Chard Root-Tissue Based Biosensor for the Determination of Dopamine

근대 뿌리를 이용한 도파민의 정량에 대한 연구

1. 서 론

생체반응에 활성인 효소를 촉매로 사용하여 바이오센서를 제작하는 개념이 1962년 Clark등에 의하여 처음으로 제안되었고,1 1967년에 Updike등은 이에 관한 논문을 발표하였다.2

감응전극(작업전극)에 동물 또는 식물 조직으로부터 추출된 효소를 고정하여도 잘 감응한다는 사실이 알려진 이후 Mascini는 처음으로 동식물 조직을 이용한 전류법 바이오센서를 보고하였는데, 이것은 산소감응 전극에 소의 간조직을 고정시켜서 과산화수소를 정량한 것이었다.3 그 후, Wang등은 버섯, 바나나, 고추냉이 뿌리의 조직을 이용 phenol 유도체를 정량하였고,4 Gunasingham등은 혈액중에 포함된 glucose를,5 Rosa 등은 갯벌이나 키위 속에 잔류하는 유기농약을6 정량하였다. 또한 Conrath 등은 감자를 이용하여 무기인산을,7 Lee 등은 미생물과 dithizone을 이용하여 cyanide와 납을 정량 하였다.8 이와 같이 바이오센서는 유기물뿐만 아니라 무기물의 정량에도 이용되어 왔다.

Dopamine은 인간의 몸에서 신경전달 물질로서 중요한 생물학적 아민으로 알려져 있다. 즉, dopamine은 파킨슨씨 병(Parkinson’s disease)9, 근육 고정(muscular immobility), 신경관 종양(neural crest tumor)10 그리고 마약 중독자의 정신분열적인 행동과 관련이 있다고 보고되었다.11

Dopamine 정량을 위한 바이오센서로서 tyrosinase, catechol oxidase 및 lactase12-13와 같은 순수한 효소로 만든 dopamine 바이오센서와 바나나, 감자, 버섯, 사과, 아보카도 등의 식물조직을 사용한 dopamine 바이오센서가 보고된 바 있다.14-18 Tyrosinase, catechol oxidase 및 lactase 전극은 예외적으로 낮은 특이성(specificity), 낮은 감도, 낮은 재현성을 나타내었으며, 전극의 수명은 3~4일이었다.19-20

식물조직의 세포막은 세포막 속에 들어있는 효소들이 비활성화되는 것을 잘 보호해 주지만 효소가 빠르게 부패됨으로서 감응물질로서의 효용성이 크게 줄어들 수 있다. Tan 및 Chen 등은22 식물조직으로부터 부패과정의 원인을 알아내어 생분해를 시키는 유기물질들을 사전에 제거하는 전처리과정을 수행함으로서 이 문제를 해결하였다. 이들은 전처리한 dopamine센서를 사용한 결과 3개월 이상 동안 센서의 특성을 나타났다고 보고하였다.17,18

Biosensor에 사용되는 dopamine정량의 첫 간행물 중의 하나는 Sidwell과 Rechnitz21에 의해 보고되었는데 흑연가루와 미네럴 oil, 소량의 바나나로 만든 바나나 전극이었다. 바나나에서 polyphenol oxidase 효소는 일반적인 current에서 나타나는 dihydroxy 형태에서 돌아온 quinone을 전기화학적으로 환원시키며 dopamine의 농도에 직선으로 비례한다.

Caruso 등22은 Cara(Dioscorea bulbifera) 뿌리로부터 추출한 polyphenol oxidase를 이용하여 dopamine을 정량하였다. Pravda 등23은 고성능 액체크로마토그래피(HPLC)의 전기화학적 검출기로서 유리질 탄소전극과 tyrosinase를 고정한 고체 탄소 반죽 전극 (SCPE)을 이용하여 dopamine을 정량하여 두 전극을 비교하였다. 검출기의 안정성과 선택성은 이동상의 pH에 크게 영향을 받는다는 것을 알았다.

최근 Karina 등은 서양호박(zucchini)의 추출물을 이용하여 dopamine을 정량할 수 있는 방법을 보고하였으며 검출한계는 2.6×10-5 M임을 보고하였다.24

본 연구에서는 아직까지 보고된 바 없는 근대 뿌리조직을 이용한 dopamine 센서의 전기화학적 특성을 알아보고자 한다.

 

재료 및 방법

기기 및 시약

본 실험은 20 mL들이의 부피를 갖는 BAS Model VC-2 Voltammetric cell을 사용하였다. 이 cell에 구멍뚫린 teflon 마개로 막은 다음 작업전극, 기준전극으로 Ag/AgCl (Model Re-1 BAS) 및 백금 보조전극을 마개에 구멍에 고정하며 Fig. 1와 같다. 일정전압에서 전류 측정은 EG&G Princeton Applied Research Model 264A Sacanning Potentiostat를 사용하였으며, Kipp & Zonnen recorder를 사용하였다. 마이크로 피펫(100 μL)은 Gilson 사의 것을 사용하였다. Graphite powder는 Kanto Chemical Co. Inc. 제품을, 완충용액을 만드는데 사용한 KH2PO4 및 K2HPO4는 Shinyo 사의 시약을, 기질로 사용한 dopamine은 Aldrich 사의 제품을 사용하였다. 전극을 제작하는데 사용된 mineral oil, ferrocene 및 chloroform은 Aldrich 사의 제품을 사용하였다. 방해물질의 효과를 알기 위하여 사용된 ascorbic acid은 화공순약공업주식회사의 제품을, glucose는 순정화학주식회사(일본)제품, potassium tartrate, sodium bicarbonate, glycine은 임순약공업주식회사(일본, GR)제품을, urea는 Osaka Hayashi Pure Chemical Industries Ltd., Japan 제품을 사용하였다. 전극제작에 사용된 근대 뿌리는 충북대학교 사범대학 건물의 주변 밭에서 재배한 것을 사용하였으며, 4 ℃ 이하로 유지된 냉장고에 깨끗이 씻은 상태로 밀폐시켜 보관하면서 필요시 사용하였다. 완충용액은 pH는 0.050 M KH2PO4 용액과 0.050M K2HPO4 용액의 부피비를 적절히 조합하여 결정하였으며, 완충용액의 pH 측정을 위하여 digital pH/ion meter(Model DP-215)가 사용되었다. 모든 용액은 증류수를 이용하여 제조되었으며, 항상 실험 직전에 새로 만들어 사용하였다.

Fig. 1.Curremt-time recordings obtained at (a) 9% ferrocene modified carbon paste electrode, (b) 40% chard root tissue modified carbon paste electrode, (c) 40% chard root tissue and 9% ferrocene modified carbon paste electrode on increasing the dopamine substrate concentration. Successive increments of 0.010 M dopamine. Operating potential, -0.15 V. pH=6.53, 0.010 M phosphate buffer. Stirred 300 rpm.

전극의 제조 및 신호 측정

10%의 근대 뿌리 조직과 9%의 ferrocene을 포함하는 전극의 제조 과정은 다음과 같다. 0.09 g의 ferrocene을 20 mL의 CHCl3에 녹인 후 0.91 g의 graphite powder와 균일하게 혼합시킨 다음 hot plate위에서 용매를 증발시켰다. 혼합물 0.60 g을 취하여 mineral oil 0.40 g과 혼합하여 탄소반죽을 만든 후, 이 반죽 0.110 g에 파쇄한 근대 뿌리 조직 0.055 g을 추가한 후, 완전히 혼합시킨 순수 탄소 반죽이 채워진 직경 6 mm, 길이 70 mm 원통형 유리관 끝 부분 1 mm에 충진시켜 Cu 도선으로 연결하여 제작하였으며 Fig. 2과 같다.

Fig. 2.Variation in current with pH. Other conditions were same as in Fig. 1.

감응전류의 측정은 각각의 명시된 전극전위에서, 10 mL의 인산 완충용액을 포함하고 있는 유리 cell에 0.010M의 dopamine 용액을 20 μL씩 첨가한 후 첨가 전 후의 신호크기를 감응전류로 간주하여 측정하였다. 그리고 전류가 측정되는 동안 시료 용액은 300 rpm의 속도로 저어주었다.

필요에 따라서 근대 뿌리 조직과 ferrocene의 함량을 조절하였고, 제조된 전극을 사용하지 않을 때에는 완충용액에 넣어 4 ℃에 냉장보관 하였으며 모든 실험은 실온에서 측정하였다.

 

결과 및 고찰

본 연구에서 사용한 근대의 뿌리 조직으로 만든 바이오센서의 메커니즘은 다음과 같다.

즉, 전극에 고정된 근대 뿌리에 들어있는 효소인 peroxidase는 dopamine을 dopaminequinone으로 산화시키고, 산화된 peroxidase는 일정전위기(potentiostat)에 의해 다시 dopamine으로 다시 환원된다. 본 연구에서는 이 환원전류를 전류법으로 측정하였다. 한편, 살아있는 조직으로 만든 전극은 순수한 효소로 만든 전극보다 더 오래 사용할 수 있고, 유기체에 존재하는 다른 효소에 의한 간섭이 나타나지 않는 장점이 있다.

근대의 각 조직 부위에 따른 감응전류의 변화를 조사한 결과 줄기(stem), 잎(leaf), 뿌리(root) 순으로 감응도가 증가하였다. 특히 뿌리는 잎보다 3.4배 정도 신호가 크게 나타났으며, 줄기보다는 감도가 약 7배 정도 증가하였다. 따라서 본 연구에서는 dopamine 정량 실험에 뿌리 조직을 사용하였다.

Dopamine의 농도 및 pH에 따른 감응 전류의 변화

Fig. 1은 인산 완충용액 (pH=6.53) 10 mL에 0.010 M의 dopamine 용액 20 μL가 누적적으로 10회 첨가되는 동안에 40%의 근대 뿌리 조직과 9%의 ferrocene을 포함한 전극(c), 40%의 근대 뿌리 조직만을 포함한 전극(b), 9%의 ferrocene만을 포함한 전극(a)의 반응전류 (-0.15V vs. Ag/Agcl)의 변화를 보여주는 전형적인 예이다. Fig. 1(a)에서 계단이 시작되는 곳은 dopamine의 첨가 시점을 나타낸다.

근대 조직을 포함하지 않은 전극 (a)의 경우는 거의 감응을 보이지 않았으며, 근대 뿌리 조직만을 포함한 전극(b)는 (a)에 비하여 감응은 나타났지만 (c) 전극에 비해 좋은 감응이라 할 수 없다. 이것은 dopamine의 감응이 ferrocene보다는 근대 뿌리 조직 속에 들어 있는 효소에 의한 것임을 나타내고 있다. 근대 조직과 ferrocene을 포함한 전극 (c)는 기질의 농도변화에 대해 상당히 좋은 감응을 나타내고 있으며, 수초 이내에 전류의 정류상태를 나타내고 있다.

Fig. 2는 인산완충용액에서 근대 조직 전극의 pH의 존성을 나타낸 실험이다. Tu 등25은 바이오센서의 감응은 주로 pH와 온도에 의해 영향을 받는다고 보고하였다. 이 연구에서는 32 ℃, pH=6.0~8.0의 범위에서 peak current가 나타났다. Chen과 Tan26은 각 센서에 따라 용액의 pH도 달라졌는데, 감자는 pH=6.5, 사과는 pH=5.56, 바나나는 pH=5.56, 버섯(mushroom)은 pH=7.4에서 좋은 감응전류를 나타냈다고 보고하였다.

본 실험에서는 작업 전극의 전위 -0.15 V에서 인산 완충용액(0.050M KH2PO4: 0.050M K2HPO4=8 : 2) pH=6.53에서 가장 좋은 감응전류를 보여주고 있었으며, 이 값보다 높거나 낮은 범위로 갈수록 반응전류 값은 감소하고 있었다. 따라서 본 실험에서 안정적이면서 가장 큰 감응전류를 나타낸 pH=6.53을 선택하였다.

작업 전극의 전위에 대한 감응전류의 변화

Fig. 3은 작업전극의 전위에 대한 전류의 의존도를 보여주고 있다. pH=6.53인 0.010M 인산 완충용액에 0.010 M의 dopamine 용액 20 μL를 넣었을 때 나타난 작업전극의 전류를 측정하였다. 본 연구에서는 작업전극의 전위를 0.00 V에서부터 -0.35 V까지 0.05 V씩 변화시킬 때 -0.15 V의 환원전위에서 가장 큰 감응전류를 보인 후 감소하였다. 따라서 본 실험에서는 감응전류가 높으면서 잡음이 적은 -0.15 V를 작업전위로 선택하였다.

Fig. 3.Dependence of the biocatalytic current on the operating potential. Other conditions were same as in Fig. 1.

근대뿌리 조직의 함량변화에 따른 감응전류의 변화

전극의 감응전류는 조직의 함량변화에 크게 의존하고 있다. 이것은 탄소반죽의 조직함량 변화가 전극의 효소함량 변화를 의미하기 때문이다. 이 때 사용된 탄소반죽 전극은 예비실험을 할 때 9%의 ferrocene을 넣은 전극을 공통적으로 사용하여 실험하였다.

Fig. 4.The effect of the tissue composition on the response the carbon paste electrode. Other conditions were same as in Fig. 1.

본 연구에서는 15%에서 60%의 넓은 범위에서 조사한 결과 Fig. 4에 나타났듯이 40%의 근대 조직을 함유했을 때 가장 좋은 결과를 나타내고 있다. Fig. 4에서 15%에서 40%까지는 전류가 증가하는 것을 볼 수 있는데 이것은 근대 조직의 함량이 증가함에 따라 전극 표면의 노출되는 촉매부위가 증가하는 것으로 볼 수 있으며27, Gunasingham 등은 일정량(여기서는 40%)이상에서 전류가 감소하는 것은 조직함량의 증가에 따른 전극의 전도도 감소로 설명하고 있다.28

Mediator(ferrocene)의 함량의 변화에 따른 감응전류의 변화

Fig. 6은 ferrocene의 함량변화에 따른 감응전류의 변화를 보여주고 있다. pH=6.53인 0.010M 인산 완충용액에 근대 뿌리 조직은 40%로, 측정전위는 -0.15 V(vs. Ag/AgCl), dopamine 용액의 농도는 0.010 M로 고정하였다.

Fig. 1에서 보는 바와 같이 순수한 근대 조직만을 함유했을 때보다는 이동매체인 ferrocene을 함유했을 때 더 좋은 감응전류를 나타내고 있었다. 즉, ferrocene의 함량이 감응전류의 크기에 영향을 미칠 것으로 예상된다. 본 연구에서는 ferrocene의 함량을 3%에서 13%까지 2%씩 변화시키면서 측정해 보았다. 그 결과 예비실험에서와 같이 9%를 함유하였을 때 가장 좋은 감응 전류를 나타내고 있었다. Oungpipat 등은 ferrocene을 첨가하면 근대 조직이 ferrocene에 대하여 더 넓은 접촉면적을 제공하기 때문에 감응전류가 증가한다고 설명하고 있으며29, Senda 등은 이동매체가 다량 첨가될 경우, 이동매체의 농도변화가 탄소반죽 전극의 전도도를 감소시키어 감응전류가 감소하는 것으로, 감응전류가 이동매체의 농도에 의존한다고 하였다.30

Fig. 5.Optimization of mediator concentration in the carbon paste electrode. Other conditions were same as in Fig. 1.

Fig. 6.Carlibration curve for dopamine. Other conditions were same as in Fig. 1.

방해물질의 영향

Table 1은 방해물질의 영향을 살펴보기 위하여, 분석물질에 존재할 경우 실험결과에 영향을 미칠 수 있다고 생각되는 물질 몇 가지를 선택하여 조사한 것이다. Sotomayor 등31의 연구에서 ascorbic acid, uric acid, acetaminophen은 dopamine을 정량할 때 ascorbic acid는 아주 약간의 방해가 나타났으며, uric acid, acetaminophen은 신호의 크기에 영향을 주지 않았다고 보고하였다.

본 실험은 지금까지 알아본 최적의 조건에서 실험하였으며, 0.010 M의 dopamine용액을 먼저 첨가한 후 여기에 0.010 M의 방해물질 용액을 넣어주었다. 조사결과 ascorbic acid, glucose, glycine, potassium tartrate, sodium bicarbonate, urea는 dopamine의 신호크기에 어떠한 영향도 주지 못하고 있었다. 이것은 dopamine을 정량할 때 주위에 이러한 물질이 들어있더라도 영향을 미치지 않으므로 고려하지 않아도 됨을 의미한다.

Table 1.*Each injection changed in [interference] = 1.0×10-2M and [dopamine]=1.0×10-2M **SX,dopamine: Steady-state sensitivity of interference in the presence of dopamine Sdopamine : Steady-state sensitivity of dopamine SX,dopamine/Sdopamine : Relative sensitivity

Dopamine의 정량에서 검정 곡선

Fig. 6에는 dopamine의 정량실험에 대한 검정곡선을 나타내었다. Dopamine의 양이 증가함에 따라 전류도 비례하여 증가함을 알 수 있다. 또한, Fig. 7은 dopamine의 농도 범위, 2×10-5~8×10-5에서의 농도에 대한 감응신호를 나타낸 것이다. 이 농도 범위에서 분석물질의 농도-전류의 직선성이 잘 나타났음을 알 수 있다.

Fig. 7.Calibration curve for dopamine in range of 2×10-5M ~ 8×10-5M of dopamine. Other conditions were same as in Fig. 1.

한편, Fig. 8은 농도와 전류의 역수를 도시한 것으로 상관계수가 0.9985로 좋은 직선성을 나타내었다. Michaelis-Menten 식에 따라 기질농도([S])를 변화시켜 효소반응속도([ν])를 실측하고 Lineweaver-Burk도시를 할 때, 직선성이 얻어지면 이 반응은 효소촉매에 의하여 조절되는 반응이다.29 따라서 Fig. 8의 직선성은 전극의 반응이 촉매에 의해 조절되는 효소반응임을 나타내고 있다. 일반적으로 따라서 근대 뿌리 조직을 사용하여 만든 전극은 dopamine의 농도를 간편하고 정확하게 측정할 수 있다. 최적조건에서 분석시료인 도파민을 가했을 때 신호의 95%가 얻어질 때까지 걸린 시간, t95%는 12 s였으며, dopamine의 검출한계는 3×10-7 M이었다.

Fig. 8.Lineweaver-Burk plot of the same data as in Fig. 9. Other conditions were same as in Fig. 1.

 

결 론

본 연구에서는 근대 뿌리 조직을 탄소 반죽에 고정시킨 바이오센서를 만들어, 수용액에서 dopamine을 정량 할 때의 최적실험 조건을 제시하였다.

전극은 pH=6.53(0.01M 인산 완충용액)에서 가장 좋은 감응을 나타냈고, -0.15 V의 환원전위에서 가장 안정되고 좋은 감응을 나타내었다. 또한, 40%의 근대 뿌리 조직과 9%의 ferrocene을 포함한 전극에서 가장 좋은 감응을 나타내었다.

최적조건에서 분석시료인 도파민을 가했을 때 신호의 95%가 얻어질 때까지 걸린 시간, t95%는 12s였으며, dopamine의 검출한계는 3×10-7 M이었다. 또한 dopamine의 양이 증가함에 따라 전류도 비례하여 증가함을 알 수 있었고, 농도와 전류의 역수를 도시한 결과 좋은 직선성이 나타났다.

근대 조직을 이용한 경우 전극의 우수한 안정성과 감도를 가지는 것으로 나타났으며, 전극을 만들기가 쉽고, 순수한 효소전극에 비해 매우 저렴한 가격으로 만들 수 있어 dopamine의 정량에 유용한 바이오센서이다.

본 연구는 2006학년도 충북대학교 학술연구지원사업 연구비의 지원에 의해 수행되었으며 이에 감사드립니다.