• 한국수정란이식학회지
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• 제32권3호
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• pp.235-241
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• 2017

가축유전자원으로서 흑염소 정액은 가축의 증식 및 유전적 개량을 위하여 동결정액으로서 보존될 필요성이 높으나 아직까지 연구 결과가 많이 누적되어 있지 않은 것으로 판단된다. 국내의 흑염소 동결유전자원의 생산성과 효율성 분석을 위하여 가축유전자원센터에서 보유 중인 흑염소 3 계통을 이용하여 전기자극방법에 의하여 채취된 정자와 정소상체유래 정자를 동결 보존하였다. 동결 전 Triladyl 난황희석액을 이용하여 흑염소의 정액과 혼합하여 $17^{\circ}C$에서 2시간 보존하면 응고현상을 관찰할 수 있었으며 42.9%의 비율로 난황이 변화한다는 것을 육안으로 관찰할 수 있었다. 정장 제거용 배양액으로 전기자극 유래 정자를 세정 후 동결 보존하면 융해 후 정자 생존율이 정액 세정용 배양액 $53.8{\pm}5.2%$로 나타났으며 정소상체 정자는 $74.6{\pm}10.6%$로 유의적으로 높게 관찰되었다. 융해된 정자의 장수성을 $17^{\circ}C$에서 조사해 보면 정소상체 유래 정자가 전기자극 유래 정자보다 우수한 것으로 조사되었다. 그러므로, 염소 동결 유전자원을 보존하는 방법으로 정소상체 정자는 활용성이 인정되며, 염소의 개량과 선발을 위하여 농가에서 활용 가능한 동결정액의 생산과 융해 후 생존성 증진을 위하여 더 많은 동결 보존 연구가 필요하다고 판단된다.

• Clinical and Experimental Reproductive Medicine
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• 제48권2호
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• pp.111-123
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• 2021

Objective: Using domestic cats as a biomedical research model for fertility preservation, the present study aimed to characterize the influences of ovarian tissue encapsulation in biodegradable hydrogel matrix (fibrinogen/thrombin) on resilience to cryopreservation, and static versus non-static culture systems following ovarian tissue encapsulation and cryopreservation on follicle quality. Methods: In experiment I, ovarian tissues (n=21 animals; 567 ovarian fragments) were assigned to controls or hydrogel encapsulation with 5 or 10 mg/mL fibrinogen (5 or 10 FG). Following cryopreservation (slow freezing or vitrification), follicle viability, morphology, density, and key protein phosphorylation were assessed. In experiment II (based on the findings from experiment I), ovarian tissues (n=10 animals; 270 ovarian fragments) were encapsulated with 10 FG, cryopreserved, and in vitro cultured under static or non-static systems for 7 days followed by similar follicle quality assessments. Results: In experiment I, the combination of 10 FG encapsulation/slow freezing led to greater post-thawed follicle quality than in the control group, as shown by follicle viability (66.9%±2.2% vs. 61.5%±3.1%), normal follicle morphology (62.2% ±2.1% vs. 55.2%±3.5%), and the relative band intensity of vascular endothelial growth factor protein phosphorylation (0.58±0.06 vs. 0.42±0.09). Experiment II demonstrated that hydrogel encapsulation promoted follicle survival and maintenance of follicle development regardless of the culture system when compared to fresh controls. Conclusion: These results provide a better understanding of the role of hydrogel encapsulation and culture systems in ovarian tissue cryopreservation and follicle quality outcomes using an animal model, paving the way for optimized approaches to human fertility preservation.

• 한국동물번식학회:학술대회논문집
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• 한국동물번식학회 2001년도 춘계학술발표대회
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• pp.6-6
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• 2001

Oocyte freezing has become a prevalent source for related reproductive technologies. This study was carried out to evaluate viability of post-thawed bovine oocyte injected DTT-treated sperm following by two different activation stimuli (Group 1, 5 M ionomycin, 5 min ＋ CR1aa, 3 h . 1.9 mM dimetylaminopurine (DMP), 3 h; group 2, ionomycin ＋ 10 $\mu\textrm{g}$/$m\ell$ cycloheximide(CHX), 5h). The techniques of ultra-rapid freezing used in this study were essentially similar to those of described by Vajta et al (Theriogenology 1999; 52:939-948), Denuded oocytes at 22 h of culture were exposed to cryoprotectant (3.2 M Ethylene glycol, 2.36 M DMSO, 0.6 M sucrose), and followed by freezing in electron microscopic grid. After thawing the oocytes were transferred back into the drop of maturation medium and cultured for additional 2 h before being subjected to ICSI. All eggs were then cultured in CRlaa medium, and transferred into M199+10% FCS on day 4. The culture was maintained until day 9. In Experiment 1, frozen-ICSI eggs were compared on development into blastocyst to those of unfrozen and IVF control. Those eggs were activated with the method of group 2. A higher proportion of unfrozen-ICSI and IVF eggs developed into cleavage and blastocysts than of frozen-ICSI eggs (65% and 13%; 71% and 23% vs. 39% and 8%; P<0.05). In Experiment 2, development and ploidy of embryos made from group 1 were compared to those from group 2. Between groups there did not differ on the rates of development, however, chromosomal abnormality in group 1 was significantly higher than in group 2 (49% vs. 30%; P<0.05). The present result suggests that frozen bovine oocytes can be used for ICSI.

• ALGAE
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• 제24권4호
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• pp.257-265
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• 2009

Marine microalgae are a key diet component in finfish and shellfish aquaculture. Cryopreservation of the microalgae is suggested by many other studies as the best method for long-term storage. To test cryopreservation efficacy, 19 taxas of marine microalgal species were examined. In the first experiment we compared dimethylsulfoxide ($Me_2SO$) and glycerol, which are most widely used as cryoprotectant agents (CPAs). The cryopreservation comprised two freezing procedures. Firstly, the samples containing the CPAs were kept at $4^{\circ}C$ for 10 min before being plunged into liquid nitrogen ($-196^{\circ}C$). Secondly, samples containing CPAs were pre-cooled ($-1^{\circ}C$ $min^{-1}$ to $-80^{\circ}C$ before being plunged into liquid nitrogen. Most of the species were successfully cryopreserved using $Me_2SO$, whereas the Prasinophyceae (T. striata and T. suecica) were successfully cryopreserved using glycerol. In general, the cooling method had no influence on the survival of the microalgae except in the case of the Tetraselmis species. In the second experiment, the cultured solution was divided before cryopreservation into concentrated and non-concentrated groups to identify the effect of cell density during cryopreservation. After 12 months of storage, the samples were again divided into centrifugation and non-centrifugation groups to learn the effect of $Me_2SO$ on the culture. Viability and growth of the microalgae were not influenced by cell density or the centrifugal removal of the $Me_2SO$ after thawing.

• Molecules and Cells
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• 제26권6호
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• pp.558-565
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• 2008

Although the fertilizing ability of spermatozoa is greatly reduced after freezing, complete understanding of alterations induced by cryopreservation has not been elucidated. The present study evaluates the effects of cryopreservation on the $Ca^{2+}$ handling of boar spermatozoa using several sperm activators. Intracellular $Ca^{2+}$ signals from single spermatozoa were measured using confocal $Ca^{2+}$ imaging of unfrozen samples and of other spermatozoa after having been frozen. Elevation of the external $K^{2+}$ concentration elicited a three times larger $Ca^{2+}$ increase in fresh spermatozoa than in cryopreserved spermatozoa. Caffeine elicited $Ca^{2+}$ transients with some oscillations in the fresh spermatozoa, but not in the thawed spermatozoa. Depletion of the $Ca^{2+}$ store with thapsigargin induced a rapid rise in $Ca^{2+}$ in the control but generated a smaller increase of $Ca^{2+}$ after thawing. Exposure to progesterone induced a biphasic rise of the $Ca^{2+}$ level in the fresh spermatozoa only. Sperm viability was reduced by cryopreservation. Resting $Ca^{2+}$ levels in fresh and cryopreserved spermatozoa were similar. Longer incubation (2.5 h) of thawed spermatozoa partly recovered the $Ca^{2+}$ response to the interventions. These results suggest that cryopreservation reduces the responsiveness of spermatozoa to depolarization, modulators of the internal $Ca^{2+}$ store and progesterone in terms of the $Ca^{2+}$ signal, thus providing a possible mechanism for reduced fertility observed in cryopreserved boar spermatozoa.

• 한국수정란이식학회지
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• 제24권4호
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• pp.275-279
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• 2009

The beneficial effect of glycerol as a cryoprotectant, especially for sperm cryopreservation, has been shown in many studies. However, glycerol is toxic to living cells, and boar sperm in particular show greater sensitivity to glycerol than sperm from other domestic animals. Amides have been studied as alternative cryoprotectants for freezing stallion sperm. Sperm frozen in methylformamide or dimethylformamide as cryoprotectants show similar motility when thawed compared with sperm frozen in glycerol. We evaluated the cryoprotective effects of dimethylformamide on boar sperm freezing. To test the effect of amides, the concentration of boar semen was adjusted to $10^9sperm/mL$, and seminal plasma was removed using Hulsen solution. After centrifugation, the pellet was diluted in modified-Modena B extender. Lactose-egg yolk (LEY) extender was used as the cooling extender. The freezing extender was madeed aaddition of the optimal amount of glycerol and amides to LEY-Glycerol-Orvus ES Paste extender, and this extender was used for the second dilution. Diluted sperm were frozen in liquid nitrogen using the 0.5 mL straw method. Sperm frozen in extender with glycerol as a cderol were compared with those frozen in extender including the different amides. Sperm were tested for motility, viability, the sperm chromatin structure assay, and normal apical ridge after thawing. The percent of motile sperm diluted in glycerol was as high as that in the stallion study (61%). Dimethylformamide showed positive effects on sperm quality and was better than glycerol. Methylformamide provided similar sperm quality as glycerol. Therefore, dimethylformamide is useful for reducing cryoinjury in boar sperm and is expected to be useful as an alternative cryoprotectant.

• 한국가금학회지
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• 제40권3호
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• pp.163-169
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• 2013

가금의 정액 동결 보존은 보고되고 있지만, 큰 난황의 구조 등과 같은 이유로 암컷의 유전물질의 보존은 불가능한 실정이다. 닭에 있어 닭원시생식세포(PGCs)의 동결 보존은 암컷과 수컷 양쪽의 유전물질을 보존할 수 있는 대체 방법이다. 본 연구에서 원시생식선으로부터 분리방법은 5.5일(stage 28 : 5.5일령(Hamburger and Hamilton, 1951)) 동안 발생한 수정란의 초기배자를 실체 현미경하에서 예리한 핀셋을 이용하여 원시생식선 부분만을 분리한 후, MACS 방법으로 정제하였다. 두 개의 상업적으로 사용되는 동결보호제(A와 B)와 10% EG + 15% FBS를 동결보호제로 하는 대조군을 각각 닭 PGCs의 동결 및 융해에 이용하였다. 동결 및 융해 후의 닭 PGCs의 회복율은 A(35.5%), B(60.5%) 그리고 대조군에서는 52.8%를 각각 확인하였다. 52.8%의 닭 PGCs의 회복율을 보인 대조군과 동결보호제 B 처리군 간에는 유의적인 차이를 보이지 않았다. 그러나 두 처리군에 비해 동결보호제 A는 35.5% 유의적으로 낮았다. 하지만, 동결 및 융해 후의 닭 PGCs 생존율은 각각 A(77.9%), B(77.4%) 그리고 대조군(81.6%)으로 보였다. 두 처리구 간에 유의적인 차이는 없었다. 본 연구는 배자 발생 초기의 원시생식선으로부터 채취한 닭 PGCs는 상업적으로 이용되고 있는 동결보호제(A와 B)를 사용해서 동결할 수 있다는 것을 확인했고, 생존율에 나쁜 영향을 주지 않고 액체질소에 성공적으로 보관할 수도 있음을 시사하고 있다.

• Reproductive and Developmental Biology
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• 제36권3호
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• pp.199-206
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• 2012

본 연구에서는 제주마 육성 및 산업화에 있어 성공적인 인공수정을 위한 안정적인 제주마의 동결정액 제조법을 수립하는 데 있어 제주마 동결정액의 제조시 동결보호제로서 glycerol과 ethylene glycol의 사용이 동결-융해 후 정자의 운동성, 생존율, 정자막 온전성 그리고 정자의 첨체막 온전성 등에 미치는 영향을 알아보고자 실시하였다. 제주마 정액의 동결 시 5% glycerol, 5% ethylene glycol, 8% glycerol 그리고 8% ethylene glycol을 사용하였으며, 동결 융해 후 정자의 운동성, 생존율, 정자막 온전성 그리고 첨체의 변화를 측정하였다. 동결 융해 후 정자의 운동성에 있어 실험구 사이의 유의적 차이는 나타나지 않았다. 그러나 생존율에 있어 8% glycerol을 처리하였을 때 가장 높은 생존율 ($39.85%{\pm}11.41$)을 나타냈으나, 5% glycerol 처리구 ($18.08%{\pm}1.61$)와의 비교에서만 유의적 차이를 나타냈다 (p<0.05). 정자막 온전성에 있어서도 8% glycerol 처리구만이 $34.13%{\pm}11.02$로 모든 처리구에 비하여 유의적으로 높은 정자막 온전성을 나타냈다(p<0.05). 동결 융해 후 정자의 첨체막 변화에 있어 8%의 ethylene glycol을 처리시 5% glycerol과 5%의 ethylene glycol을 처리한 실험구보다 유의적으로 높은 F pattern의 비율을 나타냈다. B pattern의 비율은 5% ethylene glycol 처리시 8% glycerol과 8% ethylene glycol 처리구보다 유의적으로 증가하였다. 8% ethylene glycol 처리구에서 유의적으로 낮은 수준의 AR pattern 비율을 나타냈다 (p<0.05). 본 연구의 결과는 현재 확립되지 않은 제주마의 동결정액 제조 과정에 있어 보다 유용한 정보를 제공할 것으로 판단된다.

• 한국가금학회지
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• 제41권4호
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• pp.261-270
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• 2014

동결 닭 PGCs의 생식계열 키메라를 이용한 생체에의 복원을 실용화 하기 위해서는, 닭 PGCs의 동결 보존 기술의 향상에 의해 동결 및 융해 후의 많은 생존 세포를 확보하는 것과, 생식계열 키메라의 제작 효율을 높이는 것이 반드시 필요하다. 닭 PGCs는 배양 5.5~6일령의 닭 원시 생식선으로부터 채취하고, MACS 방법에 의해서 순수 닭 PGCs를 분리했다. 15% 각각의 EG와 DMSO를 동결 보호제로 사용한 처리군이 각 군의 농도에 상관없이 유의적(p<0.05)으로 PG 처리군보다 동결 및 융해 후의 세포의 생존율이 높음을 확인하였다. 특히, 10% EG+FBS 조합의 처리군에서 상업용 닭인 한협육종협회3호종(B : 88.7%)이 오계종(A : 85.1%), 아사 브라운종(C : 84.6%) 그리고 화이트 레그혼종(D : 85.9%)의 세 품종보다 동결 및 융해 후의 닭 PGCs의 생존율이 유의적(p<0.05)으로 높음을 확인하였다. 간이 동결에 있어서 가장 높은 생존율을 보인 10% EG이 10% DMSO와 함께 최적의 동결 보호제로서 사용 가능성을 확인하였다.

• 한국가금학회지
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• 제41권4호
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• pp.249-259
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• 2014

동결 닭 원시 생식 세포의 생식계열 키메라를 이용한 생체에의 복원을 실용화 하기 위해서는, 닭 원시 생식 세포의 동결 보존 기술의 향상에 의해 동결 및 융해 후의 많은 생존세포를 확보하는 것이 반드시 필요하다. 닭 원시 생식 세포는 배양 5.5일령의 닭 원시 생식선으로부터 채취하고, MACS 방법에 의해서 순수 닭 원시 생식 세포를 분리했다. 15% 각각의 EG를 동결 보호제로 사용한 처리군이 각 군의 농도에 상관없이 유의적(p<0.05)으로 PG 처리군보다 동결 및 융해 후의 세포의 생존율이 높음을 확인하였다. 특히, 동결 보호제로 10% EG를 이용한 유리화 처리군에서 85.63%로 동일한 농도의 PG 처리군(66.81%)보다 유의적(p<0.05)으로 가장 높은 생존율을 보였다. 한편, 10% EG를 이용한 완만 동결 처리군에서 66.14%로 동일한 농도의 PG 처리군(50.11%)보다 유의적(p<0.05)으로 가장 높은 생존율을 보였다. 이상의 결과들로부터 유리화 동결에 있어서 가장 높은 생존율을 보인 10% EG이 최적의 동결 보호제로서 사용 가능함을 확인하였고, 이는 한국재래닭(오계)의 원시 생식 세포의 동결 보존의 실용화가 보다 더 향상될 수 있는 또 하나의 방법이 될 수 있음을 시사한다.