간 후에 세포를 harvest하여 상층액을 얻었으며, 적출한 종양조직을 완충액(RIPA buffer, Sigma-aldrich Co.)을 첨가하여 균질화 시키고 14,000 × g로 3분 동안 원심분리 시킨 후 상층액을 얻다. 얻은 상층액의 단백질을 BCA protein assay kit (BIO-RAD)를 이용하여 정량하였다. 동량의 단백질(40 ㎍)을 Laemmli sample buffer (BIO-RAD) 와 2-mercaptoethanol (BIO-RAD)을 19:1로 혼합된 sample buffer로 1:1 섞은 다음 99℃에서 가열하였다. 가열된 단백질을 SDS-polyacrylamide gel에 전기영동을 하였으며, nitrocellulose membrane으로 옮겼다. Membrane은 1시간 동안 상온에서 5% skim milk로 block 처리한 후, LC3, p62 및 β-actin을 blocking buffer에 각각 1:1000, 1:10000, 1:5000으로 희석하여 4℃에서 24시간 반응시켰으며, 0.01% Tween-20을 함유한 TBS로 5분씩 5번 세척하였다. Blocking buffer에 HRP-conjugated secondary Ab를 1:5000으로 희석하여 1시간 동안 상온에서 처리하였으며, detection reagent (ECL)를 가한 후 Gel Logic 2200 PRO Imaging System (Carestream Health, Rochester, NY)을 사용하여 확인하였다.

통계분석

본 연구의 실험 결과들은 평균±표준편차로 나타내었고, 유의수준은 *p < 0.05와, **p < 0.01로 Student t’-test를 실시한 결과를 표시하였다.

 

결과 및 고찰

간암 세포주에 대한 세복수초 추출물의 항암활성

세복수초 추출물로부터 간암 세포주인 SK-Hep-1에 대한 항암활성을 알아보고자 MTT assay를 실시하였다. 세복수초 추출물에 의해 농도의존적으로 세포 성장률이 감소하였으며(Fig. 1a), 세복수초 100 ㎍/㎖의 농도에서는 40% 세포 성장 억제율을 보였다.

Fig. 1.Effects of A. multiflora extract on cell viability and autophagy activity in SK-Hep-1 cells. (a) Analysis of cell viability using the MTT assay following 24 h treatment with various concentrations of A. multiflora extract. (b) Quantification of MDC incorporation in Sk-Hep-1 cell. These results are mean ± S.E.M of triplicates from a representative experiment.

간암 세포주에 대한 세복수초 추출물의 autophagy activity 측정

세복수초 추출물의 암세포 성장 억제 작용기전을 확인하기 위해 자가포식(autophagy) 활성을 측정한 결과, 세복수초 추출물의 농도가 높아질수록 자가포식(autophagy) 활성이 증가하였다(Fig. 1b).

세복수초 추출물에 의한 autophagy 관련 단백질의 발현확인

세복수초 추출물에 의한 자가포식(autophagy) 관련 단백질의 발현을 조사하기 위해 western blot을 수행하여 LC3 및 p62 단백질의 발현을 확인하였다. 이중 LC3는 자가포식소체(autophagosome) 형성에 관련된 지표로 자가포식(autophagy)이 시작되면 LC3-Ⅰ에서 LC3-Ⅱ로 전환되어 자가포식(autophagy)가 진행시 형성되는 자가포식소체(autophagosome)에 LC3-Ⅱ가 존재하는 것으로 알려져 있다(Shin, 2010). 간암 세포주인 SK-Hep-1에서 LC3-Ⅱ 단백질의 발현은 세복수초 추출물의 농도가 높아질수록 LC3-Ⅱ의 발현이 증가하였다(Fig. 2).

Fig. 2.Effects of A. multiflora extract on the expressions of autophagic indicators LC3, p62 in SK-Hep-1 cells. Cells were incubated with A. multiflora extract (0.25, 0.5, and 100 ㎍/㎖) for 24 h and cell lysates were prepared and subjected to western blot analysis with respective antibodies. These experiments were performed in triplicate, and similar results were obtained.

p62 단백질은 ubiquitine-associated domain (UBA)이라는 부위를 통해 다른 단백질과 결합을 할 수 있어 자가 올리고머화(oligomerization)를 통해 결합된 단백질을 기능적으로 격리시킨다. 이렇게 유비퀴틴화(ubiquitination)된 단백질 p62 올리고머 복합체는 LC3-Ⅱ와 결합하여 자가포식소체(autophagosome)을형성하여, 자가포식소체(autophagosome)내의 단백질과 세포소기관을 분해한다(Bjorkoy et al., 2005). 세복수초 추출물에 의한 p62 단백질의 발현을 확인한 결과, 세복수초의 농도가 높아질수록 p62 단백질의 발현이 감소하였다(Fig. 2).

세복수초 추출물 처리 시 LC3-Ⅱ의 발현이 증가하였으며, 반대로 p62 단백질의 발현은 세복수초 추출물의 농도가 높아짐에 따라 감소하여 세복수초 추출물에 의해서 자가포식반응이 증가함을 확인할 수 있었다. 이전에 많은 연구 결과에서 높은 자가포식활성은 세포의 사멸을 이끄는 것을 확인하였다(Kang and Avery, 2008; Maiuri et al., 2007; Mizushima et al., 2008). 암세포가 세포자살(apoptosis)에 내성이 생기는 경우 치료에 심각한 문제를 야기할 수 있는데, 이러한 경우 자가탐식(autophagic cell death)을 이용한 항암치료가 효과가 있다는 보고가 있다(Corcella et al., 2009).

세복수초 추출물이 마우스에 이식된 간암 조직의 성장에 미치는 영향

세복수초 추출물이 마우스에 이식된 간암 조직의 성장에 미치는 실험 결과는 Fig. 3과 같다. 마우스의 체중은 세복수초 추출물 투여군 모두에서 control 보다 체중이 증가하였다. 반면에 cisplatin 투여군은 control 보다 체중이 감소하였다(Fig. 3a).

Fig. 3.A. multiflora extract suppresses SK-Hep-1 xenograft growth in vivo. (a), body weight of tumor-bearing mice measured 3 weeks after tumor xenografts. (b), tumor growth after treatment with AAM. (c), xenograft tumor growth after 21 d of treatment with vehicle, 50, 100 and 200 ㎎/㎏ body weight AAM per day.

실험 시작 시점에 비교하여 종양크기는 대조군이 6.3배, 세복수초 추출물 50, 100 및 200 ㎎/㎏이 각각 4배, 3.7배 3.5배로 대조군에 비해 종양의 크기가 유의하게 감소하였다. 양성대조군은 3.1배로 대조군에 비해 종양의 크기가 유의하게 감소하였다(Fig. 3b).

종양 중량의 변화는 모든 실험 동물에서 실험 종료일에 종양을 적출하여, 주변 결합조직을 제거한 다음 적출한 종양의 중량을 측정한 결과, 세복수초 추출물 투여군에서 종양의 중량이 농도의존적으로 감소하였고(Fig. 4c), 세복수초 추출물 200 ㎎/㎏에서는 양성대조군인 cisplatin과 비슷한 수치를 나타내었다.

Fig. 4.Effects of A. multiflora extract on the expressions of autophagic indicators LC3, p62 in xenograft mice model.

시험 종료일에 마우스를 희생하여 적출한 간, 신장 및 비장의 중량을 측정하였다. 간의 중량은 세복수초 추출물은 대조군과 비슷한 중량을 나타냈었지만 유의성은 없었다. 반면 양성대조군인 cisplatin은 대조군에 비해 간의 중량이 증가하였다. 신장의 중량은 세복수초 추출물 투여군에서 대조군보다 중량이 감소하였지만 유의성은 없었다. 비장의 중량은 세복수초 추출물의 농도가 높아질수록 비장의 중량이 대조군에 비해 증가하였지만 유의성은 없었다. 반면 양성대조군인 cisplatin은 대조군에 비해 비장의 중량이 감소하였다(Table 1).

Table 1.Changes of liver, kidney and spleen weight by A. multiflora extract in xenograft mice model

세복수초 추출물이 마우스에 이식된 간암 조직의 LC3 및 p62 단백질 발현에 미치는 영향

세복수초 추출물이 마우스에 이식된 간암 조직의 LC3 및 p62 단백질 발현에 미치는 실험 결과는 Fig. 3과 같다. 종양 조직에서 LC3 단백질의 발현은 세복수초 추출물의 농도가 높아질수록 LC3-Ⅱ의 발현이 증가하였다. p62 단백질은 세복수초 추출물 200 ㎎/㎏에서 control에 비해 급격히 발현이 감소하였다. 따라서 세복수초 추출물은 자가포식(autophagy) 작용을 통해 간암세포의 성장을 억제하는 것으로 판단되며, 기존 항암제에 대한 병용요법 등 새로운 항암치료 요법에 사용할 수 있는 기초자료를 제공할 수 있을 것으로 생각된다. 본 연구의 결과를 토대로 세복수초 추출물이 기존 항암제에 대한 상승효과 및 기존 항암제의 용량조절을 통한 부작용 억제에 대한 연구를 수행하고자 한다.