Effects of Cultured Acer tegmentosum Cell Extract Against Hepatic Injury Induced by D-galactosamine In SD-Rats

산겨릅나무 세포배양 추출물이 D-galactosamine 유도 급성 간손상에 미치는 보호 효과

Abstract

Here we report the protective activity of cultured Acer tegmentosum cell extract against liver damage in rat intentionally instigated by D-galactosamine. Local fat degeneration and infiltration of inflammatory cells were significantly decreased in cultured A. tegmentosum cell extract administered rat. In addition, acutely increased AST, ALT, LDH, ALP activities and lipid peroxidation and lipid content by liver damage were recovered in experimental rat administrated with A. tegmentosum extract. These results showed that cultured A. tegmentosum cell extract has a role in blood enzyme activation and lipid content restoration within damaged rat liver tissues. Moreover expression rate of TNF-α which accelerates inflammation and induces tissue damage and necrosis was significantly decreased. Also activities of antioxidant enzymes were more effectively upregulated comparing to those of the control group induced hepatotoxicity. All data that cultured A. tegmentosum cell extract has a preventive role against liver damages such as inflammation, tissue necrosis in rats by improving activities of blood enzymes, antioxidant enzymes and modulating expression of inflammation factor, suggest that cultured Acer tegmentosum cell extract is an effective medicinal resource for restoration of hepatotoxicity.

본 연구는 산겨릅나무 세포배양 추출물이 D-galactosamine에 의해 유발된 간독성에 따른 보호 효과를 살펴보았다. 간 조직 내 국소적 지방 변성과 염증세포 침윤은 산겨릅나무 세포배양 추출물을 처리한 실험군에서 크게 감소되는 경향을 보였다. 또한 산겨릅나무 세포배양 추출물을 처리한 실험군은 간 손상에 의해 급격히 증가된 AST와 ALT, LDH 및 ALP의 활성과 조직 내 지질함량과 과산화지질함량이 감소되는 것으로 나타나 산겨릅나무 세포배양 추출물이 D-galactosamine으로 인한 혈중 효소활성과 조직 내 지질함량을 개선하는 것으로 조사되었다. 이와 더불어 산겨릅나무 세포배양 추출물을 처리한 실험군은 염증반응을 촉진시켜 조직 상해 및 괴사를 유도하는 TNF-α의 발현 수준이 간독성을 유발한 실험군에 비해 낮은 것으로 확인되었고 항산화효소의 활성을 효과적으로 조절하였다. 이러한 결과로 미루어 보아 산겨릅나무 세포배양 추출물은 D-galactosamine에 의한 조직 괴사를 감소시키고 혈중 효소의 활성과 조직 내 지질함량을 개선할 뿐만 아니라 염증 반응 인자의 발현과 항산화효소 활성을 조절하고 있어 간독성에 대한 보호효과가 매우 높은 것으로 사료된다.

서 언

현대인은 급격한 과학기술의 발달로 인한 화학독성물질의 증가, 신약, 바이오 치료제, 세포 치료제 등 새로운 독성물질에 대한 노출이 증대되고 있다. 이에 따라 최근 간질환, 고혈압, 비만증, 당뇨, 고지혈증, 심장질환, 암 등과 같은 각종 성인병 및 난치병의 발병률이 증가되어 사회적 문제로 대두되고 있다. 이 중 간질환은 다양한 요인에 의하여 빈번히 일어나는 질환으로 특히 과도한 스트레스, 음주, 흡연 및 약물에 의하여 발생된다. 간질환의 원인은 다양하지만 이들로 인해 반복되는 염증 반응은 간염을 유발하여 간섬유화와 간경변 및 간암으로 유도하기 때문에 생명체에 회복하기 힘든 치명적인 영향을 미치는 것으로 알려져 있다(Lee and Friedman, 2011). 이러한 간질환을 예방 및 치료하기 위하여 국내외적으로 사용되고 있는 간질환 치료제로는 합성 약물인 인터페론과 malotilate가 있으나 이들은 간독성 물질에 대한 보호작용만으로 그의 유효성을 인정 받고있는 수준이며, 부작용 또한 빈번히 나타난다. 이에 따라 부작용이 적으면서 간질환과 관련된 예방 효과가 있는 기능이 규명된 천연물 유래의 기능성 식품 소재를 발굴하고자 하는 노력이 지속적으로 이루어지고 있다(Lim et al., 1999; Murakmi et al., 1998).

본 연구의 산겨릅나무(Acer tegmentosum)는 단풍나무과(Aceraceae)에 속하는 낙엽소교목으로 이에 대한 생리활성 연구로는 Hong et al. (2007)이 산겨릅나무의 분획 별 추출물 중 ethyl acetate와 butanol 분획에서 강한 항산화성과 높은 항지질과산화 활성을 나타냄을 밝혀냈으며, Shin et al. (2006)은 위암, 간암, 폐암 및 유방암 세포 등에서 암세포 생육억제효과를 보고한 바 있다. 산겨릅나무의 성분으로 알려진 salidroside는 amyloid-β에 의한 산화적 스트레스에 대한 신경세포 보호작용(Jang et al., 2003), 지질과산화 억제(Zhang and Liu, 2005), 골수세포 cycle (Zhang et al., 2005) 및 탄수화물 대사에 미치는 영향(Wang et al., 2004)에 대한 연구가 진행되어 왔으며, Kim et al. (2008)은 산겨릅나무의 salidroside가 사염화탄소에 의한 간 손상에 미치는 보호 효과를 알아보기 위하여 조직학적 변화와 혈청 성분을 분석한 바 있다.

산겨릅나무에 포함된 salidroside는 다양한 생리적 활성을 띠고 있기 때문에 대량 생산을 통한 salidroside의 회수는 경제적인 측면에서 매우 중요한 의미를 갖게 한다. 따라서 본 연구에서는 세포 배양을 통해 salidroside의 대량 생산 가능성을 확인하고자 하였으며, 이러한 세포배양 추출물이 전임상적 효능을 갖게 되는지를 확인하고자 산겨릅나무 세포배양 추출물이 간독성이 유발된 흰쥐에 미치는 효과를 알아보고자 하였다.

 

재료 및 방법

실험동물 및 시약

본 실험에서 4주령 수컷 흰쥐(Sprague-Dawley)는 (주)샘타코에서 구입하였으며 사육실에서 일정한 조건(온도 21.4℃ ± 0.05℃, 습도 61%, 명암은 12시간 주기)에서 사육하였다. 식이는 물과 사료(AIN-93G purified rodent diet)를 충분히 섭취하게 하면서 1주일 동안 순치한 뒤 체중이 150 ± 10 g인 흰쥐를 선별하여 실험에 사용하였다. 모든 동물실험 과정은 안동대학교 동물실험윤리위원회의 승인을 취한 후 실시하였다(2014-3-1111-07-01). 본 연구에 사용된 시약은 Sigma-Aldrich (St. Louis, USA)로부터 구입하였으며 기타의 시약은 별도로 표기하였다.

세포 배양

산겨릅나무(Acer tegmentosum)의 잎과 줄기를 약 5 ㎝로 절단한 후 1% sodium hypochlorite solution과 에탄올을 이용하여 소독하였다. 소독된 식물체는 1 ㎝ × 1 ㎝로 크기로 자른 후 30 g/l sucrose, 8 g/l agar, 10 μM α-naphthaleneacetic acid (NAA), and 0.2 μM 6-benzylami-nopurine (BA)가 포함된 고형의 LS medium (Linsmaier and Skoog, 1965)에 가한 다음 24℃의 암조건에서 8주간 처리하여 캘러스를 유도하였으며 유도된 캘러스는 4주 간격으로 새로운 배지로 교체해주었다. 이 후 세포 현탁액 배양을 위하여 캘러스 조직을 30 g/l sucrose, 10 μM NAA, 0.2 μM BA 및 1 g/l 2-morpholinoethanesulfonic acid (MES)가 포함된 Gamborg B5 medium (Gamborg et al., 1968) 50 ㎖에 처리한 후 24℃의 암조건에서 110 rpm으로 환류시키면서 배양하였으며 2주 간격으로 배지를 교체하였다.

배양된 산겨릅나무 세포배양 추출물에서 salidroside의 추출, 정량분석 및 동정

배양된 세포는 진공 여과를 통해 회수하였으며 24시간동안 60℃의 오븐에서 건조하였다. 건조된 세포덩어리는 70% 에탄올로 5시간씩 3회 추출한 후 회전농축기와 동결건조기로 농축 건조하였다. 세포 추출물에 포함된 salidroside의 함량은 HPLC 분석법에 따라 10 ㎎의 세포 추출물을 0.45 ㎛ membrane filter로 여과한 메탄올 1 ㎖에 용해시킨 다음 여과하여 Shiseido Capcell Pak C18 (4.6 ㎜ × 250 ㎜, 5 ㎛) 컬럼이 장착된 HPLC system에 시료 10 ㎕를 주입하였다. 컬럼 온도는 35℃, UV detector (Agilent Technologies, USA)의 검출 파장은 214 ㎚로 설정하였고, 0.05% TFA이 포함된 water-MeOH (19:1, v/v)에서 1.0 ㎖/min 속도로 추출하였다. 이 후 salidroside 표준곡선을 이용하여 산겨릅나무 세포배양 추출물내 salidroside의 함량을 측정한 결과 약 9% w/w 정도의 salidroside 가 포함되어 있는 것으로 확인되었다. 산겨릅나무 세포배양 추출물내 salidroside의 동정은 LCQ-Decasystem (Finnigan, USA)을 사용한 LC-MS 분석법을 이용하여 확인하였다(Fig. 1, Fig. 2).

Fig. 1.Chromatograms of extract of cultured A. tegmentosum cells (A, boldline) and salidroside standard (B, dashedline). Stationaryphase; Capcell Pak C18 (4.6 × 250 ㎜), mobile phase; 5% methanol in water, column temperature; 35℃, flow rate; 1.0 ㎖/min, detection; UV 214 ㎚.

Fig. 2.LC-MS spectrums of extract of cultured (A) A .tegmentosum cells and (B) salidroside standard.

간독성 유발

산겨릅나무 세포배양 추출물의 급성 간독성에 대한 보호 효과를 조사하기 위하여 흰쥐를 아무것도 처리하지 않은 실험군(대조군), D-galactosamine (700 ㎎/㎏)에 의해 간독성을 유발한 실험군(GalN 실험군), 양성대조군인 silymarin (25 ㎎/㎏)을 미리 투여한 후 간독성을 유발한 실험군(Silymarine 실험군), UDCA (ursodeoxycholic acid) (40 ㎎/㎏)을 미리 투여한 후 간독성을 유발한 실험군(UDCA 실험군), salidroside (30 ㎎/㎏)을 미리 투여한 후 간독성을 유발한 실험군(Sal-30 실험군) 및 산겨릅나무 세포배양 추출물(300 ㎎/㎏)을 미리 투여한 후 간독성을 유발한 실험군(CE-300 실험군) 으로 나누어 각 실험군당 10마리씩 실험에 사용하여 매일 일정시간에 체중을 측정하였다. 간독성 유발은 D-galactosamine을 복강투여하였으며, 시험약물은 D-galactosamine 투여 2일 전, 1일 전 및 2시간 전에 경구 투여하였다. 모든 약품은 극소량의 DMSO (dimethyl sulfoxide)에 용해 후 생리식염수와 1%의 olive oil로 희석하여 경구 투여하였으며 이 후 D-galactosamine (700 ㎎/㎏)을 복강 투여하여 간독성을 유발하였다. 이 후 혈액은 24시간 경과 후 경동맥에서 채취하여 1,500 rpm에서 15분간 원심분리 한 후 혈장만을 회수하여 분석 전까지 −80℃에서 보관하였다. 혈액 채취 후 실험동물로부터 간 조직을 적출하여 생리식염수에 세척한 후 여과지로 물기를 닦아내었다. 이 후 간 조직의 중량을 측정하였고 조직 관찰을 위하여 간 조직의 일부를 FAA에 고정하였고 나머지는 차후 실험을 위해 −80℃에서 보관하였다.

간 조직의 미세 구조 관찰

간 조직의 미세구조를 관찰하기 위해 일반적인 조직 제작 방법에 따라 절취한 간 조직을 4℃ FAA 용액에서 24시간 고정하였다. Paraffin block은 4 ㎛의 두께로 절편하였고, hematoxylin과 eosin에 이중 염색하였다. 조직은 Olympus BX50 (Japan)하에서 관찰하였고, Olympus DP-71을 사용해 촬영하였다.

혈액 성분 분석

채취한 혈액은 3,000 rpm에서 원심 분리하여 AST (aspartate aminotransferase)와 ALT (alanine aminotransferase) 및 LDH (lactate dehydrogenase) 및 ALP (alkaline phosphate) 활성을 조사하였다. AST와 AST 분석은 Reitman-Frankle 법(1957)에 따라 조제된 kit (Asan, Korea)를 사용하여 기질액을 37℃에서 5분간 반응 시킨 후 혈장을 첨가하여 37℃에서 ALT 는 30분, AST는 60분간 반응시켰다. 이후 정색시액(2,4-dinitrophenylhydrazine, 19.8 ㎎/100 ㎖)을 첨가하고 0.4N-NaOH 용액을 가하여 실온에 방치하였고 505 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. 활성도는 표준검량선에 따라 혈장 1 ㎖당 Karmen unit (IU/L)로 표시하였다. LDH의 측정은 Wroblewskin와 LaDue의 방법(1955)에 따라 조제된 kit (Sigma-Aldrich, St. Louis, USA)를 사용하여 측정하였다. 기질액과 정색시액을 1:1로 혼합하여 37℃에서 5분간 반응시킨 다음 시료와 혼합하였다. 이 후 37℃에서 10분간 방치하였고 염산으로 반응을 종료시킨 후 570 ㎚에서 흡광도를 측정하였으며 표준곡선에 따라 활성도를 분석하였다. ALP는 Kind-King법(1954)에 따라 조제된 kit (Asan, Korea)를 사용하여 기질 완충액에 혈장 첨가 후 표준액과 혼합하여 37℃에서 15분간 반응시켰다. 이후 정색시약을 처리하여 10분간 실온 방치한 다음 570 ㎚에서 흡광도를 측정하여 표준곡선에 따라 효소 활성을 분석하였다.

간 조직의 지질함량과 지질과산화 분석

간 조직의 총 지질 함량은 Folch et al. (1975)과 Bligh와 Dyer(1959)의 방법에 따라 분석하였다. 간 조직 시료를 만들기 위하여 간 조직에 chloroform : methanol 혼합액(2:1)을 가하여 균질화하였고, 3000 rpm에서 10분간 원심 분리한 후 chloroform층을 분리하였다. 이 후 다시 chloroform을 가한 다음 원심 분리하여 chloroform층을 분리한 후 감압 건조한 후 함량을 측정하였다. 간 조직의 지질과산화 함량은 Ohkawa et al. (1979)의 방법을 이용하여 측정하였다. 간 조직에서 지방층을 제거하기 위하여 N-buthanol : pyridine의 혼합액(15：1) 300 ㎕를 첨가한 후 2,500 rpm에서 10분간 원심 분리하였으며 532 ㎚에서 상층액의 흡광도를 측정하였다. 1,1,1,3-tetraethoxypropane을 표준용액으로 사용하였고 지질과산화물 함량은 MDA nmol로 표기하였다.

항산화효소 활성 측정

SOD (superoxide dismutase)의 활성은 McCord와 Fridovich(1969)의 방법에 따라 실시하였다. 50 mM potassium phosphate buffer (pH 7.8), 0.1 M cytochrome C, 50 mM xanthine, 0.1 mM EDTA, 효소액이 포함된 용액을 25℃에서 예치한 다음 xanthine oxidase를 첨가하여 반응을 개시하였으며 반응은 550㎚에서 10초 단위로 150초간 흡광도를 측정하였다. Xanthine oxidase 첨가량은 효소액을 함유하지 않은 반응액의 흡광도 흡수가 분당 0.025가 되도록 조절하고 SOD 활성은 cytochrome C의 환원 속도를 50% 억제하는 양을 1 unit으로 정의하였다. CAT (catalase)의 활성은 Aebi (1984)의 방법에 따라 측정하였다. 50 mM phosphate buffer (pH 7.0), 15 mM H2O2 용액과 1 ㎎ protein의 시료를 넣은 후 240 ㎚에서 3분간 변화되는 흡광도를 측정하여 최초60초 동안의 H2O2 감소량을 활성도로 나타내었다. 효소의 활성은 1 ㎎의 단백질이 1분 동안에 1 μM의 H2O2를 분해시키는 효소의 양을 1 unit로 하였다. GPX (glutathione peroxidase)의 활성은 Flohe et al. (1984)의 방법에 따라 측정하였다. 1 mM EDTA를 함유한 100 mM phosphate buffer (pH 7.0), 3 mM GSH, 0.45 mM NADPH, 20 mM glutathione reductase 0.72 U와 1 ㎎ protein 시료를 넣고 37℃에서 5분간 방치한 다음 4 mM cumene hydroperoxide를 첨가한 후 반응을 개시하여 340 ㎚에서 3분 동안 변화되는 흡광도를 측정하였다. 효소의 활성은 1분 동안에 1 μmol의 NADPH를 NADP로 산화하는 효소의 양을 1 unit로 하였다.

Total RNA 분리 및 PCR

간 조직의 total RNA는 TRIzol reagent (Gibco Inc., USA)을 이용하여 추출한 후 total RNA clean up kit (Ambion, USA)를 사용하여 정제하였다. 정제된 RNA를 template로 SuperScript™ kit (Invitrogen, USA)를 이용하여 single stranded cDNA를 제조하였다. 간독성에 관련된 유전자들을 특이적으로 증폭하기위해 primer (Table 1)를 제작하였으며 각 유전자의 발현 정도를 mGAPDH 유전자의 발현과 비교하여 확인하였다. 유전자의 발현은 전기 영동 후 gel image analysis system (Core Bio iMaxTM, Korea)에서 UV illuminator로 결과를 확인하였으며, 발현 수준은 Un-SCAN-IT gel Version 5.1 (Silk Scientific, Inc.). 프로그램을 통해 분석하였다.

Table 1.Selected genes related hepatotoxicity and primer sequences used in RT-PCR

통계처리

각 실험에서 얻어진 결과는 평균± 표준편차로 나타내었다. 통계처리는 SPSS (version 12.0)로 분석한 후 t-검정을 실시하여 분산과 평균의 동일성 여부를 검정하였으며, 분석결과는 일원분산분석(one way ANOVA)에 의한 Duncan 검정을 실시하여 p값이 0.05 미만일 때 유의한 것으로 간주하였다.

 

결과 및 고찰

실험군별 체중과 간 조직의 중량

본 실험에서는 각 약물을 경구 투여한 후 D-galactosamine을 복강 투여하여 간독성을 유발한 실험군의 체중을 비교하였다. D-galactosamine을 이용하여 인위적으로 간 병변을 유발했을 때 대조군에 비해 상대적으로 모든 실험군의 체중이 감소하였는데, 특히 D-galactosamine만을 투여한 GalN 실험군의 체중이 가장 낮은 것으로 나타났다. 반면 산겨릅나무 세포배양 추출물을 투여한 CE-300 실험군의 체중은 양성대조군과 유사한 체중량을 보였다. 간 조직의 중량은 대조군에서 가장 높았으며 GalN 실험군에서 대조군의 약 88%에 해당하는 수준으로 낮게 나타났으나 기타 실험군에서는 간 조직의 중량에 있어 유의한 차이를 보이지 않았다(Table 2).

Table 2.zGalN group: D-galactosamine (700 ㎎/㎏) only treated group. ySal-30 group: Salidroside (30 ㎎/㎏) treated group before D-galactosamine injection. xCE-300 group: Acer tegmentosum cell extract (300 ㎎/㎏) treated group before D-galactosamine injection. +p < 0.05, ++p <0.01 indicate a significant difference between the control group and the GalN treated group. *p < 0.05, **p < 0.01 indicate a significant difference between the GalN group and the medicine treated group.

간독성 유발에 있어 사염화탄소(CCl4)는 간세포의 소포체에서 대사되어 trichloromethyl free radical과 같은 대사중간체로 되어 지질과산화를 초래함으로서 내부의 효소계를 파괴하고 전반적인 세포괴사를 유도하나(Letteron et al., 1990), D-galactosamine (GalN)은 간에 대한 특이성이 매우 높은 반면 다른 기관에는 영향을 주지 않는 것으로 보고되어 있기 때문에 (Keppler et al., 1970) 본 연구에서는 D-galactosamine을 사용하여 간독성을 유도하였다. 최근 연구에서 약물에 의한 간질환은 외래물질의 대사에 있어 중심 장기인 간을 직접적으로 손상시켜 생체 대사의 이상 현상과 체조직의 합성 방해를 초래하기 때문에 체중과 간 조직의 중량이 낮게 나타난다고 보고된 바 있다(Lee and Min, 2010). 본 연구에서도 체중과 간 조직의 중량은 GalN 실험군이 가장 낮게 나타났으나 산겨릅나무 세포배양 추출물을 경구 투여한 실험군의 경우 체중과 간 조직의 중량이 대조군과 유사한 수준으로 보호되는 경향을 보였다.

간조직의 미세구조 관찰

산겨릅나무 세포배양 추출물이 D-galactosamine 투여로 인한 간조직의 미세구조 변화에 미치는 영향을 조사하였다. 대조군의 간 조직은 중심에 위치한 간샘꽈리(hapatic acinus)의 문로 주위에서 말단간세정맥이 관찰되고 핵소체가 두드러진 커다란 다각형의 간세포가 가장자리에 흩어져 있어 어떠한 조직학적 이상도 관찰되지 않았다(Fig. 3A). 그러나 GalN 실험군의 간세포는 팽윤되고 지방 변성과 공포 현상을 보였으며 중심정맥 주변으로 세포 괴사가 관찰되었다. 또한 동모양 혈관의 구조가 소실되어 있었고 다핵세포의 출현과 염증세포의 침윤이 나타났으며 부분적으로 간세포의 수복에 의한 섬유화가 관찰되었다(Fig. 3B). 양성대조구로 사용된 silymarin 실험군, UDCA 실험군 및 Sal-30 실험군의 경우 간세포의 괴사는 관찰되지 않았고 국소적으로 지방변성과 염증세포의 침윤이 관찰되었으나 GalN 실험군과 비교할 때 그 정도는 매우 미미한 것으로 확인되었다(Figs. 3C, D, E). 반면 CE-300 실험군의 경우 국소적인 간경화지방 축적으로 인한 공포화 현상과 세포 괴사가 일부 발견되었으나 간세포 내 한개의 핵이 존재하고 세포 수복에 의한 섬유화 현상과 염증세포 침윤이 양호한 상태로 유지되는 경향을 보였다(Fig. 3F). Wills와 Asha (2006)는 D-galactosamine 투여에 따라 광범위한 간세포 괴사와 변성, 염증세포의 침윤 및 세포질 공포화가 심하게 나타났으나 실고사리과의 식물인 Lygodium flexuosum을 처리함에 따라 간병변이 감소하였다고 보고한 바있다. 본 연구에서 CE-300 실험군은 D-galactosamine의 투여 후 국소적인 간 손상이 관찰되었으나 간 조직의 염증반응과 괴사 및 공포화 현상은 크게 감소되어 대조군의 간 조직과 유사하게 유지되는 것으로 조사되었다.

Fig. 3.Photographies of rat liver pretreated with chemicals show the protective effects against hepatotoxicity. Rat were treated with chemical orally at intervals of 48 h, 24 h, 2 h before D-galactosamine injection. (A) Control group, (B) D-galactosamine (700 ㎎/㎏) only treated group, (C) Silymarin (25 ㎎/㎏) pretreated group before D-galactosamine injection, (D) UDCA (40 ㎎/㎏) pretreated group before D-galactosamine injection, (E) Salidroside (30 ㎎/㎏, 100 ㎎/㎏) pretreated group before D-galactosamine injection, (F) Cell extract (300 ㎎/㎏) pretreated group before D-galactosamine injection. (X 20) - Scale bar = 100 ㎛.

혈액 성분 분석

산겨릅나무 세포배양 추출물이 간독성에 대한 보호 효과를 알아보기 위하여 혈액 내 AST, ALT, LDH 및 ALP의 활성을 측정하였다. 대조군의 AST 활성은 60.1 ± 3.2 IU/L로 나타났으나 D-galactosamine으로 간독성을 유발한 GalN 실험군은 150.0 ± 1.5 IU/L로 유의하게 증가하였다. 반면 CE-300 실험군의 AST 활성은 90.7 ± 1.8 IU/L로 나타나 양성대조군인 silymarin, UDCA 및 Sal-30 실험군과 유사한 활성을 보였다. 혈액 내 ALT 활성은 대조군이 35.6 ± 2.0 IU/L로 나타났으나 간독성을 유발한 GalN 실험군은 101.0 ± 3.5 IU/L로 높은 활성을 보였으며, CE-300 실험군은 45.6 ± 0.9 IU/L로 GalN군에 비해 ALT 활성이 비교적 낮게 조사되었다. 또한 LDH의 활성은 대조군이 1041.2 ± 11.2 IU/L인데 반해 GalN 실험군이 2317.0 ± 13.1 IU/L으로 나타나 간독성 유발 후 높은 수준을 보였으나 CE-300 실험군의 경우 1317.2 ± 19.1 IU/L로 나타나 간 손상에 의해 급격히 증가되는 LDH 수준을 정상 수준으로 보호하는 것으로 확인되었다. 대조군의 ALP 수치는 534.2 ± 12.5 IU/L으로 나타났으며 GalN 실험군의 경우 850.0 ± 12.3 IU/L로 대조군에 비해 높은 수준을 보였다. 그러나 CE-300 실험군은 594.1 ± 14.4 IU/L로 나타나 양성대조군 수준으로 보호되는 경향을 나타내었다(Table 3). 최근 Park et al. (2008)은 민들레(Taraxacum officinale) 물 추출물이 D-galactosamine에 의해 유의하게 증가한 AST와 ALT, LDH 및 ALP의 활성을 대조군과 유사한 수준으로 감소시켜 간조직을 효과적으로 보호할 것이라고 시사한 바 있다. 또한 Kim et al. (2004)은 지부자(Kochiae fructus) 활성성분을 투여한 실험군이 D-galactosamine 단독 투여군에 비해 간 병변으로 인한 AST와 ALT 활성의 증가를 감소시켜 간 손상을 개선시키는데 효과가 있다고 한 바 있다. 본 연구에서 D-galactosamine로 인해 현저하게 상승된 AST와 ALT 및 LDH 활성은 대조군에 비해 GalN 실험군에서 높게 증가되는 양상을 보였는데, CE-300 실험군의 경우 GalN 실험군과 비교하여 간 손상 지표효소의 활성을 비교적 효과적으로 보호하는 것으로 조사되었다.

Table 3.+p <0.05, ++p <0.01 indicate a significant difference between the control group and the GalN treated group. *p < 0.05, **p < 0.01 indicate a significant difference between the GalN group and the medicine treated group.

지질함량 분석

산겨릅나무 세포배양 추출물이 D-galactosamine에 의해 유도된 간독성에 미치는 영향을 알아보고자 간 조직 내 지질함량과 과산화지질 함량을 조사하였다. 대조군의 지질함량은 33.0 ± 1.1 ㎎/g로 나타났으나 D-galactosamine으로 간독성을 유발한 GalN 실험군은 63.3 ± 2.0 ㎎/g로 유의하게 증가하였다. 이러한 증가는 CE-300 실험군의 지질함량도 39.9 ± 0.8 ㎎/g로 유의하게 감소하여 양성대조군인 silymarin과 UDCA 실험군과 유사한 활성을 보였다. 대조군의 과산화지질 함량은 1.2 ± 0.9 ㎍/㎎ 인데 반해 간독성을 유발한 GalN군은 2.1 ± 0.3 ㎍/㎎로 높은 수준을 보였다. 반면 CE-300 실험군의 경우 과산화지질 함량이 1.6 ± 0.5 ㎍/㎎로 나타나 양성 대조군과 유사한 수준으로 회복되는 경향을 보였다(Table 4).

Table 4.+p < 0.05, ++p < 0.01 indicate a significant difference between the control group and the GalN treated group. *p < 0.05, **p < 0.01 indicate a significant difference between the GalN group and the medicine treated group.

D-galactosamine과 같은 독성 물질들은 생체 내 oxygen radical과 같은 물질을 생성시켜 세포막 구성성분 중의 하나인 불포화 지방산을 산화시킨다. 산화된 불포화 지방산은 hydroxy-peroxide, endoperoxide, polyperoxide 등 지질과산화물로 생성되어 malondialdehyde (MDA)로 분해된다. 체내 MDA가 생성되면 생체 구성 물질에 악영향을 미쳐 동맥경화, 당뇨병, 암등 다양한 퇴행성 질환을 유발하기 때문에 MDA는 독성 유발인자와 산화적 스트레스를 대표하는 표지물질로 알려져 있다(Vimal and Devaki, 2004; Spiteller, 2007). Eu et al. (2010)은 theanine이 아세트아미노펜에 의한 간 내 과산화지질에 미치는 영향을 조사한 결과 theanine를 처리한 실험군의 과산화지질도는 대조군과 유사한 수준을 보여 아세트아미노펜에 의한 간 손상을 감소시키는 작용을 나타낸다고 하였다. 이와 더불어 Lee et al. (2011)은 흰쥐에 오이발효음료를 급여한 후 만성적으로 에탄올을 급여한 결과 조직 내 지방 축적과 과산화물 생성을 억제시켜 알코올에 의한 간 손상으로부터 조직을 효과적으로 보호할 것이라고 시사한 바 있다. 본 연구에서도 CE-300 실험군은 상승된 독성 유발인자와 산화적 스트레스로 인해 생성되는 과산화지질의 함량을 양성 대조군인 silymarin과 UDCA 실험군과 유사한 수준으로 감소시킨 것으로 보아 지질대사 이상을 개선하는 데 효과적인 것으로 조사되었다.

항산화효소 활성

산겨릅나무 세포배양 추출물이 D-galactosamine에 의한 산화적 스트레스에 미치는 영향을 알아보고자 간 조직 내의 항산화효소 활성을 조사하였다. 각 실험군별 SOD 활성은 D-galactosamine의 투여에 따라 감소하여 GalN군이 29.49 ± 1.11 unit으로 가장 낮은 SOD 활성을 보였으며, 이러한 효소 활성 변화는 CAT와 GPX에서도 나타나 GalN군의 CAT 활성은 19.98 ± 1.02 unit, GPX 활성은 9.06 ± 1.21 unit으로 나타나 GalN군에서 항산화효소의 활성이 모두 감소하는 경향을 보였다. 반면양성 대조군인 silymarin 실험군과 UDCA 실험군은 GalN 실험군에 비해 항산화효소의 활성이 점차 회복되어 대조군과 유사한 수준을 보였다. CE-300 실험군의 SOD 활성은 31.51 ± 4.83 unit, CAT의 활성은 23.11 ± 2.01 unit, GPX의 활성은 16.22 ± 1.10 unit로 조사되어 대조군과 유사한 수준으로 회복되어 가는 경향을 나타내었다(Table 5). Lim (2008)의 연구에 따르면 사염화탄소로 간독성을 유발한 실험군에 비해 발효 알로에(Aloe vera)를 처리한 실험군은 SOD와 CAT의 활성이 유의하게 증가되어 체내 간손상을 감소시키는 효과가 크다고 한 바 있으며, 양파(Allium cepa) 추출물은 t-BHP 처리에 의해 손상된 간세포에서 간세포 내 항산화효소의 활성을 증가시켜 간독성에 대한 보호효과를 갖는다고 한 바 있다(Rhim and Lim, 2005). 본 연구에서도 산겨릅나무 세포 추출물의 처리에 따라 항산화효소의 활성이 대조군 수준으로 증가하는 경향을 보이고 있어 간 독성 물질에 의한 산화적 스트레스를 감소시키는 것으로 확인되었다.

Table 5.+p < 0.05, ++p < 0.01 indicate a significant difference between the control group and the GalN treated group. *p < 0.05, **p < 0.01 indicate a significant difference between the GalN group and the medicine treated group.

TNF-α 발현율 분석

산겨릅나무 세포배양 추출물이 간독성에 의한 염증성 사이토카인에 미치는 영향을 알아보기 위해 GalN 실험군에 대한 실험군별 상대적 TNF-α 발현율을 분석하였다. GalN 실험군에 대한 대조군의 TNF-α 발현율은 36.0%으로 나타났으며 양성 대조군인 silymarin과 UDCA 실험군은 각각 56.5%, 70.6%로 확인되었다. 또한 CE-300 실험군의 TNF-α 발현율은 85.4%로 조사되어 GalN 실험군에 비해 낮은 수준을 보였다(Fig. 4). 기존 보고에 따르면 사염화탄소에 의해 유발된 간 손상 시 활성화된 쿠퍼세포에서 유도된 TNF-α가 염증반응을 촉진시켜 조직상해 및 괴사를 유도하는 것으로 알려져 있다(Simeonova et al., 2001). Shin et al. (2010)은 사염화탄소를 투여한 실험군의 혈중 TNF-α 농도는 대조군에 비해 현저히 증가하였으나 치자(Gardenia jasminoides)를 투여함에 따라 혈중 TNF-α의 농도가 크게 감소되었으며 유전자 발현도 억제되어 간 보호 효과가 높다고 한바 있다. 또한 Kim et al. (2010)은 녹차(Camellia sinensis) 추출물이 에탄올에 의한 조기 간세포에 미치는 영향을 관찰하기 위해 TNF-α의 발현율을 확인한 결과 에탄올 투여 후 간 조직 내 TNF-α의 발현율이 증가하였으나 녹차 추출물을 투여함에 따라 TNF-α량 증가가 억제되는 것으로 보아 간 손상을 억제하는데 중요한 역할을 할 것이라 시사한 바 있다. 본 연구에서 산겨릅나무 세포배양 추출물을 처리한 실험군의 경우 간 조직 내 TNF-α의 발현을 감소시키는 효과를 보여주고 있어 D-galactosamine에 의한 염증 반응으로부터 간을 보호하는 데 매우 효과적인 것으로 조사되었다.

Fig. 4.Compared effect of cultured Acer tegmentosum cell extract on D-galactosamine inducible TNF-α production.

본 연구에서 산겨릅나무 세포배양 추출물이 HO-1의 발현에 미치는 영향을 조사한 결과 실험군별 발현 수준에 유의적인 차이를 보이지 않아 산겨릅나무 세포 추출물이 염증 반응에 세포를 보호하는 데에는 주목할만한 영향을 미치지 않는 것으로 확인되었다(data not shown). 따라서 산겨릅나무 세포배양 추출물에 의한 염증 반응 억제는 TNF-α의 발현을 통해 조절되어 나타나는 것으로 판단되며, 차후 심층적인 연구를 통하여 산겨릅나무 세포배양 추출물의 효능 검증이 필요할 것으로 사료된다.