• Journal of Microbiology and Biotechnology
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• 제33권11호
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• pp.1513-1520
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• 2023

Kex2 protease (Kex2p) is a membrane-bound serine protease responsible for the proteolytic maturation of various secretory proteins by cleaving after dibasic residues in the late Golgi network. In this study, we present an application of Kex2p as an alternative endoprotease for the in vitro processing of recombinant fusion proteins produced by the yeast Saccharomyces cerevisiae. The proteins were expressed with a fusion partner connected by a Kex2p cleavage sequence for enhanced expression and easy purification. To avoid in vivo processing of fusion proteins by Kex2p during secretion and to guarantee efficient removal of the fusion partners by in vitro Kex2p processing, P₁', P₂', P₄, and P₃ sites of Kex2p cleavage sites were elaborately manipulated. The general use of Kex2p in recombinant protein production was confirmed using several recombinant proteins.

• 한국식품영양과학회지
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• 제41권4호
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• pp.437-442
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• 2012

홍국쌀 추출물의 항산화 작용을 DPPH radical 및 hydroxyl radical 소거능, 간암 세포에서의 산화적 DNA 손상과 항산화 효소의 유전자 발현에 미치는 영향으로 분석하였다. 홍국쌀 추출물의 DPPH radical 소거능은 ethyl acetate 추출물, methanol 추출물, butanol 추출물 순이었으며, ethyl acetate 추출물의 DPPH radical 소거능은 0.2 mg/mL에서 85%, $IC_{50}$는 0.13 mg/mL로 나타났다. Ethyl acetate 추출물의 hydroxyl radical 소거능을 DCF fluorescence로 측정한 결과, cuvette에서는 2.5 ${\mu}g$/mL에서 44.2%, 5.0 ${\mu}g$/mL 74.1%, 10.0 ${\mu}g$/mL >100%로 나타났고, $HepG_2$ cell에서는 ethyl acetate 추출물로 전처리한 세포의 radical이 $H_2O_2$로만 처리한 세포에 비해 유의적으로 감소하였다. 홍국쌀 ethyl acetate로 전처리한 세포의 DNA 손상이 $H_2O_2$로만 처리한 세포에 비해 유의적으로 낮았으며, 추출물 대신 lovastatin을 처리한 세포는 DNA 손상이 증가하는 것으로 나타났다. 항산화 효소 유전자의 상대적 발현 정도를 측정한 결과, 산화 스트레스 없이 ethyl acetate 추출물로 전처리한 세포에서는 SOD와 GPx가 control에 비해 각각 3.25배, 2.67배 유의적으로 증가하였으며, 추출물로 전처리한 후 산화 스트레스에 노출시킨 세포에서는 CAT가 control에 비해 5 ${\mu}g$/mL에서 4.64배, 10 ${\mu}g$/mL에서 7.0배 유의적으로 증가하였다.

• BMB Reports
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• 제37권3호
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• pp.282-291
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• 2004

Phytases catalyze the release of phosphate from phytic acid. Phytase-producing microorganisms were selected by culturing the soil extracts on agar plates containing phytic acid. Two hundred colonies that exhibited potential phytase activity were selected for further study. The colony showing the highest phytase activity was identified as Aspergillus niger and designated strain 113. The phytase gene from A. niger 113 (phyI1) was isolated, cloned, and characterized. The nucleotide and deduced amino acid sequence identity between phyI1 and phyA from NRRL3135 were 90% and 98%, respectively. The identity between phyI1 and phyA from SK-57 was 89% and 96%. A synthetic phytase gene, phyI1s, was synthesized by successive PCR and transformed into the yeast expression vector carrying a signal peptide that was designed and synthesized using P. pastoris biased codon. For the phytase expression and secretion, the construct was integrated into the genome of P. pastoris by homologous recombination. Over-expressing strains were selected and fermented. It was discovered that ~4.2 g phytase could be purified from one liter of culture fluid. The activity of the resulting phytase was 9.5 U/mg. Due to the heavy glycosylation, the expressed phytase varied in size (120, 95, 85, and 64 kDa), but could be deglycosylated to a homogeneous 64 kDa species. An enzymatic kinetics analysis showed that the phytase had two pH optima (pH 2.0 and pH 5.0) and an optimum temperature of $60^{\circ}C$.

• 생명과학회지
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• 제17권9호통권89호
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• pp.1248-1254
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• 2007

Kluyveromyces marxianus 유래의 exoinulinase (INU1) 분비 서열과 GAL10 promoter를 이용하여 Clostridium thermocellum endoglucanase A gene (celA)의 과발현과 분비 성능 검증연구를 수행하였다. 자체 분비 서열을 가지는 pYEG- CT1 과 INU1 분비 서열을 가지는 pYInu-CT1, 두개의 plasmid는 S. cer-evisiae SEY2102와 S. cerevisiae 2805에 각각 형질전환시켜 ur-acil이 결핍된 배지에서 선별하였다. celA gene 자체 분비 서열보다 INU1 분비 서열을 사용했을 때 발현량과 분비효율은 각각 약 $18{\sim}22%$ 와 11% 향상되었다. 이 중 361 unit/l의 발현율과 89%의 plasmid 안정성, 그리고 70%의 분비효율을 보인 S. cerevisiae 2805/pYinu-CT1 효모 형질전환체를 cellolose를 효과적으로 분해하는 재조합 효모 생균체로 선별하였다. Galactose 배지내에서 S. cerevisiae 2805/ pYInu-CT1의 발효조 회분배양 결과, 총발현량과 분비효율은 각각 418 unit/l 와 73% 로 나타났다. 또한 분비된 endoglucanase A는 분자량 100kDa 이상에서 활성 밴드를 보여, N-linked 당쇄부가에 의해 상당한 비율의 당쇄가 부가됨을 추측할 수 있었다.

• Journal of Microbiology and Biotechnology
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• 제20권11호
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• pp.1563-1570
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• 2010

To construct a highly sensitive detection system for endocrine disruptors (EDs), we have compared the activity of promoters with the n-alkane-inducible cytochrome P450 gene (ALK1), isocitrate lyase gene (ICL1), ribosomal protein S7 gene (RPS7), and the translation elongation factor-1${\alpha}$ gene (TEF1) for the heterologous gene in Yarrowia lipolytica. The promoters were introduced into the upstream of the lacZ or hERa reporter genes, respectively, and the activity was evaluated by ${\beta}$-galactosidase assay for lacZ and Western blot analysis for hER${\alpha}$. The expression analysis revealed that the ALK1 and ICL1 promoters were induced by n-decane and by EtOH, respectively. The constitutive promoter of RPS7 and TEF1 showed mostly a high level of expression in the presence of glucose and glycerol, respectively. In particular, the TEF1 promoter showed the highest ${\beta}$-galactosidase activity and a significant signal by Western blotting with the anti-estrogen receptor, compared with the other promoters. Moreover, the detection system was constructed with promoters linked to the upstream of the expression vector for the hER${\alpha}$ gene transformed into the Y. lipolytica with a chromosome-integrated lacZ reporter gene under the control of estrogen response elements (EREs). It was indicated that a combination of pTEF1p-hER${\alpha}$ and CXAU1-2XERE was the most effective system for the $E_2$-dependent induction of the ${\beta}$-galactosidase activity. This system showed the highest ${\beta}$-galactosidase activity at $10^{-6}\;M\;E_2$, and the activity could be detected at even the concentration of $10^{-10}\;M\;E_2$. As a result, we have constructed a strongly sensitive detection system with Y. lipolitica to evaluate recognized/suspected ED chemicals, such as natural/synthetic hormones, pesticides, and commercial chemicals. The results demonstrate the utility, sensitivity, and reproducibility of the system for identifying and characterizing environmental estrogens.

• 한국미생물·생명공학회지
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• 제17권3호
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• pp.263-268
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• 1989

유전자의 재조합 균주의 생산성을 향상시키기 위한 발효시스템 개발을 목적으로 regulated promoter 인 SUC2 gene 갖는 유전자 재조합 S. cerebisiae를 모델로하여 유전자 산물인 Invertase 발현에 미치는 글루코오스 농도의 영향, 발효 중 플라스미드의 불안정성, 생육특성 및 continuous fed batch system을 연구하였다. 유전자 재조합 균주는 biphasic growth 현상을 보였으며 글루코오스 농도가 0.9g/$\ell$에서 2.2g/L로 증가함에 따라 비증식 속도는 0.224 h$^{-1}$에서 0.226 h$^{-1}$로 증가했으며 숙주효모보다 낮은 값을 나타내었다. 유전자 재조합 균주의 invertase 생산은 발효조내의 글루코오스 농도에 크게 영향을 받아 글루코오스 농도가 0.25~0.4g/L로 감소될 때 invertase 생산이 시작되었으며 회분발효중 플라스미드의 분리는 글루코오스 자화기간 동안에 빈번히 일어났으나 에탄을 자화기간에는 완만해지는 경향을 보였다. 또한 통기를 해주지 않고 배지의 용존산소만으로 배양시킨 결과 통기를 한 경우에 비하여 invertase의 비활성과 총활성이 각각 1.5 및 1.3 배 증가되었다. 균체의 증식단계와 유전자의 발현단계로 구분하여 발효시키기 위하여 영양분을 함유한 글루코오스 용액을 48m1/h(0.096g 글루코오스/48L의 유량으로 12시간 연속적으로 공급하여 fed batch 배양한 결과 invertase의 비활성과 총활성이 비통기적 회분배양 보다 각각 1.74, 2.74배 증가되었다.

• 한국미생물·생명공학회지
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• 제42권2호
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• pp.194-201
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• 2014

본 연구에서는 국내 자생버섯의 일종인 Clitocybe aurantiaca KCTC11143BP 균주가 생산하는 주름개선 화장품 신소재 clitocybin A의 발효생산 최적조건, 추출정제조건, 세포독성 및 자외선 조사에 따른 MMP-1 발현 저해활성을 규명하였다. C. aurantiaca 균주를 5 L 발효조를 이용하여 회분식으로 배양하였을 경우, PD 액체배지보다 YM 액체배지에서 양호하게 생육하는 것을 확인하였다. 300 L 용량의 대형 발효조에서 modified된 YM 배지를 이용한 유가식 배양으로 14일간 배양한 결과, 12.5 kg/120 L의 총 균체량을 얻었다. 발효 추출물로부터 항노화 소재인 clitocybin A를 추출정제를 한 후 HPLC를 실시하여 배양 4일째부터 clitocybin A가 생산되고 있음을 확인하였다. Clitocybin A 화합물의 세포독성을 확인하기 위하여 MTT assay를 실시한 결과, 100 ${\mu}g/ml$ 농도로 처리하였을 경우 $134.6{\pm}10.4%$로 오히려 세포가 증식하여 안전한 소재임을 확인하였다. 반면, 대조군으로 사용한 oleanolic acid는 25 ${\mu}g/ml$ 농도에서도 강한 세포독성을 나타냈다. 또한, clitocybin A는 100 ${\mu}g/ml$ 처리시 33.1%의 MMP-1 발현 저해활성 보여 주름개선 기능성화장품 소재로 매우 우수한 화합물임을 확인하였다.

• 생명과학회지
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• 제19권1호
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• pp.101-110
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• 2009

유전자 발현의 조절은 세포주기 조절에 중요한 역할을 한다. 본 연구에서 새로운 $mas2^+$ (${\underline{m}}itosis$ ${\underline{as}}sociated$ protein) 유전자는 인간의 SMARCAD1와 상동성을 갖고 분열형 효모인 Schizosaccharomyces pombe (S. pombe)에서 gene-specific PCR 방법에 의해서 분리하였다. 분리된 유전자는 SNF2 도메인이 위치해 있고, 이것은 염색체 재구성에 관련되어 있다. $adh1^+$을 이용한 $mas2^+$ 전사체의 발현량 분석은 $mas2^+$의 발현수준은 S. pombe에서 격막 형성 전에 가장 높았다. $mas2^+$ 완전돌연변이의 세포분열은 26와 $35^{\circ}C$에서 지연되는 현상이 보였고, 다수익 다중 격막이나 핵분열이 일어나지 않는 세포들을 발견하였다. 세포들을 완전배지인 YES에서 증식을 증가시키기 위해서 배양했을 때, 정상과 다른 형태의 표현형을 가진 $mas2^+$ 완전돌연변이 세포들이 증가했다. 이런 표현형들은 $mas2^+$ 유전자의 과발현에 의해서 감소하였다. Mas2 단백질은 S. pombe의 핵내에 위치하였다. 이런 결과들은 $mas2^+$가 인간의 SMARCAD1과 상동성을 갖고 있고, 염색체 재구성과 격막 형성 조절에 사용된다는 것을 나타낸다.

• The Plant Pathology Journal
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• 제36권4호
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• pp.323-334
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• 2020

Lysin motif (LysM) proteins are reported to be necessary for the virulence and immune response suppression in many herbaceous plant pathogens, while far less is documented in woody plant pathogens. In this study, we preliminarily characterized the molecular function of a LysM protein LtLysM1 in woody plant pathogen Lasiodiplodia theobromae. Transcriptional profiles revealed that LtLysM1 is highly expressed at infectious stages, especially at 36 and 48 hours post inoculation. Amino acid sequence analyses revealed that LtLysM1 was a putative glycoprotein with 10 predicted N-glycosylation sites and one LysM domain. Pathogenicity tests showed that overexpressed transformants of LtLysM1 displayed increased virulence on grapevine shoots in comparison with that of wild type CSS-01s, and RNAi transformants of LtLysM1 exhibited significantly decreased lesion length when compared with that of wild type CSS-01s. Moreover, LtLysM1 was confirmed to be a secreted protein by a yeast signal peptide trap assay. Transient expression in Nicotiana benthamiana together with protein immunoblotting confirmed that LtLysM1 was an N-glycosylated protein. In contrast to previously reported LysM protein Slp1 and OsCEBiP, LtLysM1 molecule did not interact with itself based on yeast two hybrid and co-immunoprecipitation assays. These results indicate that LtLysM1 is a secreted protein and functions as a critical virulence factor during the disease symptom development in woody plants.

• 한국미생물·생명공학회지
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• 제26권1호
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• pp.61-67
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• 1998

재조합 인간상피세포 성장인자(rhEGF)가 E. coli BL21(pYHB101) 균주를 사용하여 발현되었다. 10g/L glucose를 첨가한 변형된 MBL 배지를 사용하여 10 $\mu\textrm{m}$ IPTG/lactose로 2시간 동안 유도배양한 후 27$^{\circ}C$에서 48시간 동안 배양하였을 때 44.5 mg/L의 rhEGF가 발현되었다. 상기의 결과는 E. coli BL2l(pYHB101)를 사용하여 rhEGF를 발현시 lactose를 IPTG와 동일한 유도 물질로 사용 가능하다는 것을 시사하는 것이다. 회분식 배양에서 glucose를 10 g/L 첨가한 변형된 MBL 배지에 유도물질로 10 $\mu\textrm{m}$ lactose를 사용하였으며 28시간 동안 배양하였을 때 최대 45 mg/L의 rhEGF가 발현되었다. 유가식 배양에서 정지기에 0.5%(w/v) lactose와 0.25%(w/v) yeast extract를 첨가하였을 때 160mg/L의 rhEGF가 발현되었으며 94.3%가 분비되었다. 이에 비하여 유도기에 lactose를 첨가한 경우는 120 mg/L의 rhEGF가 발현되었으며 cytoplasm으로 발현된 불용성 봉입체의 비율은 20.9%에 달하였다. 이것은 lactose의 첨가시기가 E. coli BL2l(pYHB101)로부터 soluble rhEGF의 생성에 중요하다는 것을 확인한 결과이다.