Preparation of Chitosan-Coated Liposome Containing Anticancer Drug and DNA Complex

항암제를 함유한 키토산 코팅 리포솜과 DNA 복합체의 제조

서 론

최근 암의 효과적인 치료를 위한 치료 요법으로서 항암제를 사용한 화학요법과 치료용 유전자를 이용한 유전자요법을 동시에 적용하기 위한 시도가 이루어지고 있다.1,2 화학적 치료요법으로서 항암제를 리포솜이나 나노입자 등의 약물수송체에 봉입하여 송달함으로써 항암제가 정상세포로 이행되는 것을 억제하고 암세포만으로 이행을 촉진시켜 치료효과를 향상시키고 부작용을 억제하는 방법이 활발히 개발되고 있다.3,4 리포솜은 생체막과 유사한 구조를 가짐으로서 생체 친화적이고, 폐쇄이중층 구조로 내부에 친수성 약물을 봉입시킬 수 있는 장점이 있어 친수성 약물을 보다 효과적으로 송달하기 위한 약물수송체로서 폭넓게 활용되고 있다.5,6 그러나 리포솜은 체내 투여 후 간이나 비장에서 세망내피계에 의하여 쉽게 흡수될 뿐만 아니라 혈중에서 단백질의 흡착과 리포솜의 응집 등으로 인한 구조의 불안정성이 문제가 되어 결과적으로 봉입약물이 누출됨으로서 정상세포에 부작용을 나타내는 단점이 있다. 따라서 리포솜 구조의 안정화를 위해 리포솜 표면을 다양한 고분자로 수식하는 연구가 활발히 전개되고 있다.7,8

리포솜은 치료용 유전자 송달을 위한 유용한 운반체로서 활용되고 있다. 일반적으로 유전자 운반계는 retrovirus, adenovirus, 그리고 adeno-associated virus 등의 바이러스계와 양이온성 리포솜과 고분자를 이용하는 비바이러스성 운반계가 이용되어 왔다. 바이러스성 운반계는 유전자의 세포전이(transfection)에는 효율적이나 인체 사용시 안전성에 대한 문제가 제기되어 왔다. 양이온성 리포솜이나 양이온성 고분자는 바이러스성 운반계에 비해 낮은 전이 효율에도 불구하고 안전성이 우수하고 수용체(receptor) 수식으로 표적화된 운반체 제조가 가능하며 많은 양의 생산이 가능한 장점을 갖는 운반계이다. 유전자를 전달하기 위한 일반적인 방법으로서 양이온성 리포솜 및 양이온성 고분자와 유전자간의 정전기적 결합에 의하여 전기적으로 중화된 복합체를 형성하는 연구가 진행 중이다.9,10

항암요법으로서 유전자 요법의 목적은 치료 유전자를 표적세포까지 전달하여 암 세포를 살상하거나 암세포 특이적 면역반응을 유도하여 항종양 효과를 유발하는 것이다.11,12 그러나 아직까지 유전자 요법만으로 암의 사멸을 유도할 수 있는 기술은 확립되어 있지 않고 다른 항암요법과 병행하여 치료효율을 증진시키는 연구가 활발히 진행되고 있다. 따라서 본 연구에서는 항암제와 유전자를 동시에 병소에 전달할 수 있는 리포솜을 전달체로 개발하고자 하였다. 현재까지 양이온성 리포솜을 유전자와 결합시키는 방법은 유전자만을 전달할 수 있는 방법으로서, 리포솜을 구성하고 있는 인지질에 비하여 상대적으로 분자량이 큰 DNA에 의하여 리포솜의 형태가 파괴될 수 있는 단점이 있고 리포솜의 내부에 항암제와 같은 약물을 봉입하는 것이 불가능하다13. 따라서 약물과 유전자를 동시에 전달하기 위해서는 리포솜의 안정성을 향상시켜야 하는 문제점과 DNA를 운반체 표면에 효과적으로 결합시켜야 하는 문제점이 수반된다.

한편, 키토산은 양이온성 염기다당류의 일종으로 일반적으로 자연 상태의 갑각류에서 얻어지는 키틴의 탈아세틸화 정도에 따라 분류된다. 키토산은 세포독성이 적고, 생체적합성이 우수하며, 몸에서 생분해되는 특성이 있어 약물 운반체로 많이 활용되고 있다.14,15 또한, 다가의 양이온성을 갖는 키토산과 유전자의 복합체를 형성하여 유전자를 전달하기 위한 연구가 보고되고 있다.16

본 연구에서는 항암제와 유전자를 동시에 전달하기 위하여 항암제를 리포솜의 내부에 봉입시키고, 리포솜의 안정성을 향상시키고 유전자와의 정전기적 인력에 의해 복합체를 형성할 수 있도록 키토산으로 리포솜의 표면을 개질하였다. 또한 키토산으로 표면개질된 리포솜과 DNA의 복합체를 제조하여 복합체의 특성을 분석하고 인체유래 자궁암 세포주를 대상으로 리포솜/DNA 복합체의 세포 이입효과를 평가하였다.

 

실험방법

시약 및 기기

시약. 리포솜을 제조하기 위한 지질로서 L-α-phosphatidylcholine(soyhydrogenated)(HSPC), Cholesterol(CHOL), 1-α-phosphatidylcholine-1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-n-[methoxy(polyethyleneglycol)-2000](DSPE-mPEG2000), 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphate acid(DPPA)는 Avanti Polar Lipids Inc.(Alabaster, AL, USA)에서 구입하여 사용하였다. 모델 약물로는 독소루비신(doxorubicin, DOX)을 보령제약(주)에서 구입하여 사용하였다. 키토산(저분자량, 점도 20000 cps, 탈아세틸화 80%)은 Sigma Aldrich Inc.(Milwaukee, USA)에서 구입하여 사용하였다. 본 실험에서 사용한 지질과 독소루비신의 화학구조는 Fig. 1에 나타내었다. 그 밖에 실험에 사용한 클로로포름과 메탄올 등은 일급 및 특급시약을 그대로 사용하였다.

Fig. 1.Chemical structure of doxorubicin (A) and various lipids (B, C, D, E).

기기. 리포솜 제조 시 사용된 기기로는 인지질 필름 형성을 위하여 회전증발기(Buchi Rotavapor R-200, Switzerland)를 사용하였고, 리포솜의 입자 크기 조절과 단일 이중막 제조를 위하여 가압압출기(Northern Lipid Ins.)를 사용하였다. 리포솜의 크기 및 표면전하는 입도분석기(ELS-8000, Otuska, Japan)를 사용하여 측정하였다. 약물의 봉입률은 형광분광광도계(Apogent Tech., USA)를 사용하여 측정하였다. DNA의 결합은 mini-gel electrophoresis(SeouLin Biosci. Korea)를 이용하여 확인하였고, ethidium bromide(EtBr)의 형광강도는 형광분광분석계(F-4500, Hitachi, Japan)를 이용하여 측정하였으며, 세포이입 사진은 형광현미경(Ckx41, Olympus, Japan)을 이용하여 촬영하였다.

세포 및 세포배양

리포솜과 DNA복합체의 세포 전달효과를 관찰하기 위하여 자궁암 세포주인 HeLa세포를 Korean Cell Line Bank(KCLB)에서 구입하여 사용하였다. 세포는 5% CO2 존재하의 숙성기에서 Dulbecco’s modified Eagle medium(DMEM) 용액과 소혈장 용액의 혼합 배지로 37 ℃에서 배양하였다.

리포솜의 제조

Table 1.Composition of various liposomal formulations

Table 1은 본 연구에서 리포솜의 제조에 사용된 지질의 종류와 혼합비율을 나타내고 있다. 리포솜은 HSPC, CHOL, DSPE-PEG2000 및 DPPA의 무게비율을 조절하여 수화법에 의하여 제조하였으며 약물은 암모니움 설페이트의 편차에 의한 리모트 로딩 방법으로 봉입하였다.17,18 각각의 제조단계를 간략히 기술하면 다음과 같다. 각각의 지질을 혼합하여 클로로포름/메탄올 혼합 용매에 용해시킨 후, 혼합 용매를 둥근 바닥 플라스크에 넣고, 회전증발기를 이용하여 유기 용매를 증발시켜 지질로 이루어진 얇은 지질필름을 얻었다. 지질막을 250 mM의 암모니움 설페이트 용액으로 수화하였다. 수화과정이 끝난 후, 리포솜의 크기를 성형하기 위하여 100 nm의 공극을 갖는 폴리카보네이트 분리막(Whatman, USA)을 이용하여 가압압출을 하였다. 리포솜 내부에 봉입되지 않은 암모니움설페이트를 제거하기 위하여 4 ℃에서 48시간 동안 막투석 (MWCO 3500, Viskase Co. Illinois, USA)을 실시하였다. 암모니움 설페이트가 봉입된 리포솜용액과 1 mg/ml 독소루비신(17 mmol/ml, 10% w/v sucrose solution)용액을 60 ℃에서 2시간 숙성하여 암모니움셀페이트의 편차에 의하여 독소루비신이 리포솜 내부에 봉입되게 하였다. 숙성 후, 리포솜 내부에 봉입되지 않은 독소루비신을 제거하기 위하여 4 ℃에서 48시간 동안 막투석을 실시하여 독소루비신이 봉입된 리포솜을 제조하였다. 제조되어진 리포솜은 사용하기 전에는 4 ℃에서 보관하였으며, 침전과 응집 등의 현상은 관찰되지 않았다. 한편, 리포솜내부에 봉입된 약물의 봉입효율은 다음 식 (1)에 의하여 계산하였다.

여기서, Cf는 리포솜 제조가 끝난 후, Triton X-100(200 μl, 10% v/v)을 첨가하여 리포솜의 구조를 파괴시킨 후의 측정한 약물의 농도이고, Ci는 리포솜 제조 시, 초기 첨가한 약물의 농도이다.

키토산 코팅

음이온성 인지질인 DPPA를 첨가하여 리포솜 표면에 음전하를 도입한 후, 음이온성 리포솜 용액과 키토산 용액을 혼합하여 정전기적인 이온결합을 유도하였다. 키토산용액의 농도는 0.10, 0.25 그리고 0.50%(w/v)로서 상온에서 반응을 진행하였고, 리포솜에 결합되지 않은 키토산은 원심분리를(19000×g, 40분)하여 제거하였다. 한편, 음이온성 리포솜의 표면에 키토산의 코팅은 입자의 크기 변화와 표면전하를 측정하여 판단하였다.

DNA 정제

녹색 형광 단백질(GFP)을 발현하는 plasmid DNA(pcDNA-GFP)는 Qiagen mega kit(Qiagen, CA, USA)를 사용하여 정제하였다. Plasmid DNA의 정량은 최대 흡수파장 260 nm에서 UV-spectrophotometer를 사용하여 정량하였다. DNA는 0.8% 아가로스 겔을 이용하여 전기영동법에 의하여 확인하였다.

DNA 결합

키토산이 코팅된 리포솜과 DNA의 결합을 관찰하기 위하여 전기영동법과 형광측정법을 사용하였다. 1 μg/μl 농도로 제조한 DNA 용액 1μl와 키토산으로 코팅된 리포솜 용액 0.25, 0.5, 1.0, 2.0, 4.0, 8.0 16.0 및 35.0 μl를 각각 혼합한 후, 3차 증류수를 이용하여 최종부피가 200 μl가 되도록 한 후, 복합체가 형성될 수 있도록 혼합용액을 상온에서 30분간 숙성하였다. 0.8% 아가로스 겔에 복합체가 분산되어 있는 용액 30 μl를 100 V에서 20분간 전기영동을 실시한 후, 아가로스 겔에 UV를 조사하여 겔의 흐름을 확인하였다. 또한 리포솜/DNA 복합체 용액에 10 μg/μl농도의 EtBr을 첨가하여 상온에서 30분간 숙성하여 염색반응을 실시한 후, 형광광도계를 사용하여 흡수파장 510 nm, 방출파장 590 nm에서 형광강도를 측정하였다.

리포솜의 세포이입

1×105의 HeLa세포를 12-well plate에서 DMEM 배지를 이용하여 배양한 후, 리포솜/DNA 복합체를 HeLa 세포와 함께 CO2 숙성기에서 24시간 숙성하였다. 숙성 후, 형광사진을 촬영하여 리포솜의 세포 이입효과를 관찰하였다.

 

결과 및 고찰

리포솜의 특성

페쇄이중층 구조의 내부에 항암제인 독소루비신을 함유하면서 유전자와 전기적 중성복합체를 형성할 수 있는 리포솜을 제조하기 위하여 먼저 표면전하가 음이 온성인 리포솜을 제조하였으며 음이온성 지질인 DPPA의 양에 따른 항암제의 봉입율 변화를 관찰하였다.Table 1에 제시한 바와 같이, 약물의 봉입율은 70-80%였으며 음이온성 지질인 DPPA의 양에 의존하지 않았다. 이러한 결과는 독소루비신의 리포솜 내부로의 이행이 지질 이중층의 내부와 외부간의 암모늄 설페이트 이온의 농도차에만 의존하여 이루어지기 때문인 것으로 해석된다. 중성의 지질로 구성된 리포솜에 음이 온성 지질의 첨가에 의한 리포솜 입자의 크기 변화와 표면전하의 변화를 광산란법에 의한 입도 및 표면전하 분석기를 이용하여 측정하였고 그 결과를 Fig. 2에 나타내었다. 음이온성 지질인 DPPA가 첨가되지 않은 중성의 리포솜의 입자의 크기와 표면전하가 각각 120 nm와 0 mV인 반면, DPPA의 첨가에 의해 리포솜의 입자 크기는 170±10 nm로 증가하였고, 표면전하는 음의 값을 나타내었다. 리포솜의 표면전하가 음이온성 지질인 DPPA를 첨가함에 따라 음의 값으로 감소하는 결과는 표면전하가 음이온성인 리포솜의 제조에 효과적임을 나타낸다. 한편, DPPA의 농도가 3.18 mg/ml이상에서는 리포솜 입자의 크기가 증가되지 않았고, 표면전하 값은 감소하는 경향을 나타내었다. DPPA가 일정농도 이상으로 첨가되었을 때 리포솜 입자의 크기가 변화하지 않는 것은 리포솜의 지질이중층 구조 형성에 DPPA가 포화된 상태로 참여하기 때문이고, 표면전하가 감소하는 경향은 지질 이중층 구조 형성에 다른 지질에 비해 DPPA가 상대적으로 높은 비율로 참여하기 때문으로 생각된다. 리포솜의 입자 크기는 리포솜을 체내에 정맥 투여할 경우 간이나 비장에서의 흡수를 결정하는 중요한 인자로서 100-250 nm 범위의 입자 크기를 갖는 리포솜은 체내순환의 연장에 있어서 중요하다.5 본 연구에서 제조된 리포솜은 체내투여시 간이나 비장에서의 흡수를 회피할 수 있는 적절한 크기를 유지하고 있음을 확인할 수 있었다. 일반적인 리포솜은 체내 투여 시 구조적으로 불안정해질 수 있고 따라서 병소 이외의 부위에서 방출된 약물이 정상세포를 손상시키는 부작용을 나타낸다. 본 연구에서는 항암약물을 봉입한 리포솜의 안정성을 향상시키고 리포솜의 표면에 양이온성을 부여함으로써 DNA와 전기적으로 중성인 복합체를 형성하기 위하여 다가의 양이온성 고분자인 키토산으로 리포솜의 표면을 개질하고자 하였다. 따라서 제조된 음이온성 리포솜 중 DPPA가 9.58 mg/ml의 농도로 첨가되어진 표면전하가 가장 음의 값을 나타내는 리포솜4(Liposome 4)를 이용하여 키토산의 코팅 실험을 진행하였다.

Fig. 2.Characteristics of anionic liposomes prepared by incorporation of DPPA. Change of liposome size (A) and zeta potential (B). Data is shown as mean ± SD (n=5).

리포솜 표면에 키토산의 코팅

선행 결과에서 표면전하가 가장 음의 값을 갖는 Liposome 4의 지질 조성비로 제조된 리포솜 입자를 키토산 수용액으로 코팅하고 키토산 농도에 따른 특성변화를 조사하였다. 키토산의 농도를 달리하여 표면처리한 리포솜 입자의 크기 변화를 Fig. 3에 나타내었다. 키토산의 농도가 증가할수록 리포솜 입자의 크기는 비례적으로 증가하였다. 이러한 경향은 키토산이 리포솜의 표면과 전기적 인력에 의해 리포솜 표면에 결합할 뿐만 아니라 키토산 분자가 분자쇄간의 인력에 의해 결합할 수 있기 때문인 것으로 사료된다. 한편, 반응시간에 따른 입자의 크기 변화를 살펴보면 키토산의 농도가 0.5%(w/v)일 때 입자의 크기는 1분 내에 490 nm로 증가하였고 반응시간 1분 이후에는 입자의 크기가 증가하지 않았다. 또한, 0.1%(w/v)의 키토산으로 반응시킬 경우 반응시간 1분 이내에 입자의 크기는 220 nm로 증가하였고, 반응시간 1분 이후 입자의 크기는 증가하지 않았다. 반응시간 1분 이후에 입자의 크기가 더 증가되지 않는 결과로부터 1분 이내에 정전기적 인력에 의해 리포솜에 결합될 수 있는 반응 좌석이 포화됨을 알 수 있었다.

Fig. 3.Change of liposome size as a function of time and chitosan concentration at room temperature. Data is shown as mean ± SD (n=3).

한편, 키토산 표면처리에 의한 리포솜에대한 표면 전하의 변화를 관찰하기 위해 0.1%(w/v)의 키토산 수용액을 이용하여 표면처리한 리포솜의 표면전하 측정 결과를 Fig. 4에 나타내었다. 키토산으로 표면처리 하지 않은 Liposome 4의 지질조성을 갖는 음이온성 리포솜의 표면전하 값이 -50 mV인 반면, 키토산으로 표면처리한 리포솜의 표면전하는 30 mV의 값을 나타났다. 또한 반응시간 1분 이후 표면전하의 변화가 없는 것으로부터 반응시간 1분 이후 더 이상의 키토산이 리포솜 표면에 결합되지 않는 것을 확인 할 수 있었다. 전술한 바와 같이 체내에서 리포솜 입자가 간이나 비장에서 흡수되지 않고 혈액에서 장기간 순환할 수 있는 리포솜 입자의 임계크기는 300 nm 정도이다. 따라서 Liposome 4의 지질조성비를 갖는 음이온성 리포솜을 0.1%(w/v) 농도의 키토산 용액으로 반응시켜 표면개질하는 조건으로 제조된 리포솜을 DNA의 결합 실험에 적용하였다.

Fig. 4.Change of zeta potential of liposomes coated with 0.1% (w/v) chitosan. Data is shown as mean ± SD (n=3).

DNA 결합

리포솜과 DNA의 복합체 형성에서 리포솜 용액과 DNA용액의 최적조성비를 확인하기 위하여 1 μg/μl 농도로 제조한 DNA 용액 1 μl와 키토산 코팅 리포솜 용액을 0.25-35.0 μl의 양으로 변화시켜 혼합한 후, 상온에서 30분간 반응시켜 리포솜/DNA 복합체를 제조하였다. Fig. 5는 키토산 코팅 리포솜 용액의 양에 따른 DNA와의 복합체 형성 거동을 아가로스 겔에 의한 전기영동으로 분석한 결과(A)와 리포솜/DNA 복합체에 EtBr을 첨가한 후, EtBr의 형광 강도의 변화를 측정한 결과(B)를 나타낸다. 대조군으로서 복합체를 형성하지 않은 naked DNA가 전기영동에 의해 이동하는 것에 반하여 리포솜/DNA의 복합체를 형성시킨 시료는 키토산 코팅 리포솜의 양이 증가함에 따라 DNA와 전기적으로 중성인 복합체를 형성하는 것을 확인할 수 있었다. 한편, EtBr을 이용하여 리포솜/DNA 복합체의 형광강도 감소 정도를 측정결과, 키토산 코팅 리포솜의 양이 증가함에 따라 형광강도가 감소하는 결과를 나타내어 키토산 코팅 리포솜과 DNA가 전기적으로 중성인 복합체를 형성함을 확인하였다. 결과적으로, DNA와 리포솜이 1:1(v/v) 이상의 비율로 혼합되었을 때 리포솜과 유전자가 복합체를 형성함을 알 수 있었다. 그러나 1:1(v/v)을 초과하는 비율로 키토산 코팅 리포솜 용액을 사용하는 경우 DNA가 리포솜과의 복합체 형성에 이용되지만 복합체 형성에 참여하지 않는 잉여의 양이온성 리포솜이 많아질수록 과도한 양이온성으로 인해 혈중에서 단백질 흡착 등의 문제를 발생시킬 수 있어서 정맥주사제로서는 부적절하다고 판단된다. 따라서 본 연구에서 키토산 코팅 리포솜과 DNA의 부피비를 1:1(v/v)로 유지하는 것이 최적임을 알 수 있었으며, 이 조건에서 제조된 리포솜/DNA 복합체를 사용하여 세포이입 효과를 관찰하였다.

Fig. 5.Electrophoretic mobility analysis of chitosan-coated liposomes and DNA complexes (A) and fluorescence intencity of EtBr (B). A: the naked DNA and liposome/DNA complexes were incubated for 30 min at room temperature. All samples were run on a 0.8% agarose gel including 10 μl EtBr. Lane DNA: naked DNA. Lane 0.25-32: liposome/DNA complexes prepared by incubating 1 μl DNA with the appropriate amount of liposomes. B: Fluorescence intensity of liposome/DNA complexes in the presence of 10 μg/μl EtBr.

리포솜/DNA 복합체의 세포 이입

Fig. 6.GFP expression after transfection of liposome/DNA complexes in HeLa cells. A: naked DNA. B: Confocal microscopy of GFP expression in HeLa cells.

자궁암 세포주인 HeLa 세포를 이용하여 키토산 코팅 리포솜/DNA 복합체의 세포이입 효과를 관찰하였고 그 결과를 Fig. 6에 나타내었다. 사진(A)는 DNA만을 세포와 숙성시킨 후 촬영한 것으로서 DNA의 세포이입의 결과로 발현되는 GFP의 형광성이 나타나지 않았으며, 이는 DNA 단독으로는 세포이입이 이루어지지 않기 때문이다. 반면, (B)는 키토산 코팅 리포솜과 DNA의 복합체를 세포와 숙성시킨 결과로서, DNA가 HeLa 세포에 이입되어 GFP를 발현하고 있음을 알 수 있었다. 결과적으로, 키토산 코팅 리포솜과 DNA의 전기적 중성복합체가 세포에 이입되는 것을 확인할 수 있었으며, 유전자와 약물을 동시에 함유한 복합체를 리포솜을 중재하여 세포내부로 이입시킬 수 있음을 확인하였다.

 

결 론

본 연구에서는 리포솜 내부에 항암제를 함유함과 동시에 유전자와 복합체를 형성하는 항암제 함유 리포솜/DNA 복합체를 제조하고 물리화학적 특성 분석 및 세포이입 효과를 관찰하였다. 음이온성 지질인DPPA를 함유한 음이온성 리포솜의 입자크기는 평균 170 nm이었고 표면전하 값은 -50 mV였다. 한편 항암제의 로딩율은 음이온성 지질의 함유여부와 관계없이 70-80% 수준을 나타내었다. 리포솜의 안정성 향상과 DNA와의 전기적 중성 복합체 형성을 위해 음이온성 리포솜의 표면을 다가의 양이온성 고분자인 키토산으로 표면개질하여 입자크기가 평균 220 nm, 표면전하 값이 +30 mV인 리포솜을 제조하였다. 리포솜/DNA의 복합체 형성을 전기영동 시험과 EtBr 형광강도 측정 시험으로 확인한 결과, DNA와 키토산 코팅 리포솜의 최적조성비는 1:1(v/v)이었다. 자궁암 세포주인 HeLa세포를 이용한 세포이입성 평가 결과, 리포솜/DNA 복합체는 세포이입에 효과적임을 확인하였다. 따라서 본 연구의 키토산 코팅 리포솜은 항암제와 유전자를 동시에 전달할 수 있는 복합치료용 전달체로서 매우 유용하다고 판단되며, 현재 리포솜/DNA 복합체에 의한 세포이입효율과 세포독성 및 항암 치료 효과에 대한 평가를 진행 중이다.

본 연구는 산업자원부 지능형 나노분말 소재사업으로 이루어진 것으로 이에 감사드립니다.