Synergistic Effects of Cinnamomum camphora Leaves Extract against Clinical Isolated Methicillin-resistant Staphylococcus aureus

임상에서 분리한 메치실린 내성 황색포도상구균에 대한 녹나무잎 추출물의 항균활성

Abstract

Methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) has been emerging worldwide as one of the most important hospital and community pathogens. At the same time, because of the difficulty in developing chemical synthetic drugs and because of their side-effects, scientists are making more efforts to search for new drugs from plant resources to combat clinical multidrug-resistant microbial infections. Cinnamomum camphora (C. camphora) is a plant of family Lauraceae, and grown Jeju island in South Korea that are used as a drug to treat neurasthenia, epilepsy, cystitis, pyelonephritis, digitalis, cancer, and diabetes mellitus in folk remedies. In this study, antibacterial activites of 80% ethanol extract of C. camphora leaves (CCE) were investigated in combination with antibiotics against clinical isolates of MRSA. The results showed that CCE was determined with MIC and MBC values ranging from 156 to 313 and 313 to $625{\mu}g/ml$, oxacillin from 128 to 256 and 128 to $512{\mu}g/ml$, ampicillin from 4 to 64 and 8 to $128{\mu}g/ml$. The combination of CCE with oxacillin or/and ampicillin were synergistic effect against MRSA 1, 6, 7, 8, 10, 11, 12, 13, and 15/ MRSA 1, 2, 6, and 7.

메치실린내성 황색포도상구균(MRSA)은 가장 중요한 지역 사회 병원성 균주의 하나로서 항생제 내성 문제가 세계적으로 대두되고 있다. 감염 치료에 대한 부작용과 내성이 적은 새로운 항생제의 개발에 많은 관심과 연구가 필요하다. Cinnamomum camphora는 제주도에서 자생하는 녹나무과의 식물이다. 민간에서는 신경 쇠약, 간질, 방광염, 신우 신염, 당뇨, 암과 당뇨병 치료제로 이용되고 있다. 본 연구에서는 80% 에탄올을 이용하여 녹나무잎을 추출물하여 임상에서 분리한 메치실린 내성 균주에 대한 항균활성을 연구하였다. 그 결과 녹나무잎 추출물에서 높은 항균활성을 관찰 할 수 있었고, 항생제와의 병용처리 녹나무잎 추출물의 MIC와 MBC의 범위는 $156-313{\mu}g/ml$와 $313-625{\mu}g/ml$로 판독되었고, oxacillin의 병용처리의 범위는 $1288-256{\mu}g/ml$와 $128-512{\mu}g/ml$, 그리고 ampicillin의 병용처리 범위는 ${\mu}g/ml$와 $8-128{\mu}g/ml$로 판독되었다. 녹나무잎 추출물과 항생제의 병용처리는 MRSA 항균활성에 대한 상승효과가 높게 나타났다.

서 언

Staphylococcus aureus (S. aureus)는 피부감염증, 식중독, 폐혈증 둥 여러 감염을 일으킬 수 있는 주된 병원성 세균으로 널리 알려져 있다(Han, 2011). 1961년 영국에서 메치실린 내성포도상구균 (methicillin-resistant Staphyloccus aureus, MRSA)이 처음 보고된 이후 우리나라에서도 1980년대 들어서면서 여러 병원에서 MRSA 발생을 보고하고 있으며 현재까지 대표적인 병원감염 원인균 중의 하나이다(Lee et al., 2005). 또한 최근 반코마이신 내성포도상구균(vancomycin-resistant Staphyloccus aureus,VRSA)과 같은 슈퍼박테리아의 출현으로 항균제 내성의 문제가 심각하게 대두된 가운데 전통적으로 감염질환 치료에 사용되어 온 식물로부터 항균물질을 분리하기 위한 연구가 활발히 진행되고 있다(Shin and Seong, 2006; Heo et al., 2012; Hwang et al., 2014).

녹나무(Cinnamomum camphora)는 Lauraceae과로 난대성 기후에서만 자라는 나무로 겨울에도 잎이 떨어지지 않는 상록활엽수이다(Han, 2011). 또한 천연기념물 제162호로 국내에서는 제주도에서 주로 자생하며 지리적으로는 일본, 중국, 대만, 인도네시아에 분포한다(Ko et al., 2005). 재목, 가지, 잎, 뿌리를 말려 수증기로 증류시켜 얻은 기름을 장뇌라고 하며, 장뇌에는 정유성분인 camphor가주성분이고 cineol, α-pinene, l-camphene, d-limonene, safrol, α-camphorene 등이 함유되어 있다(Stubbs et al., 2004). 가지와 뿌리는 강심제를 만드는 약의 원료가 되고, 잎은 서양요리의 소스를 만들 때 사용하기도하며 민간에서는 방해충, 신경쇠약, 간질, 방광염, 신우신염, 강심제로도 알려져 있고, 제주도에서는 당뇨, 암 치료약으로 사용되어 왔다(Lee, 2003). 다방면에 이용되고 있는 녹나무추출물의 MRSA 항균활성과 항생제 병용 처리 후 시너지 효과를 확인하고 천연 항생제로서의 이용 가능성을 제시하고자 한다.

 

재료 및 방법

천연물 확보 및 추출

본 실험에 사용된 재료는 제주지역에서 채집하여 대한식물도감을 참고하여 동정하였으며, 실험에 사용된 녹나무(Voucher No. JBRI-0624027)의 증거표본은 제주생물종다양성연구소 표본실에 보관하였다. 동정된 녹나무 잎은 음건 후 믹서기로 분쇄하여 80% 에탄올로 실온에서 24시간 3회 추출하여 동결건조 후 냉동보관 하였으며, 실험 전 10% Dimethyl sulfoxide (DMSO, Sigma-Aldrich, MO, USA)에 녹여 0.22 mm (Merck millipore, France)로 필터 후 멸균 증류수로 농도별 희석하여 실험하였다.

MRSA 분리 및 동정

전라북도의 한 대학병원의 임상샘플을 받아 Mannitol Salt Agar (MSA, Sigma-Aldrich)에 2 mg/ml oxacillin (Sigma-Aldrich)이 첨가된 배지에 접종하여 노란색 집락으로 변한 집락을 찾아 1차 스크리닝 하였다. MRSA 확인동정을 위해서는 femA유전자와 penicillin-binding protein (PBP) 2` (Choi et al., 2009)을 생성하는 mecA 유전자를 PCR법으로 시험하였다. Tryptic soy agar (TSA, Becton Dickinson, NJ, USA)배지에 접종하여 37℃, 호기성 배양기에서 18시간 배양한 집락을, QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen, Hilden, Germany)를 사용하여 주형 DNA를 분리하였다. 사용된 primer의 염기서열은 Table 1과 같으며, Cosmogene Co. (Daejeon, Korea)에 의뢰하여 합성하였다. Forward와 reverse primer를 각각 1 ml, PCR mastermix (Bioneer, Korea) 4 ml, DEPC 12 ml, 주형 DNA 2 ml를 넣어 PCR반응의 최종 액을 20 ml로 하였다. PCR 반응은 thermal cycler (Abcam, CA, USA)를 사용하였으며, 위의 2개의 유전자 증폭조건은 95℃ 5분간 predenaturation, 95℃ 30초 denaturation, 50℃ annealing 30초, 72℃ extention 30초로 30회 반복하여, 72℃ 5분 last extention 시킨 후 4℃에서 종료시켰다. 반응 후 1.5% agarose gel (Lonza, NJ, USA)에서 전기영동 하여 ethidium bromide (EtBr, Invitrogen, NY, USA)로 염색 한 후 결과를 확인하였다. MRSA로 최종 동정된 균주는 30% glycerol이 첨가된 Brain Heart Infusion (BHI, Becton Dickinson) broth에 풀어 −70℃에 보관하였다(Kim et al., 2009).

Table 1.Primers used for detection of the mecA and femA genes from S. aureus

Minimum Inhibitory Concentrations (MICs)/Minimum Bactericidal Concentrations (MBCs)

임상에서 분리된 MRSA 균주의 녹나무잎 추출물(80% EtOH cinamomum camphora leaves extract, CCE)과 항생제의 minimum inhibitory concentrations (MICs)는 broth dilution method로 측정하였다. MIC 측정은 Mueller Hinton borth (MHB, Becton Dickinson)에 항생제와 CCE를 단계 희석한 후, 균의 최종희석 농도를 1 × 106 CFU/ml로 하여 37℃ 18시간 배양 후 540 nm에서 흡광도를 측정하여 판독하였다. MIC 농도를 기준으로 증식하지 않은 배양액 100 ml를 TSA에 균일하게 도말하여 37℃ 18시간 배양 후 99.9% 살균이 되는 농도로 MBC를 판독하였다.

Checkboard Dilution Assay

CCE와 β-lactam계의 항생제인 oxacillin과 ampicillin의 synergistic effect를 checkbord dilution method로 확인하였다 (Arnold and Morrison, 1984; Cha et al., 2014). 각 천연물과 항생제의 혼합에 따른 fractional inhibitory concentration (FIC)와 fractional bactericidal concentration (FBC)는 다음과 같이 계산하였다.

FICA = MICA in combination / MICA FICB = MICB in combination / MICB FIC Index = FICA + FICB

FBCA = MBCA in combination / MBCA FBCB = MBCB in combination / MBCB FBC Index = FBCA + FBCB

FIC index 0.5 이하 synergistic, 0.5에서 1사이 additive, 1 에서 2 사이 indifference, 2 이상일 경우 antagonism 으로 해석하였다 (Cha et al., 2007; Lee and Cha, 2010; Cha et al., 2014).

 

결과 및 고찰

MRSA 동정

2 μg/ml의 oxacillin이 첨가된 MSA에서 노란색 집락이 생성된 15 균주에서 femA, mecA의 유전자를 검출한 결과 15균주 모든 샘플에서 S. aureus를 확인 동정하는 femA유전자를 확인 할 수 있었고, PBP 2`을 생성하는 mecA 유전자 또한 확인하였다(Fig. 1).

Fig. 1.Agarose gel electrophoresis of amplified 372-bp, 554-bp DNA fragments of the femA, mecA genes of S. aureus isolates by PCR.

항생제와 CCE와 병용처리 후 항생제 내성균주의 시너지 효과

본 시험에 사용된 임상에서 분리된 MRSA에 대한 CCE의 MIC, MBC 범위는 313-1.25 μg/ml, 0.625-1.25 μg/ml였고, oxacillin의 MIC, MBC 범위는 512-1024 μg/ml, 512-1024 μg/ml, ampicillin의 위는 MIC와 MBC모두 32-256 μg/ml였다(Table 2).

Table 2.zMSSA (ATCC 25923): reference strain Methicillin-sensitive Staphylococcus aureus. yMRSA (ATCC 33591): reference strain Methicillin-resistant Staphylococcus aureus. xMRSA (1-15): Methicillin-resistant Staphylococcus aureus isolated a clinic.

CCE와 oxacillin의 병용 처리 결과는 CCE에서 MIC와 MBC의 범위는 156-313 μg/ml와 313-625 μg/ml이고, oxacillin에서는 MIC와 MBC의 범위는 128-256 μg/ml와 128-512 μg/ml로 나타났으며, CCE와 oxacillin의 단독처리시보다 병용처리시 항균활성이 높은 것을 확인할 수 있었다(Table 3, 4). CCE와 ampicilin 병용처리시 CCE의 MIC와 MBC의 범위는 156-625 μg/ml와 156-625 μg/ml이고, ampicillin에서는 MIC와 MBC의 범위는 4-64 μg/ml와 8-128 μg/ml로 나타났으며, ampicillin과 CCE와의 병용처리 역시 높은 항균활성을 확인할 수 있었다. 또한, FIC index와 FBC index로 계산하여 판독한 결과 CCE와 oxacillin의 병용처리는 MRSA 2, 3, 4, 5, 9, 14를 제외한 MRSA에서 synergistic 효과를 확인 하였고(FIC ≤ 0.5), CCE와 ampicillin의 병용처리시 MRSA 1, 2, 6, 7에서 시너지효과를 관찰할 수 있었다. 시너지효과는 CCE와 oxacillin의 병용효과가 ampicillin과의 병용효과보다 더 좋은 것을 확인하였다.

Table 3.zThe MIC and MBC of CCE with ampicillin.ythe FIC index.xMSSA (ATCC 25923): reference strain Methicillin-sensitive Staphylococcus aureus.wMRSA (ATCC 33591): reference strain Methicillin-resistant Staphylococcus aureus. vMRSA (1-15): Methicillin-resistant Staphylococcus aureus isolated a clinic.

Table 4.zThe MIC and MBC of CCE with ampicillin.ythe FIC index.xMSSA (ATCC 25923): reference strain Methicillin-sensitive Staphylococcus aureus. wMRSA (ATCC 33591): reference strain Methicillin-resistant Staphylococcus aureus. vMRSA (1-15): Methicillin-resistant Staphylococcus aureus isolated a clinic.

또한, reference 균주인 S. aureus ATCC 25923은 FIC와 FBC index 결과에서 oxacillin, ampicillin 모두 시너지 효과가 없었고, 반면에 S. aureus ATCC 33591에서는 시너지 효과가 확인되어 MRSA 균주 특이적으로 시너지 효과가 있음을 확인 할 수 있었다(Table 2, 3).

MRSA는 병원성 감염의 중요한 원인균이고 최근 VRSA와 같은 슈퍼박테리아의 증가로 인해 항균제 내성의 문제가 심각하게 대두되어 천연물질을 이용한 항균물질을 분리하기 위한 연구가 활발하게 진행되고 있다. Zhao et al. (2001)의 보고에 따르면 녹차 잎에서 추출한 EGCg 추출물과 β-lactam계 항생제의 MRSA 시너지 활성을 확인할 수 있었고, Cha et al. (2014)은 단삼에서 분리한 cyptotanshinone에서 분리한 물질로 MRSA와 VRSA의 시너지 활성을 본 결과 oxacillin, ampicillin, vancomycin에서 항생제 처리보다 병용처리의 항균활성이 월등히 높은 것을 확인 하였다 (Cha et al., 2014). 또한 Ha (2009)는 녹나무 부탄올 분획물이 멜라닌 생합성에 관여한다고 보고하였고, Han (2011)은 메탄올 추출 녹나무의 방충효과와 Klebsiella pneumoniae의 항균활성에 효과가 있다 고 보고 하였다(Ha et al., 2009; Han 2011). 본 연구에서도 CCE을 이용해 항균활성과 항생제 시너지활성을 보았고, 내성균이 단독으로 항생제나 CCE에 노출 되었을 때보다 병용처리 하였을 때 항균활성이 높은 것을 확인하였으며, 그 결과 β-lactam계 내성 영향을 미치지 않는 새로운 약물 개발을 위한 천연물질 소재로 제시할 수 있다고 사료된다.