Stability of Liposomal Nano-Powder with the Addition of Cryoprotectant

동결방지제 첨가에 의한 리포솜 나노분말의 안정성

서 론

리포솜은 1960년대 Bangham et al.1에 의하여 인지질이 수상에서 자발적으로 생체막과 동일한 형태의 이중막으로 형성된다는 사실이 밝혀지면서 여러 가지 용도의 약물에 대한 운반체로서 연구가 진행되어져 오고 있다. 또한 리포솜은 생체 적합성이 매우 우수하며 제법이 간편하고, 수용성 및 지용성 약물을 운반 할 수 있는 장점을 지니고 있으며2-3 막 조성과 표면을 수식하는 물질을 변화시켜 열,4-6 빛7 및 pH8 등의 외부 자극에 의하여 선택적으로 약물의 방출을 제어 할 수 있는 장점이 있다. 이러한 리포솜은 방사선치료나 화학치료를 겸용하여 인체에 적용할 수 있고 체내에서 부작용이 적어 이를 이용한 항암 약물전달체의 연구가 활발히 진행되어지고 있다.9

그러나 기존의 리포솜은 계 자체가 물리화학적으로 불안정하기 때문에 수용액 내에 분산시켜 보관할 때 응집, 융합, 인지질의 가수분해, 산화 및 봉입 약물의 누출 등을 야기 할 수 있는 단점을 지니고 있다. 따라서 리포솜을 장기간 보관 시 리포솜 자체의 안정성을 확보해야 하는 단점이 있다. 이러한 단점을 보완하기 위하여 리포솜의 물리-화학적 불안정성을 극복하기 위한 방법으로서 리포솜을 미세분말화하여 저장함으로서 안정성을 향상시키는 연구가 활발히 진행되어왔다.10 Crowe et al.은 트레할로스 같은 이당류를 리포솜 용액에 첨가하여 동결 건조 하였을 때, 건조된 지질의 상전이온도를 저하시켜 리포솜의 융합, 응집 및 상분리를 억제하여 리포솜이 안정화되는 연구결과를 보고하였다.11

따라서, 본 연구에서는 리포솜의 불안정을 극복하고, 적은 양의 동결방지제를 사용하여 리포솜을 안정화시키기 위한 조건을 검색하였다. 리포솜의 융합, 응집 및 상분리를 방지하는 동결방지제로서는 여러 종류의 사카라이드 유도체와 아미노산 유도체를 리포솜 용액에 첨가하여 사용하였으며, 여러 가지 동결방지제의 첨가에 따른 리포솜 분말의 재분산화에 대한 특성과 리포솜의 안정성을 확보하기 위한 조건을 연구하였다. 한편, 리포솜에 여러 가지 동결방지제를 첨가하여 동결건조 전,후의 입자 크기를 측정하여 미세분말화돤 리포솜이 수용액내에 재분산 되었을 경우의 안정성을 관찰하였다. 또한, 리포솜을 재분산 하였을 경우 동결방지제의 종류에 따른 리포솜 막의 안정성, 응집 방지제의 농도, 보관 온도 및 보관 시간에 따른 입자크기의 변화와 약물의 체류율을 측정하여 리포솜 분말의 재분산화에 따른 물리적 특성을 평가하였다.

 

실험방법

시약 및 기기

시약. 리포솜을 제조하기 위해 사용된 시약으로서 지질의 주성분인 1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine(DPPC), L-α-phosphatidylcholine(soy-hydrogenated)(HSPC), cholesterol(CHOL)은 Avanti Polar Lipids Inc.(Alabaster, AL, USA)에서 구입하여 사용하였다. 모델 약물로 사용된 칼세인과, 리포솜 분말의 안정성을 향상시키기 위하여 사용한 사카라이드 유도체인 말토스, 수크로오스, 글루코사민, 만니톨 그리고 아미노산 유도체인 아르기닌, 아스파틱산 및 히스티딘은 Sigma-Aldrich사(Louis, MO, USA)에서 각각 구입하여 사용하였고, 에탄올과 클로로포름 등의 용매는 모두 일급 또는 특급 시약을 사용하였다.

기기. 리포솜 제조시에 사용된 기기로는 가압 압출기(Northern Lipids Inc.), 회전증발농축기(Buchi Rotavapor R-200, Switzerland), 초음파 발생기(Ultrasonicator, Fisher Scientific, USA)를 사용하였고, 제조되어진 리포솜의 크기는 광산란 장치(ELS-8000, OTUSKA Electronics Inc., Japan)를 사용하여 측정하였다. 리포솜의 정제는 투석 막 장치(Dialysis, MWCO 1,000, Viskase Inc., USA)를 사용하였으며 약물의 체류율은 형광 분광 광도계(Tvon-Spex, Instruments. S.A, Inc)를 사용하여 측정하였다. 리포솜 입자의 동결을 위해 냉동고(Ilshin Lab, Korea)를 사용하였고 리포솜의 분말화는 동결 건조기(Ilshin Lab, Korea)를 사용하였다.

리포솜 입자의 제조

대조군 리포솜과 사카라이드 유도체, 아미노산 유도체가 각각 첨가된 리포솜은 자발적인 자기조립법에 의하여 다음과 같은 과정으로 제조하였다. 모든 경우의 리포솜은 지질의 양을 10 mM로 고정하여 DPPC:HSPC: CHOL을 100:50:30의 몰 조성비로 제조하였고 사카라이드 유도체와 아미노산 유도체의 농도는 1-8 mM(사카라이드/인지질 몰 비율)로 제조하였다(Fig. 1). 대조군 리포솜의 경우, 인지질을 정밀히 달아 클로로포름에 용해시킨 후 회전증발농축기를 사용하여 상전이온도 이상을 유지하면서 감압 증류하여 둥근 플라스크벽에 얇은 지질막을 만들고, 진공상태에서 24 h 건조시켜 둥근 플라스크내에 잔류하는 클로로포름을 완전히 제거하였다. 그 후 10 mM 칼세인 10 ml로 지질막이 완전히 분산될 때까지 수화시켜 리포솜을 제조하였다. 수화를 마친 후, freeze-thaw 과정을 각각 -16 ℃와 55 ℃에서 5분씩 7번 반복하여 실시하였고,12이 용액을 초음파 발생기를 이용하여 4 ℃에서 2분간 초음파를 조사하였다. 리포솜의 크기를 성형하기 위하여 리포솜용액을 가압 압출기를 사용하여 100 nm폴리카보네이트 막을 통과시킨 후 균일한 크기 분포의 리포솜을 획득하였다. 잔류 인지질과 봉입되지 못한 칼세인은 4 ℃에서 2일 동안 막 투석을 실시하여 제거하였다. 막 투석 후, 획득되어진 리포솜 용액에 사카라이드 유도체와 아미노산 유도체를 각각 첨가하여 응집방지제가 포함된 리포솜 용액을 제조하였다.

Fig. 1Molecular structures of (A) saccharides and (B) amino acid derivatives.

리포솜의 입자크기 측정

동결방지제의 종류 및 농도, 온도 그리고 시간에 따른 리포솜의 물리적 안정성에 대한 영향을 관찰하기 위하여 광산란 장치를 이용하여 동결 건조 전, 후에 리포솜 입자의 크기 변화를 관찰하였다. 리포솜 입자의 크기는 리포솜 용액 1 ml에 10-80 mM의 사카라이드와 아미노산 유도체들을 각각 1 ml씩 첨가하여 -77 ℃에서 12 h동안 동결 후 동결건조기에서 -45 ℃의 온도와 5 Pa의 압력을 유지하면서 24 h동안 건조하였다. 건조된 시료에 처음과 동일한 부피인 2 ml의 증류수를 첨가하여 리포솜 분말을 재분산시켜 4 ℃, 25 ℃ 및 37 ℃에서 시간에 따른 동결건조 전과 후의 입자크기 변화를 관찰하였다.

리포솜의 표면 전하 측정

사카라이드 유도체와 아미노산 유도체의 첨가에 대한 리포솜의 표면 전하 특성을 관찰하기 위하여 제타포텐셜을 측정하였다. 리포솜의 표면 전하는 리포솜용액 1 ml에 30 mM의 사카라이드 유도체와 아미노산 유도체를 각각 1 ml씩 첨가하여 25 ℃에서 제타포텐셜 값을 측정하여 비교하였다.

리포솜 입자에 함유된 약물의 체류율 측정

리포솜 입자에 함유된 칼세인의 형광강도는 형광분광광도계를 이용하여 측정하였다. 동결건조 전,후의 리포솜 입자의 형광강도는 25 ℃에서 칼세인의 방출 파장 520 nm, 흡수파장 490 nm에서 측정하였으며 다음의 식 (1)에 의하여 리포솜내의 칼세인의 체류율을 계산하였다.

이때, Fb와 Fb'는 동결건조 전과 후의 리포솜의 형광강도이고, Fa와 Fa'는 동결건조 전과 후 Triton X-100 으로 리포솜을 완전히 파괴한 후의 형광강도이다.13

 

결과 및 고찰

사카라이드 유도체 첨가 방법에 따른 입자크기의 변화

일반적으로 동결 건조 후 미세분말화돤 리포솜을 수용액내에 재분산 시킬 경우, 리포솜 입자는 응집이 일어나면서 뭉침현상이 발생 한다.14 따라서 리포솜을 재분산 시킬 경우 리포솜의 뭉침현상을 방지하기 위하여 동결방지제로 알려져 있는 사카라이드 계열의 유도체를 첨가하여 동결 건조 전,후의 리포솜 입자크기에 미치는 사카라이드 유도체의 영향에 대하여 관찰하였다. Fig. 2는 사카라이드 유도체 중 말토스(3 mM, 말토스/인지질 몰 비율)의 첨가에 대한 리포솜 입자 크기를 나타내고 있다. 대조군 리포솜(A)의 입자 크기는 약 490 nm인 것에 비하여 초기 인지질 혼합시 말토스를 첨가한 리포솜의 크기는 약 2071 nm, 그리고 리포솜을 모두 제조 한 후 말토스를 첨가하고 나서 동결건조 시킨 후 재분산 시킨 리포솜의 크기는 약 103 nm로 관찰되었다. 따라서 동결방지제로 사용한 모든 조건의 사카라이드 유도체와 아미노산 유도체의 첨가는 리포솜의 제조가 완료된 후에 첨가하여 사용하였다.10

Fig. 2The particle size of liposomes with the addition of the saccharide derivatives as a maltose with different preparing manner. A, control liposomes; B, liposomes prepared with the addition of maltose at the hydration procedure; C, liposomes prepared with the addition of maltose after liposome formation.

리포솜 입자의 표면 전하 측정

사카라이드 유도체와 아미노산 유도체가 첨가된 리포솜의 표면 전하는 Table 1에 나타내었다. 30 mM의 사카라이드 유도체와 아미노산 유도체 용액 1 ml을 리포솜 용액 1 ml에 첨가하여 25 ℃에서 제타 포텐셜을 측정하여 표면 전하를 확인하였다. 대조군 리포솜과 사카라이드 유도체가 첨가된 경우 -4.6 mV에서 +3.5 mV로 거의 중성을 나타냄을 관찰할 수 있었고, 아미노산 유도체가 첨가된 경우 산성 아미노산인 아스팔틱산은 +38.3 mV, 염기성 아미노산인 아르기닌과 히스티딘의 경우 -60.4 mV와 -24.5 mV의 값을 각각 나타내었다. 따라서 리포솜에 첨가된 사카라이드 유도체는 중성으로 전하를 가지고 있기 때문에 아미노산 유도체와 비교하였을 경우 리포솜 표면에서 이온결합이 아닌 수소결합으로 고정되어있고 이러한 분자간의 상호작용이 리포솜 입자간의 응집이나 유착 등을 유도하지 않을 것으로 예상되어진다.

Table 1Zeta potential of the mixture of liposome and cryoprotectants.

농도에 따른 입자 크기의 변화

Fig. 3은 분말화된 리포솜을 수용액에 재분산 후의 사카라이드 유도체와 (A) 아미노산 유도체의 (B) 종류 및 농도에 따른 리포솜 입자의 크기 변화를 나타내었다. Fig. 2의 결과를 바탕으로 리포솜 제조 후에 사카라이드 유도체와 아미노산 유도체를 1-8 mM(유도체/인지질 몰 비율)을 첨가하여 재분산 후 입자 크기를 측정하였다. 사카라이드 유도체를 첨가한 리포솜의 경우 (A), 만니톨을 제외한 말토스, 수크로오스 그리고 글루코사민은 100±5 nm의 크기로 사카라이드 유도체를 첨가하지 않은 대조군 리포솜보다 대체로 작은 크기를 나타내는 안정한 리포솜을 얻을 수 있었다. 그러나 사슬 구조를 가지는 만니톨의 특성으로 만니톨의 양이 증가 할수록 인지질 막 표면에서 소수성 결합이 발생하여 불안정한 입자를 형성하였다.15 결과적으로 만니톨은 리포솜을 재분산시켰을 경우, 리포솜 입자간의 응집이나 유착 등을 유도하여 입자의 크기가 증가되었다.

아미노산 유도체를 첨가한 리포솜의 경우(B) 재분산시 전반적으로 아미노산 유도체의 농도가 증가함에 따라 대조군 리포솜에 비해 최대 6배 정도 입자의 크기가 증가되는 것을 관찰하였다. 염기성 아미노산인 아르기닌과 히스티딘의 농도가 각각 4 mM과 5 mM(아미노산/인지질 몰 비율) 일 때 입자의 크기는 각각 800 nm와 1000 nm를 나타냈으며, 산성 아미노산인 아스팔틱산이 첨가된 리포솜의 경우 3 mM 일 때 1400 nm의 입자 크기를 나타냈다. 따라서 아미노산 유도체는 리포솜을 재분산시 리포솜의 안정성에 대하여 기여하는 바가 없다고 판단되었고 이후의 실험에서는 아미노산 유도체의 첨가를 배제 시켰다.

Fig. 3Size changes of the liposomes after freeze-drying in the presence of (A) saccharides or (B) amino acid derivatives.

시간에 따른 입자 크기의 변화

Fig. 4는 재분산 후 리포솜 입자가 가장 안정한 3 mM(사카라이드/인지질 몰 농도) 농도의 사카라이드 유도체를 첨가하였을 경우 37 ℃에서 시간에 따른 리포솜 입자의 크기 변화를 나타낸 것이다. 이당류인 말토스와 수크로오스를 첨가한 리포솜은 30일 동안 대체적으로 입자의 크기 변화가 없이 100 nm를 유지하는 반면, 글루코사민을 첨가한 리포솜은 5일 후부터 입자의 크기가 2.5배정도 증가하였다. 그리고 만니톨을 첨가한 리포솜의 경우 사카라이드 유도체를 첨가하지 않은 대조군 리포솜과 유사한 형태로 입자의 크기가 증가하다가 7일 후 급격히 증가하였다. 리포솜 제조 후에 말토스를 첨가한 경우, 동결 건조 후에 리포솜 입자의 크기 변화가 일정하게 유지되는 이유는 리포솜의 입자 형성이 이미 이루어진 상태에서 말토스를 첨가하였으므로 인지질의 친수성 머리 부분에 이당류의 -CH-, -CH2-이 결합되어 리포솜의 안정성이 향상되었기 때문이다. 또한 동결 건조 전에는 말토스의 -OH-그룹들과 물간의 수소 결합으로 물과 리포솜 입자들 사이에서 수화되어 있는 상태로 존재하게 된다. 또한, 동결 건조 후 재분산할 경우에는 리포솜의 분산 속도보다 말토스의 용해 속도가 더 빨라 동결건조 전의 상태로 빠르게 돌아감으로써 입자의 크기를 안정하게 유지시켜주는 역할을 수행 한다.16 따라서 단당류의 사카라이드 유도체는 리포솜의 안정성에 기여를 하지 못하며, 이당류의 사카라이드 유도체를 사용하는 것이 리포솜의 안정성을 향상 시킬 수 있는 것으로 확인되었다.

Fig. 4Size changes of the liposomes after freeze-drying as a function of time at 37 ℃ (■, control liposomes; ●, maltose; ▲, sucrose; ▼, glucosamine; ◆, mannitol).

온도에 따른 입자 크기의 변화

Fig. 5는 재분산 후 리포솜 입자가 가장 안정한 사카라이드 유도체의 최적의 농도인 3 mM(사카라이드/인지질 몰 농도) 에서 온도에 따른 리포솜 입자의 크기 변화를 나타낸 것이다. 사카라이드 유도체를 첨가하지 않은 대조군의 경우, 재분산 후 4 ℃에서 30일 보관 후 입자의 크기가 약 72 nm에서 1304 nm로 증가하였다. 그러나 이당류인 말토스와 수크로오스를 첨가한 경우 외부의 온도에 무관하게 입자의 크기 변화가 없었으며, 81-92 nm로 유지되는 것을 관찰하였다. 한편, 단당류인 글루코사민의 경우 4 ℃와 25 ℃에서는 비교적 입자의 크기가 90-99 nm로 일정하게 나타났지만 37 ℃에서는 입자의 크기가 300 nm정도로 증가하였고, 만니톨의 경우 30일 후 4 ℃, 25 ℃와 37 ℃에서 입자의 크기가 초기 82 nm에서 각각 226.4 nm, 300 nm 그리고 720 nm로 증가하였다. 단당류의 첨가는 농도와 온도가 증가할수록 입자의 크기가 증가하였으며 리포솜의 안정성을 향상시키지 못하였다. 따라서 리포솜의 안정성을 향상시키기 위하여는 사카라이드 유도체 중 이당류인 말토스와 수크로오스를 리포솜에 첨가하였을 경우 농도와 온도에 관계없이 분말화된 리포솜을 재분산 시켜도 입자의 크기가 변하지 않는다는 것을 확인하였고, 결과로서 이당류 물질인 말토스와 수크로오스가 리포솜 입자를 안정화시키는 조건을 만족함으로서 리포솜을 재분산시 동결방지제로서 적합하다는 것을 확인하였다. 한편, 단당류인 만니톨의 경우 재분산시 이당류에 비해 분산 속도가 느리기에 온도가 증가함에 따라 인지질 막과 결합되는 만니톨의 소수성기의 강화로 입자의 크기가 불안정해진다.15 또한 리포솜 입자간 유착과 응집은 오스트왈드 리페닝(Ostwald ripening)현상에 의해서도 입자의 크기가 증가한 것으로 사료 된다.14

Fig. 5Size changes of the liposomes after freeze-drying as a function of storage temperature for 30 days (□, control liposomes; ▩, maltose; ▤, sucrose; ▦, glucosamine; ▨, mannitol).

사카라이드 유도체의 첨가에 따른 리포솜 내부의 칼세인의 체류율

Fig. 6은 리포솜 용액에 사카라이드 유도체인 말토스, 수크로오스, 글루코사민 및 만니톨을 첨가하여 재분산 후 리포솜 내에 체류되어 있는 칼세인의 체류율을 나타낸 것이다. 이때 사용된 사카라이드의 농도는 각각 1 mM, 3 mM과 6 mM(사카라이드/인지질 몰 비율)로 25 ℃에서 형광분광광도계를 이용하여 측정하였다. 리포솜 용액에 말토스와 수크로오스를 첨가하여 동결건조 하는 동안 동결방지제의 농도에 관계없이 높은 안정성을 보였다. 말토스와 수크로오스가 첨가된 리포솜의 최대 체류율 값은 3 mM에서 각각 99.6%과 84%로 1 mM과 6 mM일때 보다 높은 값을 나타내는 것을 관찰할 수 있었다. 반면 글루코사민과 만니톨의 경우 70% 이하의 값으로 말토스나 수크로오스에 비해 낮은 체류율 값을 나타냈으며 농도가 증가할수록 체류율이 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 이러한 현상은 글루코사민과 만니톨의 소수성 결합의 증가에 기인한 것으로 농도가 증가할수록 인지질 막과 결합되는 단당류의 양이 증가되어 리포솜 입자간의 융합이나 응집을 유도한다고 사료되어진다. 한편, 칼세인의 체류율은 리포솜내부에 봉입되어 있는 약물의 안정성을 예상할 수 있다. 동결건조시 불안정해지는 리포솜 표면의 영향으로 인하여 리포솜 내부에 봉입되어 있는 약물은 리포솜 외부로 방출이 일어난다. 그러나 본 결과로서 동결방지제를 사용함으로서 리포솜 내부에 봉입되어 있는 약물의 체류율이 유지되었고 이러한 결과는 리포솜을 미세분말화 시켜 보존, 유지, 운반하는데 있어 리포솜 자체의 안정성 획득과 내부 봉입된 약물의 효과를 지속 시킬 수 있는 방법이라고 생각된다.

Fig. 6Retention effect of calcein within redispersed liposomes after freeze-drying (■, maltose; ●, sucrose; ▲, glucosamine; ▼, mannitol).

 

결 론

리포솜 용액에 사카라이드 유도체로서 말토스, 수크로오스, 글루코사민 및 만니톨과 아미노산 유도체로서 아르기닌, 아스파틱산 및 히스티딘을 첨가하여 리포솜을 미세분말화 시켜 수용액내에 재분산화시켰을 경우 리포솜의 안정성을 향상시킬 수 있는 동결방지제에 대한 영향을 관찰하였으며, 동결건조 전,후의 리포솜 입자의 안정성을 향상시킬 수 있는 최적의 조건에 대하여 검색하였다. 재분산 전과 후에 사카라이드 유도체의 농도, 온도 및 시간을 변화시켜 관찰한 결과 동결방지제로서 이당류인 말토스와 수크로오스를 첨가한 리포솜의 경우, 37 ℃ 일때 1-8 mM(사카라이드/인지질 몰 비율)의 농도에서 리포솜 입자는 최소 30일간 안정하였다. 한편, 사카라이드 유도체 중 이당류가 첨가된 리포솜 용액의 약물 체류율은 대조군에 비하여 현저하게 증가되었으며 재분산 후에도 약물의 체류율을 유지하였다. 본 결과로서 리포솜을 미세분말화 하여 수용액에 재분산 시킬 경우, 동결방지제로서는 이당류를 첨가하는 것이 리포솜의 안정성을 향상시킬 수 있는 것으로 평가되었다. 또한 동결방지제로 사용된 사카라이드 유도체의 첨가는 리포솜의 재분산성을 우수하게 하였으며, 농도가 8 mM이하로 첨가하였을 때 리포솜의 삼투-탈수 현상과 관련된 문제를 개선할 수 있었다.

본 연구는 과학기술부 기능성 화합물질 개발사업의 지원으로 이루어진 것으로 이에 감사드립니다.