Analysis of Phoxim Residue in Animal Food Production (Cattle and Pig) by LC/ESI-MS/MS

LC/ESI-MS/MS를 이용한 식육(소, 돼지)중 잔류 phoxim 분석

Abstract

Phoxim, which is one of veterinary drugs, is a well-known antiparasitic agent in wide use. In this paper, phoxim was extracted from cattle and pig tissue using solid-phase extraction (SPE) employing a silica cartridge with acetonitrile. Liquid chromatography/electrospray ionization-tandem mass spectrometry (LC/ESI-MS/MS) for the analysis of phoxim from animal tissue was presented. Phoxim was detected on a $C_{18}$ column ($2.1{\times}100\;mm$, $3.5\;{\mu}m$) using a mobile phase of 0.1% formic acid in water and acetonitrile. A linear correlation observed in the calibration curves for cattle (0.0048~2.0 mg/kg) and pig (0.0055~2.0 mg/kg) showed above $r^2$=0.995. Accuracy measured at concentrations ranging from 0.0048 to 0.2 mg/kg was the range of 68.2~106.9%. Limit of detection (LOD) and limit of quantitation (LOQ) were the range of 0.0014~0.0017 mg/kg and 0.0048~0.0055 mg/kg, respectively. The precision (RSD%) was below 11.2%.

폭심(phoxim)은 널리 사용되고 있는 구충제인 동물용의약품이다. 본 논문에서는 소와 돼지 근육에 잔류하는 폭심을 분석하기 위해서, 실리카 고체상과 아세토니트릴을 사용하여 추출/정제하였다. 분석을 위해서 LC/ESI-MS/MS 방법이 사용되었다. HPLC에서 $C_{18}$ 컬럼($2.1{\times}100\;mm$, $3.5\;{\mu}m$)이 사용되었으며, 이동상으로는 0.1% formic acid와 물이 사용되었다. 소(0.0048~2.0 mg/kg)와 돼지(0.0055~2.0 mg/kg)에 소량첨가하여 얻은 검정곡선은 좋은 직선성($r^2$=0.995)을 나타내었다. 소와 돼지의 매트릭스에 대해서 0.0048~0.2 mg/kg범위에서 68.2~106.9%의 정확도를 나타내었으며, LOD는 0.0014~0.0017 mg/kg, LOQ는 0.0048~0.0055 mg/kg범위에 있었으며, 11.2%의 상대표준편차를 나타내었다.

서 론

최근 국민 식생활 중 축산식품의 비중이 급속히 증가함에 따라 축산물의 생산성 향상을 목적으로 한 과밀사육에서 질병예방 및 치료를 위해 항균성 물질을 포함한 많은 동물용 의약품들이 사용되고 있다. 현대의 축산업에 있어서, 항균성물질의 사용은 불가결한 생산자재가 되고 있으나, 사용된 항균성물질의 축수산물 중으로의 이행, 잔류가 식품위생상 우려가 되고 있다. 이로 인해 축산식품 중 존재할 수 있는 잔류 동물용의약품에 대한 국민의 관심도 커지고 있다.1-2

미국, EU, 일본등에서는 동물용의약품 잔류허용기준을 설정하여 관리하고 있으며, clenbuterol, nitrofuran, carbadox 등 물질에 대해 식품 중 불검출 물질로 목록화하여 엄격하게 관리하고 있다.

우리나라에서도 축산 식품 중 잔류수의약품에 의한 국민 건강상 위해 발생 가능성을 사전에 차단하기 위해서 우육, 돈육, 계육, 양육 등 대부분의 식육에 대한 항생물질, 합성항균제 및 성장호르몬제의 잔류허용기준을 설정하여 관리하고 있으며 동물용의약품의 잔류허용기준 설정을 내부적으로 관련기관의 협의를 거쳐 검토하고 있으며,3-6 폭심의 최대잔류허용치(Maximum Residue Limit; MRL)는 Table 1과 같다.

그러나 최근, 2009년 말 기준으로 국내에 제조·수입 품목 허가된 동물용 의약품은 총 180개 성분으로 이 중 79개 성분이 잔류허용기준 및 시험방법이 없음에도 시판·사용되는 사례가 발생하면서 위험성이 높아지고 있다.

동물용 의약품인 폭심(phoxim)은 유기인계화합물(Organophosphorus Pesticides, OPs)로서 구충제 및 살충제로 잘 알려져 있다(Fig. 1). 일반적인 살충제들보다 강력하고 광범위하게 빠르게 분해되기 때문에 많이 쓰이고 있는데, 이물질은 사람과 가축에 대한 독성이 강하고 지속성이 적어 많은 양의사용을 필요로 한다. 이로 인해 효소의 작용을 저해하고 돌연변이 및 암을 유발할 수 있을 뿐 아니라 내분비교란을 일으킨다.

Table 1.Maximum Residue Limits (MRLs) in cattle, pig, lamb and goat of South Korea

Fig. 1.Chemical structure of Phoxim.

국내의 식품공전(2010)에는 잔류 동물용 의약품 시험법이 제시되어 있는데, 폭심의 시험법 적용이 과실류, 채소류, 곡류, 콩류에 한하여 있다. 다른 논문에서도 알류 등에 대한 시험법이 제시되어 있으나 식육 중에서 폭심의 분석방법은 연구되어있지 않다.7-12

크로마토그래피/질량분석법을 비롯한 화학분석에 있어서 매트릭스(matrix) 효과는 정량에 있어서 많은 영향을 미치고 있다. 매트릭스의 종류에 따라서 추출 및 정제 방법이 달라지고, 동일한 추출/정제방법이 사용되었더라도 정량을 위한 검정곡선의 기울기가 달라지며, 정확도, 정밀도, LOD (limit of detection) 및 LOQ (limit of quantitation)에 영향을 미치기 때문에 각 매트릭스별 유효성 검증(method validation)이 필요하다.

따라서 본 논문에서는 축산물(소, 돼지)에 잔류하는 폭심(phoxim)을 LC-MS/MS를 이용하여 감도와 정밀도, 정확도가 좋게 분석하는 방법을 확립하고자 하였다.

 

실 험

시약 및 장비

분석물질인 폭심 표준물질은 Sigma-Aldrich사(St. Louis, MO, USA)의 고순도 시약을 사용하였다. 물, 메탄올, 아세토니트릴, 헥세인, 디클로로메탄 등의 용매는 J. T. Baker사(NJ, USA)의 HPLC 등급 시약을 사용하였으며, formic acids는 Fluka사(Seelze, Germany)의 시약을 사용하였다.

고체상 추출법에 사용한 Silica (6 cc, 500 mg) 카트리지는 Waters사(Milford, Massachusetts, USA)에서 구입하여 사용하였으며, 질소농축기는 Caliper Lifescience사(Seattle, WA, USA)의 TurboVap LV 농축기를 사용하였다. 시료의 여과를 위해 사용한 여과지는 Pall사(Port Washington, NY, USA)의 GHP syringe filter(13 mm, 0.45 μm)를 사용하였으며, 초음파 추출기는 KODO사의 JAC 4020 ultrasonicator (Hwaseong, Korea)를 사용하였다. 실험에 사용한 모든 유리 기구는 세척액, 메탄올, 아세톤 및 3차 증류수로 세척 후 자연건조하여 사용하였다.

본 연구에서는 시료 자동주입기(Agilent 1200 series G1313A Autosampler)가 장착된 Agilent 1200series HPLC (Agilent사, Palo Alto, CA, USA)와 분리된 각 물질의 분자량 확인을 위해 Agilent 6410 Triple-quadrupole 텐뎀질량분석기(Agilent사, Palo Alto, CA, USA)를 사용하였다.

시료 전처리

균질기로 균질화한 시료 5 g을 원심분리관에 취하고 아세토니트릴 20 mL를 가하여 200 rpm으로 20분간 진탕 추출하였다. 원심분리기로 7 ℃에서 5000 rpm으로 5분간 원심분리 후 상층 액을 취한다음 모은 상층 액 40 mL를 250 mL 농축플라스크에 넣어 감압 농축한 후 헥세인 5 mL로 2번 재용해하여 헥세인 10 mL로 활성화된 silica 카트리지(6 cc, 500 mg)에 적재하였다. 적재가 끝난 카트리지에 디클로로메탄 20 mL로 용출하여 40 ℃에서 질소로 농축시킨 후 아세토니트릴 500 μL로 재용해하였다. 이 시료용액을 0.45 μm 여과지를 사용하여 여과한 후 2 mL 갈색 바이알에 옮겨 분석 전까지 -4 ℃ 이하의 냉장고에 보관하고 분석 시 LC/ESI-MS/MS에 10 μL를 주입하여 분석하였다. Fig. 2에 시료 전처리 과정을 도식화하였다.

Fig. 2.Sample preparation procedure of phoxim.

기기분석 조건

식육 중 폭심 분석을 위한 HPLC와 MS/MS의 기기분석 조건을 Table 2에 나타내었다. HPLC에 사용된 칼럼은 Eclipse Plus C18(2.1×100 mm, 3.5 μm; Waters, USA)의 역상 칼럼을 이용하였고, 이동상으로는 0.1% formic acid가 포함된 물(A)과 아세토니트릴(B)을 사용하였다. 기울기 용매를 시용하여 분석시간 0분에서 2분까지 유기용매를 40%~90%로 선형적으로 변화시킨 후 8분동안 90%로 유지하였다. 이후 이동상의 재 평형을 위하여 즉시 유기용매를 40%로 감소시켜 10분간 유지했다. 이동상의 유속은 0.3 mL/min이었으며 시료 주입양은 10 μL이었다.

검출을 위한 MS/MS 분석조건으로 전기분무이온화 (electrospray ionization, ESI) 방식을 선택하였고 양이온(+) 모드에서 MRM (multiple reaction monitoring) 방법을 사용하였다. Capillary voltage는 4 kV, 분무기체(질소)의 온도는 350 ℃, 기체 유량은 8 L/min이었다.

Table 2.HPLC chromatographic conditions and mass spectrometric parameters

검출한계, 정량한계, 회수율 및 검정곡선 실험방법

분석 방법에 대한 유효성 검증을 위해서 검출한계, 정량한계 및 회수율을 결정하고, 검정곡선을 작성하였다. 검출한계(Limit of Detection, LOD)와 정량한계(Limit of Quantitation, LOQ)는 확립된 분석방법으로 시료를 추출하여 LC/ESI-MS/MS로 분석하였다. 분석과정에서 신호대 잡음비(S/N ratio)가 3일 때의 대략적인 농도를 추정한 후, 농도가 검출한계의 1~5배 사이에 드는 시료(n≥7)를 준비하여 측정한 결과로 표준편차 값(σ)를 계산하고, 선형검정곡선을 작성하여 기울기(m)값을 측정한 후 검출한계(LOD)는 3σ/m, 정량한계(LOQ)는 10σ/m로 정하였다.

검정곡선(calibration curve)은 미지 양에 대한 감응을 해석할 수 있도록 아는 양의 분석물질(표준물질)에 대한 감응으로 평가된다. 이를 위해 시료 중 소의 경우 0.0048, 0.025, 0.05, 0.1, 0.15, 0.2 mg/kg의 농도가 되도록 표준물질을 첨가하였고, 돼지의 경우 0.0055, 0.025, 0.05, 0.1, 0.15, 0.2 mg/kg의 농도가 되도록 표준물질을 첨가하여 확립된 시료전처리 과정을 거친 후 LC/ESI-MS/MS 방법으로 분석하여 피크 면적비로 검정곡선을 작성하고, 직선식과 상관계수(r2)를 구하였다.

정확도, 정밀도는 검정곡선의 농도 범위(LOQ, 1/2 MRL, MRL, 2 MRL, 3 MRL, 4 MRL 수준)에서 각각을 구하였다.

 

결과 및 고찰

실험 인자들의 최적화

효율적이면서 최적의 분석을 위해 실험 인자들(카트리지 종류 및 용량, 용출 용매)을 최적화하는 실험을 수행하였다. 소를 대조시료로 사용하였고 전처리 과정을 거친 대조 시료와 전처리과정을 거치지 않고 최종 용매의 양에 표준물을 첨가한 기준 시료와의 비로 절대회수율을 구하여 효율을 비교한 결과는 다음과 같다.

카트리지 종류 및 용량 비교

고체상 추출법(Solid phase extraction, SPE)에서 최적의 흡착제 선택은 분석물질을 시료 중에 존재하는 다른 방해물질보다 더 친밀하게 흡착제에 붙들리게 한다. Sep-Pak silica 카트리지(6 cc, 500 mg; Waters, USA), Sep-Pak Florisil 카트리지(3 cc, 500 mg; Waters, USA), Oasis HLB 카트리지(6 cc, 200 mg; Water, USA)를 사용하여 절대회수율을 비교해보았다.

Silica 카트리지는 극성 흡착제로 탄화수소나 염소, 플루오르가 치환된 탄화수소와 같이 비극성 용매 또는 극성이 덜한 에스테르 및 에테르로부터 분석물질에 주로 사용되며 극성 에스테르, 에테르, 알코올, 아세토니트릴 또는 물과 같은 극성이 더 강한 용매로 용출하는데 silica는 수용성 용매에서 중간 강도의 양이온 교환기로도 사용가능하다.

Florisil 카트리지는 극성, 고 활성, 약한 염기성을 갖는 흡착제로 유기 용매로부터 낮은 극성부터 중간 극성물질의 분석에 사용되며, AOAC 및 EPA의 공식 분석법을 이용한 농약분석을 위해 많이 사용된다.

HLB 카트리지는 모든 화합물을 위한 친수성(hydrophilic)-친유성(lipohilic) 균형 흡착제의 역상 흡착제이다.

폭심 분자 특성을 고려하여 이 세 가지 카트리지로 회수율을 비교하였다(Fig. 3). Silica 카트리지의 경우 절대 회수율이 53.2%로 가장 높았고, HLB는 2.9%, Florisil은 11.8%의 낮은 회수율을 보였다. 이는 HLB와 Florisil 카트리지는 시료 적재 과정에서 분석물질의 대부분이 카트리지에 흡착되지 않고 손실되어 가장 낮은 절대 회수율을 나타내는 것으로 확인되었다. 따라서 비극성 용매인 헥세인으로부터 극성기를 가진 분석물질을 흡착시킬 수 있는 가장 좋은 효율을 보인 silica 카트리지를 선택하였고, 흡착제의 용량에 따라서 회수율에 차이를 보이는지 확인하였다(Fig. 4). 그 결과 silica 카트리지(6 cc, 500 mg)의 경우 57.8%, silica 카트리지(6 cc, 1 g)의 경우 52.3%의 회수율로 크게 차이는 없지만 상대적으로 더 좋은 회수율을 나타낸 카트리지(6 cc, 500 mg)를 선택하였다.

Fig. 3.Comparison of absolute recovery by the cartridge type.

Fig. 4.Comparison of absolute recovery by the cartridge volume.

용출 용매 선택

고체상 추출 단계 중 용출 용매 선택은 분석물질이 흡착제에 머무르는데 영향을 미쳐서 결과적으로는 추출 효율에 영향을 미치게 되며, 용매의 극성도는 용매세기(흡착제로부터 분석물질을 용리시키는 능력)를 결정한다. 정상(normal phase)과 역상(reverse phase)흡착제에 대한 용매세기를 Table 3에 나타내었는데 이는 이상적인 경우이며, 어떤 상황에서는 어떤 용매도 적절하게 그 기능을 수행할 수 없어서 혼합 용매를 사용하기도 한다. 정상 흡착제에서는 용매의 극성도와 용매 세기가 일치하지만 역상 흡착제에서는 그렇지 않다. 실제로 역상 흡착제에 사용되는 일반적인 용매들은 물, 메탄올, 아이소프로판올, 아세토니트릴에 한정되어 있다. 이온교환 흡착제에서는 용매세기가 주요한 영향을 미치지는 않고 pH와 이온세기 (ion strength)가 흡착제에서 분석물질의 머무름과 용리를 지배하는 주요 요소이다. 이와 같이 흡착제의 선택과 더불어 사용될 최적의 용매 선택이 중요하다.

Table 3.Solvent strengths for normal and reversed phase sorbents

Fig. 5.Comparison of absolute recovery by the eluent.

분석물질인 폭심은 극성과 비극성 기를 동시에 가지고 있기 때문에 용출 용매를 헥세인/디클로로메탄(50/50, v/v), 디클로로메탄, 아세토니트릴을 사용하여 절대회수율을 비교함으로써 방해 물질을 제거하고 흡착제로부터 분석물질만을 선택적으로 용리하고자 하였다(Fig. 5).

헥세인/디클로로메탄(50/50, v/v)의 경우 절대 회수율은 27.4%, 디클로로메탄은 65.9%, 아세토니트릴은 27.7%로 극성 물질과 비극성 물질을 모두 녹일 수 있는 디클로로 메탄으로 용출할 경우 더 좋은 회수율을 보였다.

LC/ESI-MS/MS 분석

HPLC의 이동상은 0.1% formic acid가 포함된 물과 아세토니트릴로 C18 칼럼(2.1×100 mm, 3.5 μm; Waters, USA)을 사용하여 분석하였다. 기울기 용리 조건에서 분석 대상 물질(폭심)은 6.0분에서 분리되어 용출되었다.

폭심은 전체 주사 모드(full scan mode)에서 질량 스펙트럼을 확인한 다음 선구 이온(precursor ion)을 선택하여 생성 이온(product ion)을 생성한 후 특성 이온(characteristic ion)을 선택하여 최적의 MRM(Multiple Reaction Monitoring)조건을 확립하였다. 폭심은 양성자 1개가 붙은 [M+H]+가 ESI에서 일반적인 이온화의 형태가 되며, 이를 효율적으로 분석하기 위해 양이온 모드(positive mode)에서 수행하였다. 우선 각각의 전체 주사 모드에서 얻은 질량스펙트럼에서 분자 구조에 양성자 1개가 붙은 [M+H]+ 형태의 유사 분자 이온(pseudo molecular ion)의 생성을 확인하여 이를 선구 이온으로 선택한 후, 최적의 충돌 에너지를 선택하여 생성 이온을 생성하였다. 생성 이온들 중에서 가장 세기가 큰 이온이 정량 이온(quantitation ion)으로 선택되었으며, 차순 크기의 이온들이 확인 이온(confirmation ion)으로 선택되어 정성확인을 하는데 사용되었다. 폭심의 선구 이온은 m/z 299이고, 3 eV의 충돌에너지를 주어 생성된 이온들 중 정량 이온은 m/z 129, 확인 이온은 m/z 77과 m/z 97로 선택하였다(Fig. 6).

Fig. 6.(a) Total ion chromatogram (TIC), (b) ESI full scan spectrum and (c) product ion spectrum of phoxim (precursor ion : m/z 299).

이와 같이, LC/ESI-MS/MS의 MRM(multiple reaction monitoring)를 사용함으로써 매트릭스에 의한 방해효과를 최소화함으로써 분석의 감도를 높일 수 있었다.

유효성 검증

검출한계, 정량한계, 정확도 및 정밀도: 폭심이 잔류하지 않음이 확인된 각 매트릭스(소, 돼지)에에 폭심 표준물질을 소량첨가(spike)한 후 유효성 검증을 실시하였다.

소의 경우, 검출한계(LOD)와 정량한계(LOQ)는 각각 0.0014 mg/kg, 0.0048 mg/kg로 나타났으며 0.0048 mg/kg (LOQ 수준)~0.2 mg/kg (4 MRL 수준)에서 88.4~104.5% (0.0048 mg/kg에서 예외적으로 낮음) 범위의 상대회수율을 나타냄으로써 비교적 좋은 정확도를 보였고 상대표준편차(RSD%)는 6.38.9%로 양호한 정밀한 값을 나타내었다.

돼지의 경우, 검출한계(LOD)와 정량한계(LOQ)는 각각 0.0017 mg/kg, 0.0055 mg/kg로 나타났으며, 0.0055 mg/kg (LOQ 수준)~ 0.2 mg/kg(4 MRL 수준)에서 상대 회수율이 94.8~106.9%를 나타냄으로써 정량범위내에서 정확도가 우수했다. 상대표준편차(RSD%)는 2.4~11.2%로 비교적 정밀한 값을 나타내었다(Table 4).

Table 4.*LOD (Limit of detection) : 3σ/m **LOQ (Limit of quantitation) :10σ/m ***Accuracy (recovery %) = (measured value/spiked value) × 100

검정곡선: 소의 경우 시료 5 g 중 농도가 0.0048, 0.025, 0.05, 0.1, 0.15, 0.2 mg/kg가 되도록 각각 spike 한 후(n=6), LC/ESI-MS/MS로 분석하여 농도 대 면적 값으로 검정곡선을 작성한 결과 y=12,178,875.3602x - 53,111.9276(r2=0.9964)의 직선식을 얻었다.

돼지의 경우, 소와 같은 방식으로 시료 5 g 중 농도가 0.0055, 0.025, 0.05, 0.1, 0.15, 0.2 mg/kg가 되도록 각각 spike 한 후(n=6) LC/ESI-MS/MS로 분석 후 검정곡선을 작성한 결과 y=11,324,405.2203x - 19,700.9949(r2=0.9976)의 직선식을 얻었다.

 

결 론

돼지와 소, 양 등 축산물에 투여하는 구충제 및 살충제로 많이 사용되고 있는 폭심에 대해 LC/ESI-MS/MS를 이용하여 소와 돼지의 근육에서 효과적으로 분석하는 방법을 확립하였다.

소의 경우, 검출한계(LOD)와 정량한계(LOQ)는 각각 0.0014 mg/kg, 0.0048 mg/kg로, 돼지의 경우 검출한계(LOD)와 정량한계(LOQ)는 각각 0.0017 mg/kg, 0.0055 mg/kg로 비교적 낮은 검출한계와 정량한계를 보였다. 상대 회수율을 측정한 결과 소에서는 88.4~104.5% 범위로, 돼지에서는 94.8~106.9% 범위로 비교적 좋은 회수율을 보였다. 두 매트릭스에서 모두 상대표준편차(RSD%)가 11.2% 이하를 나타냄으로써 확립된 실험방법은 좋은 정밀도를 나타내었으며, 정량분석을 위한 검정곡선은 작업구간 이내에서 r2=0.995이상의 좋은 직선성을 나타내었다.