In Vitro Anti-Helicobacter pylori Activity of Ethanol Extract of Sohamhyoongtang and Coptidis Rhizoma Total Alkaloids

소함흉탕 에탄올 추출물 및 황련 알칼로이드의 헬리코박터 파이로리에 대한 항균활성

Abstract

The aim of this study was to evaluate the anti-helicobacter activity of the ethanol extract of Sohamhyoongtang (Coptidis Rhizoma, Pinelliae Tuber and Trichosanthis Semen) and Coptidis Rhizoma total alkaloids, which is one of the components of Sohamhyoongtang. Crude ethanol extract of Sohamhyoongtang (ESHHT) and Coptidis Rhizoma total alkaloids (CRTA) were used for this experiment. Five different types of H. pylori (including H. pylori 26695) were used as test strain. To determine anti-helicobacter activity, minimum inhibitory concentration (MIC) was determined by agar dilution method. The effect of ESHHT and CRTA on the gene expression of H. pylori was investigated by quantitative realtime-PCR (qRT-PCR). MICs of ESHHT against five H. pylori strains were $250{\sim}500{\mu}g/ml$ and MICs of CRTA against five H. pylori strains were $50{\sim}200{\mu}g/ml$. Four representative virulence genes of H. pylori, cagA, ureA, ureB and ureI were tested as target genes for qRT-PCR. According to the qRT-PCR results, both ESHHT and CRTA markedly repressed the expression of cagA gene of H. pylori 26695 (6.91 and 20 folds respecively). These results showed that the ESHHT and CRTA demonstrated antihelicobacter properties, suggesting their potential use in gastritis or duodenal ulcer.

재료 및 방법

사용 균주 및 배양 −본 실험에 사용한 H. pylori 균주 5종은 Table I에 나타내었다. H. pylori의 배양은 brain heart infusion 배지(Difco, Sparks, MD, USA)에 7% horse serum (Sigma Co. St. Louis, USA), 0.4% isovitalex (BBL, Sparks, MD, USA), vancomycin (6 μg/mL), amphotericin B (8 μg/mL), trimethoprim (5 μg/mL)를 첨가하여 제조한 배지에(이하 BHI 배지로 칭함) 배양하였으며 배양조건은 37℃, 미호기성 환경(5% O2, 10% CO2 및 85% N2 gas)에서 배양하였다.

추출물의 조제 −본 실험에 사용한 황련(Coptidis Rhizoma), 반하(Pinelliae Tuber), 괄루인(Trichosanthis Semen)은 경동시장에서 구입하였다(주식회사 월드허브). 황련, 반하 그리고 괄루인을 소함흉탕의 비율에 맞게 혼합 후 90% 에탄올에 4시간씩 3회 water bath에서 중탕으로 추출하였으며, 여과 후 rotary evaporator를 사용하여 감압 농축하여 에탄올 추출물(ESHHT)을 제조하였다. 황련 알카로이드는 3% HClacidic ethanol로 추출, 농축하여 생성되는 조알칼로이드 (CRTA) 침전물을 사용하였다.

Table I.H. pylori strains that used for this experiment

최소저지농도(Minimum Inhibitory Concentration, MIC)의 측정 −소함흉탕 에탄올 추출물(ESHHT)과 황련 총 알카로이드(CRTA)의 H. pylori에 대한 소저지농도의 측정은 Clinical Laboratory Standard Institute (CLSI)의 guide line을 따라 실시하였다.20)ESHHT 및 CRTA 를 최고농도 500 μg/mL 농도부터 최저 농도 25 μg/mL 농도로 함유하도록 계열 희석한 BHI 배지를 만들고 H. pylori을 107 CFU/mL 농도로 접종하고 미호기적 조건에서 3일간 배양 후 균의 성장을 확인할 수 없는 농도를 MIC로 하였다. 실험의 도관리를 위해 표준 항생제로 amoxicillin을 사용하여 H. pylori ATCC 43504에 대한 MIC값을 측정하였다.

H. pylori ATCC 700392의 RNA 분리 및 cDNA 합성 − ESHHT 및 CRTA의 항균활성을 확인한 후 이러한 성분이 H. pylori의 병독인자들과 어떠한 상호 작용을 하는지 확인하고자 하였다. 요소분해효소 유전자인 ureA, ureB, ureI 및 염증관련 유전자 cagA를 선택하여 ESHHT 및 CRTA 성분이 유전자 발현에 끼치는 영향을 보고자 하였으며 H. pylori 균주의 유전적 다양성 때문에 본 실험에서는 유전적 배경이 가장 잘 알려진 균주인 H. pylori ATCC 700392(H. pylori 26695)균주를 사용하여 실험하였다. 균의 성장을 억제하지 않는 것으로 확인된 ESHHT 50 μg/mL 및 CRTA 10 μg/mL 농도로 함유하는 조건에서 H. pylori ATCC700392를 액체 배양하고 Hybrid-RTM (GeneAll, 서울) kit을 사용하여 total RNA를 분리하였다. RNA 정량 후 total RNA 1 μg을 template로 AccuPower CycleScript RT premix (dN12) (Bioneer, 대전) 시약을 사용하여 cDNA를 합성하였다.

Table II.Primer sequences that used for this experiment

qRT-PCR −위에서 설명한 방법으로 합성한 cDNA를 template로 H. pylori의 대표적인 병인 유전자인 cagA, ureA, ureB 및 ureI유전자 발현의 변화를 qRT-PCR 반응을 실시하여 ddCt 법으로 결과를 분석하여 비교하였다. 본 실험에 house keeping 유전자는 cysS유전자를 사용하였으며 각 유전자 증폭에 사용한 primer는 IDT (Integrated DNA Technology, San Diego, CA, USA) 에서 합성하여 사용하였으며 primer의 염기서열은 Table II에 나타내었다. PCR 반응은 2 X PowerSYBR Green PCR Mastermix (Life Technologies Pty Ltd, NY, USA) 10 μL, cDNA 1 μL, primer 각 5 pmole 및 RNase free water를 넣어 최종 반응 부피가 20 μL가 되도록 하여 StepOne realtime PCR system (Life Technologies Pty Ltd, NY, USA) 기기를 사용하여 다음과 같은 조건에서 반응하였다. 95℃에서 10분간 denaturation 후, 95℃에서 15 초, 60℃에서 60초 반응을 40회 반복수행 후 95℃에서 초당 온도를 0.3℃ 씩 낮추며 생성된 PCR 산물의 melting curve 분석을 실시하였다. 최종 실험결과의 분석은 정상적인 배지에서 배양한 대조군의 house keeping 유전자인 cysS를 기준으로 각 배양 조건별 각 유전자별 상대정량분석을 하는 ddCt 분석을 실시하여 분석하였다.

Urease Assay − CRTA 성분에 의한 ureA 유전자 발현 억제효과를 효소 수준에서 확인하기 위하여 다음과 같이urease 효소 활성을 in vitro에서 측정하였다.21)qRT-PCR을 실시하였던 것과 동일한 조건으로 H. pylori ATCC 700392를 배양 후 균체를 수확하여 2 mL PBS에 현탁하고 30초간 sonication 하여 세포를 파쇄한 후 10,000 rpm 원심분리 후 상등액을 crude enzyme solution으로 사용했다. 각 enzyme solution 0.1 mL에 5M urea 0.05 mL를 가하고 37℃에 서10분간 반응 후 1N-H2SO4 0.1 mL을 가하여 반응을 중지하였다. Solution I (phenol 5 g, Sod. nitroprusside 25mg, DW 249 mL) 1 mL 및 Solution II (NaOH 2.5 g, Na2HPO4 · 12H2O 26 g, NaOCl 5 mL, DW 495 mL) 1 mL를 넣어준 후 60℃에서 20분간 반응 후 600 nm에서 흡광도를 측정하여 효소 활성을 측정하였다.

 

결과 및 고찰

ESHHT 및 CRTA의 H. pylori에 대한 항균력 − ESHHT과 CRTA를 최고농도 500 μg/mL 농도부터 최저농도 25 μg/mL농도로 함유하도록 BHI 배지를 만들고 H pylori을 107 cfu/ml 농도로 접종하고 미호기적 조건에서 3일간 배양 후 균의 성장을 확인할 수 없는 농도를 MIC로 하였다. 실험조건의 정도관리를 위한 대조군으로는 H. pylroi ATCC 43504의 amoxicillin 대한 MIC 값을 측정하였다. 그 결과 ESHHT의 MIC 값은 균종에 따라 250 μg/mL~500 μg/mL 농도를 나타냄을 알 수 있었다. 한편 소함흉탕성분 중 하나인 황련의 총 알카로이드인 CRTA의 MIC 값은 균종에 따라 50 μg/mL~200 μg/mL 농도를 나타냄을 알 수 있었다 (Table III). Ma13)등의 중국의 전통 약용식물을 대상으로 한 연구결과에서도 황련의 열수 추출물의 효과가 가장 우수하다는 보고를 하였는데 총 열수 추출물을 사용한 결과 3.9 mg/mL~7.8 mg/mL농도에서 MIC 값을 나타낸다는 보고를 하였다. 이 결과에서 나타난 MIC 값보다 본 연구자등의 MIC 값이 낮은 것은 본 연구자등은 황련의 조알카로이드를 사용하였고 Ma13)등의 연구에서는 총 열수추출물을 사용한 결과로 사료되고, 균 접종량이 본 연구자등이 사용한 107 CFU/mL 보다 고농도인 108CFU/mL을 접종한 접종량의 차이에도 기인할 것으로 판단된다. CRTA 성분의 MIC 값이 ESHHT 에 비하여 2.5배에서 5배정도 낮은 농도에서 살균력을 나타내는 것으로 보아 소함흉탕 성분중 황련 알카로이드가 실제적인 항균활성 물질로 추정되었다. 따라서 추후 CRTA를 더 분리 정제하여 단일 알칼로이드 수준에서의 항균력 측정도 필요할 것으로 사료된다.

Table III.MIC of amoxicillin against H. pylori ATCC 43504 was < 0.1 μg/mL

H. pylori ATCC 700392 cagA 유전자 발현의 억제 −ESHHT 및 CRTA의 항균활성을 확인한 후 이러한 성분이 H. pylori의 병독인자들과 어떠한 상호 작용을 하는지 알아보고자 하였다. H.pylori의 병독인자로는 균주가 위내 환경에 정착하는데 관여하는 정착인자와 실제 염증 반응등을 유발하는 질병관련 인자로 구분할 수 있다.22,23)위점막 환경정착인자로는 요소분해효소(urease), 운동성 관련 인자, catalase, 부착 인자(adhesion)등이 있으며 질병관련인자로는 cagA, vacA 등이 알려져 있다. 따라서 본 연구에서는 정착에 관여하는 요소분해효소 유전자인 ureA, ureB 및 ureI와 질병인자중 염증반응, 십이지장 궤양 및 위선암과 관련이 있는 cagA 유전자를 선택하여 ESHHT 및 CRTA성분에 의한 유전자발현의 변화를 보고자 하였다. 균의 성장에 영향을 주지 않는 것으로 확인된 ESHHT 50 μg/mL와 CRTA 10 μg/mL 농도로 함유하는 조건에서 각각 H. pylori ATCC 700392를 액체 배양하고 Hybrid-RTM (GeneAll, 서울) kit을 사용하여 total RNA를 분리 후 cDNA를 합성하였다. 이 cDNA를 template로 ESHHT 및 CRTA 존재시 H. pylori 의 대표적인 병인 유전자인 cagA, ureA, ureB 및 ureI유전자 발현의 변화를 qRT-PCR 반응을 실시하여 ddCt 법으로 결과를 분석하여 비교하였으며 1.5배 이상의 차이를 유의적인 발현 억제로 판단하였다. 그 결과 ESHHT의 경우 정착인자인 요소분해효소 관련 유전자 발현은 대조군과 비교하여 차이가 없었으나 질병유전자중 염증관련 유전자 cagA의 발현이 대조군과 비교하였을 때 6.91 배 정도 억제된 것을 확인하였다. 또한 CRTA 성분의 경우 약 20 배 정도 cagA 유전자의 발현을 억제함을 확인할 수 있었다(Table IV). 즉 ESHHT 및 CRTA 성분이 H. pylori의 질병 유전자인 cagA의 발현을 현저히 억제함을 확인하였으며 이는 위염 및 위궤양 치료제로서 개발 가능성을 보여주는 결과로 사료되며 추후 세포배양실험을 실시하여 이러한 in vitro 실험 결과를 확인할 필요가 있는 것으로 판단된다. 한편 CRTA 성분의 경우 요소분해효소 관련 유전자중 하나인 ureA의 발현을 약 2배 정도 억제하는 것이 확인되었다.

요소분해효소 활성 억제 − qRT-PCR 결과 ureA유전자 발현을 약 2배 정도 억제하는 것으로 확인된 CRTA 성분의 효과를 단백질 수준에서 확인하기 위하여 urease assay를 실시하였다. 그 결과 정상배양한 H. pylori의 효소활성을 100%로 하였을 때 CRTA 10 μg/mL 함유한 배지에서 배양한 H. pylori의 경우 약 85±0.34% 정도의 효소 활성이 유지됨을 확인하였다(Fig. 1).이는 요소분해효소 자체가 H. pylori가 합성하는 단백질 중 가장 많이 만들어 지는 단백질이며 따라서 RNA 합성이 2배 정도 억제되었어도 소량의 단백질을 갖고 실험한 효소 활성 실험에서 효소 활성의 차이는 크게 없는 것을 알 수 있었다.

Table IV.cysS was used as a house keeping gene Relative values were calculated by equation 2-ddCt Repression was defined as ≥ 1.5-fold decrease in the expression of the gene

Fig. 1.Inhibitory effect of CRTA on the urease activity of H. pylori ATCC 700392 (H. pylori 26695). control: H. pylori ATCC 700392 was cultured without CRTA, CRTA: H. pylori ATCC 700392 was cultured with 10 μg/mL of CRTA.

최근 항생제 내성 세균의 증가와 치료 약물에 대한 환자의 부적응 등에 따른 치료 실패는 임상에서 헬리코박터 치료에 어려움을 가중시키고 있으며 따라서 새로운 치료법이 절실히 요구되고 있다. 이러한 현실에서 새로운 항헬리코박터 효과를 나타내는 약물을 천연물에서 찾고자 하는 노력들이 활발하게 이루어지고 있다.11-13,24)본 연구에서 사용한 소함흉탕은 흉복통(심하부 긴장압통), 급성 기관지염(폐렴, 늑막염, 늑간신경통)등에 사용되었으며 황련은 진정, 소염, 항균 등의 효능이 있어 소화불량, 위염, 장염, 복통, 구토, 이질등에 사용되어왔던 약제이다.14-19)특히 황련의 경우 몇몇 세균에 대한 항균력이 우수함이 보고되었으나25,26)Helicbacter pylori에 대한 항균 효과등에 관한 연구는 활발하지 않은 것으로 조사되었다.13)따라서 본 연구는 이러한 면에서 소함흉탕 및 황련알칼로이드의 새로운 생리활성을 규명한 것으로 가치가 있는 연구 결과로 사료된다. 추후 본 시료를 사용하여 세포 배양 수준에서의 항균 및 항염등의 효과를 확인한다면 천연물 유래 H. pylori 항균물질 및 H. pylori에 기인한 위염, 위궤양 및 십이지장궤양 치료제로서의 개발 가능성이 충분할 것으로 사료된다.

 

결 론

본 연구 결과를 종합해 볼 때 소함흉탕의 에탄올 추출물(ESHHT) 및 황련의 총 알칼로이드(CRTA) 성분은 헬리코박터에 대해 ESHHT는 항균력이 약간 인정되었으며 CRTA는 비교적 유의성이 있는 항균 활성을 나타냄을 알 수 있었다. 한편 이 두 성분은 헬리코박터의 질병인자중 하나인 염증관련 인자 cagA 유전자의 발현을 현저하게 억제함을 확인하였으며 따라서 천연물 유래 H. pylori 항균물질 및 H. pylori 에 기인한 위염, 위궤양 및 십이지장궤양 치료제로서의 개발 가능성이 있음을 확인하였다.